Un método basado en inmunofluorescencia para cuantificar el estrés de replicación en células cancerosas

Comience con las células cancerosas portadoras de IdU, un sustituto sintético del nucleótido de timidina, ya integrado en su ADN. Cuando estas células se encuentran con estrés de replicación, su síntesis de ADN se detiene, revelando IdU dentro de las regiones de ADN monocatenario expuestas.

Fije las células y agregue moléculas de detergente para que la membrana celular sea permeable.

Agregue BSA para bloquear los sitios de unión de anticuerpos no objetivo.

Introducir anticuerpos anti-IdU que interactúen con el ADN monocatenario marcado con IdU.

Agregue anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo verde que se dirijan a los anticuerpos anti-IdU. Retire los anticuerpos no unidos.

Coloque el cubreobjetos en un portaobjetos que contenga un medio de montaje con un tinte fluorescente, que tiñe los núcleos.

Bajo un microscopio de fluorescencia, observe los núcleos azules.

Los focos de fluorescencia verde representan anticuerpos que se unen al ADN monocatenario.

Cuente el número de focos para cuantificar el nivel de estrés de replicación.

Agregue 1 mililitro de suspensión celular en cubreobjetos de poli-L-lisina colocados en los pocillos de una placa de 24 pocillos y haga crecer las cél