Purificación de nanopartículas de proteínas autoensamblables mediante cromatografía de afinidad

Tome una suspensión de bacterias modificadas que expresan nanopartículas de proteínas autoensamblables recombinantes con etiquetas de polihistidina.

Sonicar para liberar componentes intracelulares.

Centrífuga para recoger el sobrenadante que contiene nanopartículas de proteínas. Dilúyalo con un tampón sin imidazol.

Tome una columna de cromatografía de afinidad que contenga perlas de agarosa con cationes de níquel inmovilizados.

Agregue un tampón con una baja concentración de imidazol para equilibrar la columna.

Agregue el lisado bacteriano a la columna.

Durante la ejecución, la polihistidina en las nanopartículas de proteínas se une fuertemente con cationes de níquel.

Mientras tanto, los contaminantes como los lipopolisacáridos bacterianos y otras proteínas se unen débilmente a la columna.

Lavar con un tampón que contenga una baja concentración de imidazol para eliminar las proteínas débilmente unidas.

Introducir isopropanol para eliminar los lipopolisacáridos y luego lavar.

A continuación, introduzca un tampón con una concentración intermedia de imidazol. El imidazol compite con la histidina por unirse al catión níquel, liberando nanopartículas de proteínas unidas.

A continuación, agregue un tampón que contenga una alta concentración de imidazol para eluir completamente las nanopartículas de proteína.

Recoja las nanopartículas de proteínas purificadas para su posterior aplicación.

Para la lisis de E. coli cosechada que expresa el haz de seis hélices SAPN, utilice una sonda con una potencia de sonicación de 150 vatios, con cuatro segundos de sonicación y seis segundos de reposo para sonicar gránulos bacterianos resuspendidos en 40 mililitros de tampón sin imidazol en hielo durante cinco minutos.

Centrifugar el lisado celular para generar un sobrenadante clarificado y transferir el sobrenadante a un matraz estéril de 150 mililitros. Luego, lleve la muestra a un volumen final de 100 mililitros con tampón fresco sin imidazol.

Para aislar la proteína de interés, abra el software FPLC y haga clic en la opción Nuevo método. En el menú Configuración del método, abra el menú desplegable Posición de la columna y seleccione Puerto C1 3. En el menú desplegable Mostrado por técnica, seleccione Afinidad. En el menú desplegable Tipo de columna, seleccione Otros, HisTrap HP y cinco mililitros. El volumen de la columna y las cajas de presión se establecerán automáticamente en los valores apropiados.

Haga clic en Esquema de método y arrastre los botones Equilibrio y Aplicación de muestra, tres botones Lavado de columna y el botón Elución desde el menú emergente Biblioteca de fases situado junto a la flecha, antes de cerrar el menú Biblioteca de fases. Haga clic en Equilibrio y establezca los valores enumerados en la tabla en Búfer inicial B, 4%, Búfer final B, 4% y Volumen de columna, 5.

Haga clic en Aplicación de muestra. En el cuadro Carga de muestras, haga clic en el botón de opción para Inyectar muestra en la columna con bomba de muestra y confirme que la casilla junto a Usar caudal de la configuración del método está marcada en la Inyección de muestras con caja de bomba del sistema. Cambie el valor del cuadro Volumen a 100 mililitros y el Esquema de recopilación de fracciones a Habilitar.

Desmarque el cuadro Usar tamaño de fracción en Configuración de método y cambie el tamaño de fracción a cuatro mililitros. Haga clic en el primer botón Lavado de columna. Establezca los valores enumerados en la tabla en Búfer inicial B, 4%, Búfer final B, 4% y Volumen de columna, 10. Haga clic en el cuadro Habilitar esquema de recopilación de fracciones y desactive Usar tamaño de fracción para la configuración del método. Cambie el tamaño de la fracción a cuatro mililitros y haga clic en el segundo botón Lavado de columna.

Establezca los valores de la tabla en Búfer inicial B, 0%, Búfer final B, 0% y Volumen de columna, 5. Haga clic en el cuadro Habilitar esquema de recopilación de fracciones y desmarque Usar tamaño de fracción en Configuración de método. Cambie el tamaño de la fracción a 4 mililitros y haga clic en el botón Lavado de la tercera columna. Establezca los valores de la tabla en Búfer inicial B, 0%, Búfer final B, 0% y Volumen de columna, 10. Haga clic en el botón Habilitar esquema de recopilación de fracciones y desmarque el cuadro Usar tamaño de fracción para la configuración del método. Luego, cambie el tamaño de la fracción a 4 mililitros.

Haga clic en el botón Elución y haga clic con el botón derecho en la información de la tabla. En el menú emergente, haga clic en Eliminar paso y arrastre el botón Degradado isocrático a la tabla dos veces para que haya dos entradas. Establezca el valor de la primera entrada en Búfer inicial B, 30%, Búfer final B, 30% y Volumen de columna, 10.

Establezca el valor de la segunda entrada en Búfer inicial B, 100%, Búfer final B, 100% y volumen de columna, 10. Haga clic en el botón Habilitar esquema de recopilación de fracciones y haga clic en el cuadro Usar tamaño de fracción para la configuración del método. A continuación, haga clic en Guardar como y asigne al archivo el nombre Purificación.

Coloque el tubo de la bomba A del FPLC en el tampón de lavado sin imidazol y el tubo de la bomba B en el tampón de imidazol de 500 milimolares. Coloque el tubo de la bomba de muestra en la muestra de 100 mililitros y ejecute el programa de purificación. Cuando se necesite el lavado con isopropanol al 60%, pause el programa, mueva el tubo de la bomba del lavado sin imidazol al lavado con isopropanol al 60% y reinicie el programa. Al final del lavado, vuelva a pausar el programa, regrese el tubo de la bomba A al tampón de lavado sin imidazol y reinicie el programa de purificación.