Un ensayo para estudiar la regulación de la fagocitosis de los macrófagos por las células madre mesenquimales

Tome una placa de pocillos múltiples con células madre mesenquimales, o MSC, en pocillos seleccionados.

Introducir macrófagos e incubar, facilitando la interacción MSC-macrófagos en los pocillos de cocultivo.

Agregue zimosano, un componente de la pared celular de levadura, conjugado con un fluoróforo sensible al pH en todos los pocillos.

Los receptores carroñeros de macrófagos se unen al zimosano, desencadenando su engullimiento dentro de un fagosoma, que se fusiona con un lisosoma para formar un fagolisosoma.

Un pH ácido dentro del fagolisosoma hace que el fluoróforo emita fluorescencia.

En los pozos de cocultivo, las MSC proyectan nanotubos de túnel, o TNT, extensiones citoplasmáticas que se unen a los macrófagos. Las mitocondrias de MSC viajan a través del TNT para ingresar a los macrófagos, aumentando el número total de mitocondrias funcionales.

Un número mitocondrial elevado aumenta la producción de trifosfato de adenosina o ATP, que alimenta el requerimiento de energía para un aumento de la fagocitosis.

Registre la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo de los zimosanos conjugados con fluoróforos internalizados.

El cocultivo muestra una mayor fluorescencia en comparación con los pocillos con solo macrófagos, lo que indica una mejora mediada por MSC de la fagocitosis de macrófagos.

Aspire suavemente el medio de los pocillos experimentales que contienen células madre mesenquimales. Utilice una micropipeta multicanal para agregar 100 microlitros de las suspensiones de células de macrófagos tratadas y de control en los pocillos experimentales apropiados de acuerdo con el diseño de la placa, e incube durante la noche como se demuestra. Agregue un mililitro de medio de imágenes de células vivas al vial que contiene un miligramo de partículas de zymosan y recoja la mezcla de partículas del medio en un tubo de cultivo de vidrio.

Después de enjuagar el vial con un mililitro adicional de solución de imagen, transfiera el medio de imagen enjuagado en el tubo de vidrio. Luego, agregue 3 mililitros de solución de imagen adicional para lograr una suspensión de partículas de zimosán de 0,2 mg / ml. Agite la suspensión de zymosan usando pulsos rápidos durante 30 a 60 segundos. Luego, use un sonicador de sonda para sonicar la suspensión con 60 pulsos rápidos. Después de aspirar el medio, enjuague los pocillos experimentales en pocillos en blanco de reactivos con 100 microlitros de solución de imágenes de células vivas.

A continuación, aspire la solución de imágenes de células vivas de los pocillos y agregue 100 microlitros de la suspensión de zimosano. Abra la bandeja de placas del lector fluorescente mediante la interfaz del panel táctil. Coloque el plato sin tapa en la bandeja con el pozo A1, en la esquina superior izquierda. Cierre la bandeja con el panel táctil y haga clic en el botón verde "Leer" en el menú superior.