Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

El objetivo general de este método de purificación de afinidad en tándem es aislar complejos de proteínas expresados a partir de células eucariotas para la caracterización bioquímica y los ensamblajes moleculares y la identificación de nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulen su función. Este método hace posible la purificación de complejos proteicos intactos de células eucariotas, para identificar nuevos interactores y modificaciones posttraduccionales reguladoras que afinan su función. La principal ventaja de esta técnica es que permite una alta pureza y rendimiento de complejos proteicos para aplicaciones in vitro posteriores para estudiar su función y actividad.

Las células se recolectan de la purificación por afinidad STREP 48 horas después de la transfección. Retire el medio y agregue ocho mililitros de PBS frío. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para separar las células de la placa.

Recoja y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y gire las células a 800 veces g durante cuatro minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante PBS. Centrifugar a 800 veces g durante un minuto a cuatro grados centígrados para eliminar cualquier PBS residual.

Para comenzar este procedimiento, vuelva a suspender cada gránulo de célula en cinco veces el volumen de gránulos de célula del tampón de lisis pasiva, o PLB. Transfiera la suspensión de la celda a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Agite brevemente la suspensión y nutato durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Gire la suspensión de la celda a 10.000 veces g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera el lisado soluble a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y deseche el pellet de celda. Guarde el 10% del volumen final del lisado soluble como entrada STREP-AP y guárdelo a cuatro grados centígrados.

Es importante utilizar las perlas STREP para el primer paso de purificación por afinidad porque los complejos tirados hacia abajo con las perlas STREP recuperan significativamente más proteínas que los tirados hacia abajo con las perlas FLAG. Con una punta de pipeta de boca ancha, retire la cantidad adecuada de lodo de perlas STREP al 50 % para la purificación por afinidad. Girar a 1.500 veces g durante dos minutos a cuatro grados centígrados.

Retire el sobrenadante y agregue 500 microlitros de PLB a las cuentas. Nutar la mezcla de cuentas durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Gira hacia abajo de nuevo.

Después del tercer lavado, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en PLB hasta un volumen final de n veces 40 microlitros, donde n es el número de muestras. Agregue 40 microlitros de lodo de perlas STREP al 50% a cada muestra de lisado celular y nutate durante dos horas a cuatro grados centígrados. Durante esta producción y recuperación de proteínas, se pueden utilizar múltiples placas de células, y las mismas muestras de proteínas lisadas de diferentes placas se pueden combinar con una porción de perlas durante la purificación por afinidad STREP.

Después de que las mezclas de lisado celular y lodo de perlas STREP se hayan incubado durante dos horas, centricítelas a 1.500 veces g durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Guarde el sobrenadante a medida que STREP AP fluya y almacene a cuatro grados centígrados. Agregue 500 microlitros de tampón de lavado STREP AP uno a las perlas.

Nutar las perlas en la mezcla tampón durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y centrifugar a 1.500 veces g durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a lavar con 500 microlitros de STREP AP tampón de lavado uno. Después del tercer lavado, transfiera la solución de perlas a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para reducir el fondo de proteínas.

Lavar por cuarta vez con STREP AP wash buffer one. Después del centrifugado, retire el sobrenadante y agregue 500 microlitros de mantequilla de lavado dos. Equilibre las cuentas invirtiendo los tubos y luego gire hacia abajo a 1.500 veces g durante dos minutos a cuatro grados centígrados.

Deseche el sobrenadante. Eluir la proteína de interés con 50 microlitros de tampón de elución STREP. Vórtice a 800 rpm durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

Gire las cuentas a 1.500 veces g durante un minuto a cuatro grados centígrados. Recoge el sobrenadante. Esta fracción corresponde a la muestra de elución STREP AP.

Guarde la fracción de perlas a cuatro grados centígrados para una segunda elución. Alícuota del 10% de la elución STREP AP para tinción de plata y/o Western blot. Con el fin de aumentar la cantidad de material de partida para la posterior inmunoprecipitación de GALP, la primera y la segunda elución de STREP pueden agruparse para una recuperación más eficiente de la elución de GALP.

Comience este procedimiento utilizando una punta de pipeta de boca ancha para transferir la cantidad adecuada de solución de perlas FLAG a un tubo de microcentrífuga. Girar a 1.500 veces g durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Retire el sobrenadante y agregue 500 microlitros de tampón de lavado FLAG a las perlas.

Girar a 1.500 veces g durante dos minutos a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante y vuelva a lavar con tampón de lavado FLAG. Después del tercer lavado, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las perlas en el tampón de lavado FLAG hasta un volumen final de n veces 16 microlitros, donde n es el número de muestras.

Añada 16 microlitros de la suspensión de perlas FLAG a la elución STREP AP restante y nutato durante la noche a cuatro grados centígrados. Tras una incubación nocturna de la suspensión de perlas de FLAG y la elución de STREP AP, se procede a la inmunoprecipitación con FLAG. Gire la suspensión de talón FLAG a 1.500 veces g durante dos minutos a cuatro grados centígrados.

Guarde el sobrenadante a medida que el FLAG IP fluye y almacene a cuatro grados centígrados. Agregue 500 microlitros de tampón de lavado FLAG a las perlas. Nutato durante cinco minutos a cuatro grados centígrados y centrifugar a 1.500 veces g durante dos minutos a cuatro grados centígrados.

Deseche el sobrenadante y vuelva a lavar con 500 microlitros de tampón de lavado FLAG. Después del tercer lavado, transfiera la solución de perlas de proteína a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros para reducir el fondo. Lavar por cuarta vez con tampón de lavado FLAG.

Retire el sobrenadante del centrifugado final y añada a las perlas 30 microlitros de tampón de lavado FLAG, que contiene 200 nanogramos por microlitro de péptido FLAG. Vórtice a 800 rpm durante dos horas a cuatro grados centígrados. Después de dos horas, baje la suspensión a 1.500 veces g durante dos minutos a cuatro grados centígrados.

Coseche el sobrenadante y almacene a cuatro grados centígrados como elución IP de FLAG. En este video, se aplicó la purificación de afinidad en tándem, o método TAP, al complejo Cyclin-T1 CDK9. La ciclina-T1 marcada con STREP y la CKD9 marcada con FLAG se sobreexpresaron en las células T HEK293.

También se realizó un experimento recíproco con CDK9 marcado con STREP y Cyclin-T1 marcado con FLAG. El análisis de Western blot muestra que CKD9 marcada con FLAG coeluyó con Cyclin-T1 marcada con STREP de las perlas STREP, pero no en el control negativo, AP sin Cyclin-T1 marcada con STREP. Ambas proteínas se detectaron en la elución de FLAG, lo que confirmó aún más la formación del complejo.

Los resultados recíprocos de TAP muestran que la ciclina-T1 marcada con FLAG coeluyó con la CDK9 marcada con STREP, lo que valida aún más que la interacción ciclina-T1 CDK9 es independiente de los epítopos utilizados. Los resultados del TAP y del TAP recíproco también se analizaron mediante tinción con plata. Los asteriscos indican impurezas coeluidas.

CKD9 marcada con FLAG coeluida con Cyclin-T1 marcada con STREP fuera de las perlas STREP, pero no desde el control AP.In la elución posterior de FLAG, Cyclin-T1 marcada con STREP coeluida con CDK9 marcada con FLAG fuera de las perlas FLAG. De manera similar, Cyclin-T1 marcada con FLAG coeluyó con CDK9 marcada con STREP fuera de las perlas STREP, pero no del AP de control. Y el complejo proteína-proteína se recuperó de manera eficiente después del segundo paso de FLAG IP. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos días, comenzando cuando las células están listas para ser recolectadas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe aumentar el número de placas celulares por experimento en consecuencia para garantizar que se pueda recuperar y detectar suficiente proteína. Por ejemplo, la identificación de las nuevas subunidades reguladoras y/o el estudio de las modificaciones postraduccionales en subunidades complejas. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores que estudian las interacciones proteína-proteína exploren nuevos interactores y modificaciones postraduccionales en células eucariotas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y caracterizar proteínas usando las etiquetas STREP y FLAG.