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Comience con las células cancerosas portadoras de IdU, un sustituto sintético del nucleótido de timidina, ya integrado en su ADN. Cuando estas células se encuentran con estrés de replicación, su síntesis de ADN se detiene, revelando IdU dentro de las regiones de ADN monocatenario expuestas.
Fije las células y agregue moléculas de detergente para que la membrana celular sea permeable.
Agregue BSA para bloquear los sitios de unión de anticuerpos no objetivo.
Introducir anticuerpos anti-IdU que interactúen con el ADN monocatenario marcado con IdU.
Agregue anticuerpos secundarios marcados con fluoróforo verde que se dirijan a los anticuerpos anti-IdU. Retire los anticuerpos no unidos.
Coloque el cubreobjetos en un portaobjetos que contenga un medio de montaje con un tinte fluorescente, que tiñe los núcleos.
Bajo un microscopio de fluorescencia, observe los núcleos azules.
Los focos de fluorescencia verde representan anticuerpos que se unen al ADN monocatenario.
Cuente el número de focos para cuantificar el nivel de estrés de replicación.
Agregue 1 mililitro de suspensión celular en cubreobjetos de poli-L-lisina colocados en los pocillos de una placa de 24 pocillos y haga crecer las células en el medio de cultivo en condiciones estándar. Después de una duplicación de la población, aspire los medios existentes de la placa y presione las células con 10 IdU micromolares para las dos duplicaciones de población posteriores.
Para cosechar las células, reemplace el medio con PBSTx helado al 0,5% en hielo durante 5 minutos. Para la fijación de las células, aspire PBSTx e incube las células durante 15 minutos con paraformaldehído al 3% a temperatura ambiente. Después de 3 a 4 lavados con PBS, mantenga las celdas fijas a 4 grados centígrados hasta su uso posterior.
Después de la fijación, permeabilice las células con PBSTx al 0,5% en hielo durante 5 minutos, asegurándose de cubrir todo el cubreobjetos. Después de lavar las células de 3 a 4 veces con 1 mililitro de PBST al 0,2% a temperatura ambiente, aspire el PBST y bloquee las muestras, utilizando BSA al 5% hecho en PBS durante 30 minutos a temperatura ambiente.
Para la inmunotinción, prepare una cámara humidificada colocando una toalla de papel húmeda en un Tupperware de fondo plano. Cubra la tapa de la placa de 24 pocillos con parafilm. Colóquelo en la cámara humidificada y coloque los cubreobjetos en la tapa de la placa. Agregue 60 microlitros de anticuerpo primario de ratón anti-BrdU diluido, en la parte superior del cubreobjetos.
Alternativamente, para reducir el secado del anticuerpo y usar menos volumen, coloque una gota de anticuerpo diluido en la película y voltee el cubreobjetos. Luego, incube durante 1 hora a 37 grados centígrados. Después de la incubación, aspire el anticuerpo primario.
Vuelva a colocar los cubreobjetos en una placa de 24 pocillos y lávelos con PBST al 0,2% 4 veces. Agregue un anticuerpo secundario diluido en el cubreobjetos, como se demostró anteriormente, e incube durante una hora en la oscuridad a temperatura ambiente. Etiquete un portaobjetos de microscopio y monte el cubreobjetos en los portaobjetos con un medio de montaje DAPI. Guarde las diapositivas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas si el medio de montaje necesita ser curado o endurecido.