Cuantificación de interferones bioactivos de tipo I mediante un ensayo reportero de fosfatasa alcalina embrionaria secretada

Para cuantificar los interferones bioactivos de tipo I, como el interferón alfa y el interferón beta, en una muestra de prueba, tome una placa de pocillos múltiples que contenga células indicadoras modificadas. Estas células expresan el gen indicador de la fosfatasa alcalina embrionaria secretada, SEAP, bajo el control del promotor inducible de interferón alfa y beta.

Agregue la muestra de prueba que contiene una concentración desconocida de interferón tipo I. Pipetee una variedad de concentraciones de interferón tipo I humano a otros pocillos, que actúan como controles estándar. Incubar.

El interferón tipo I en el pozo de prueba se une a un receptor específico de la superficie celular, activando las quinasas Janus. Estas proteínas quinasas fosforilan transductores de señales y activadores de proteínas de transcripción, STAT, que se dimerizan y forman un complejo con un factor regulador de interferón específico.

Al ingresar al núcleo, el complejo se une a una secuencia de ADN específica en el promotor inducible de interferón alfa y beta, activando la transcripción del gen SEAP y produciendo las enzimas SEAP, que se secretan en el medio.

Transfiera los medios que contienen SEAP a pocillos de placas de pocillos múltiples que tengan un sustrato específico de SEAP. SEAP hidroliza el sustrato rosa, produciendo un producto de color púrpura-azul.

Con un lector de microplacas, mida la absorbancia del producto en los pocillos de prueba y estándar, indicativo de los niveles de SEAP y la concentración de interferón tipo I.

A partir de la curva de interferón tipo I estándar trazada, determine la concentración de interferón tipo I bioactivo en la muestra de prueba.

Para medir el interferón bioactivo tipo I utilizando células reporteras de interferón alfa/beta HEK-Blue, primero, coloque las células reporteras a una densidad de 50.000 células por pocillo en una placa de fondo plano de 96 pocillos a un volumen final de 180 microlitros. Luego, agregue 20 microlitros del sobrenadante de cocultivo recién cosechado a cada pocillo por duplicado. Incluya un conjunto de controles estándar internos e incube la placa a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono durante 18 a 22 horas.

Para determinar los niveles de fosfatasa alcalina liberada por las celdas indicadoras, agregue 180 microlitros de solución QUANTI-Blue a cada pocillo de una nueva placa de fondo plano. Luego, agregue 20 microlitros de los sobrenadantes de células alfa / beta de interferón azul HEK inducidos a cada pocillo e incube la placa a 37 grados Celsius hasta que se desarrolle color en los pocillos de control de interferón estándar.

La solución QUANTI-Blue cambia de rosa a azul púrpura en presencia de la enzima. Finalmente, use un espectrofotómetro para evaluar los niveles de fosfatasa alcalina secretada a 620 a 655 nanómetros y determine la concentración de interferón tipo I por extrapolación de la parte lineal de la curva estándar de interferón.