Name: Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Aprende el método de purificación de afinidad en tándem (TAP) para aislar complejos proteicos de células eucariotas con alta pureza. Esta técnica permite identificar nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulan la función celular.

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La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (NIAID) de los NIH bajo la subvención número R01AI114362 y la Fundación Welch I-1782 a Iván D'Orso.

1. Las células Plating <ol><li> Un día antes de la transfección, la placa de 3,5 x 10 6 células HEK293T en 10 ml de de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (10.000 U / ml de solución madre) por placa de 100 mm. Plate 3 - 5 100 mm platos por experimento / condición para asegurar una recuperación suficiente proteína. NOTA: El número de placas tiene que ser determinada para cada experimento / condición, que se basará en los niveles de expresión y la solubilidad del complejo de proteína de interés. Alternativamente, si se necesita la purificación a gran escala, las líneas celulares pueden ser adaptadas para crecer en suspensión en matraces de agitación 2, pero este método no funcionará para transfecciones transitorias. </li></ol> 2. Inducir la transfección de células o líneas celulares estables <ol><li> Al día siguiente, comprobar las células bajo el microscopio. Las células deben ser de 70 - 80% de confluencia antes de proceeding. </li><li> Transfectar las células con una mezcla total de 7 g de ADN plásmido y 21 l de reactivo de transfección por plato 100 mm. Células transfectar con un vector que expresa GFP (Tabla 1) como control para la eficiencia de transfección. NOTA: Si se utiliza una línea celular estable similares HEK293-T-REx o que induce la expresión de dos o más complejos de subunidades en respuesta a la doxiciclina 14, 15, el inductor tendrá que ser añadido a las células y se incubaron durante 48 hr. Del mismo modo, una línea celular estable que induce la expresión de GFP después de la adición del inductor también se requiere para fines de validación. Continúe en el paso 2.7. </li><li> Preparar la mezcla de transfección por placa de 100 mm. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, mezclar 500 l de DMEM sin suplementos con 7 g de ADN de plásmido total (correspondiente a dos o más plásmidos). En un tubo de microcentrífuga separado, mezclar 500 l de DMEM sin suplementos with 21 l de reactivo de transfección. Repita este procedimiento para cada reacción de transfección. </li><li> Pipetear la solución del reactivo de transfección en la solución de ADN del plásmido (no se mezclan soluciones en el orden inverso). Mezclar pipeteando al menos 4 veces. </li><li> Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 10 a 15 min, pero no más de 15 min. </li><li> Inclinar la placa para crear un depósito de medio y cuidadosamente pipetear la mezcla de transfección gota a gota sobre el lado interior de la placa sin perturbar las células. Devolver el plato a su posición plana original y girar suavemente para distribuir la mezcla. </li><li> Se incuban las células a 37 ° C en una incubadora de cultivo de células humidificado con 5% de CO 2 (esta condición se denomina en adelante como &quot;incubadora de cultivo de tejidos&quot;). Reemplazar los medios de comunicación 5 horas después de la transfección (opcional). </li></ol> 3. La transfección de cheques o la eficiencia de inducción <ol><li> A las 24 h después de la transfección, visualizar las células bajo una gripeorescent microscopio para comprobar la eficiencia de transfección (o la inducción del control HEK293T-Rex línea celular estable que expresa GFP). Se incuba durante otras 24 horas. </li></ol> 4. STREP Purificación por Afinidad (STREP AP) <ol><li> Recoger las células <ol><li> A las 48 horas después de la transfección, saque la tarjeta y añadir 8 ml de solución salina tamponada con fosfato 1x frío (PBS). Pipetear arriba y abajo para separar las células de la placa. </li><li> Recoger y transferir la suspensión de células en un tubo de 15 ml y centrifugar las células hacia abajo a 800 xg durante 4 minutos a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante de PBS. Repetir el giro hacia abajo (800 xg durante 1 min a 4 ° C) para eliminar cualquier PBS residual. Almacenar el sedimento celular a -80 ° C para su uso futuro o seguir el procedimiento siguiente para continuar la purificación de proteínas. </li></ol></li><li> Lisar las células <ol><li> Volver a suspender los sedimentos celulares utilizando 5 x el volumen de sedimento celular (~ 250 l por placa) de tampón de lisis pasiva(PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, NaCl 150 mM, 1,5 mM MgCl 2 mM, DTT 1, proteasa tableta de cóctel inhibidor, 5% v / v de glicerol, y 1,0% NP-40) y transferir la suspensión celular a una 1,5 ml tubo de microcentrífuga. </li><li> Brevemente vórtex con la suspensión y inclinar la cabeza durante 30 minutos a 4 ° C. </li><li> Centrifugar la suspensión de células a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C. </li><li> La transferencia de los lisados ​​solubles en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y desechar los sedimentos celulares. Ahorra un 10% del volumen final del lisado soluble como &quot;Input STREP AP.&quot; Almacenar a 4 ° C. </li></ol></li><li> Equilibrar las cuentas STREP NOTA: Los granos Uso STREP para la primera etapa AP! Complejos tira hacia abajo con los granos STREP recuperan significativamente más proteína que los derribado con perlas de bandera. <ol><li> Sacar (n × 40 l) n + l de la suspensión de cuentas STREP 50% (n = número de muestras) y centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. NOTA: Use-m de anchoconsejos outhed a perlas de pipeta. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 500 l de PLB a las perlas. Inclinar la cabeza la mezcla de los granos durante 5 min a 4 ° C. Centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. <ol><li> Repita para un total de 3 lavados. Resuspender las perlas en PLB a un volumen final de n × 40 l. </li></ol></li><li> Añadir 40 l de 50% de suspensión STREP de cuentas para cada muestra de lisado celular y inclinar la cabeza durante 2 horas a 4 ° C. </li></ol></li><li> STREP AP <ol><li> Centrifugar la solución a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C. </li><li> Eliminar el sobrenadante y almacenar como &quot;STREP AP de flujo continuo (FT)&quot; a 4 ° C. </li><li> Añadir 500 l de STREP AP tampón de lavado I (Tris-HCl 20 mM pH 7,5, NaCl 250 mM, 1,5 mM MgCl 2 mM, DTT 1, 5% de glicerol y 0,2% NP-40) a las perlas. Inclinar la cabeza la mezcla de perlas durante 5 min a 4 ° C y se centrifuga a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante. <ol><li> Repita para un total de 4 lavados. <br/&gt; NOTA: Antes del cuarto lavado, transferir la solución de perlas a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a reducir el fondo de proteínas. Este paso es esencial. </li></ol></li><li> Añadir 500 l de tampón de lavado II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, y EDTA 1 mM) y equilibrar las cuentas por inversión de los tubos. Centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C y descartar el sobrenadante. </li><li> Eluir la proteína de interés con 50 l de STREP Tampón de Elución (Tris-HCl 100 mM pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, y destiobiotina 2,5 mM). Vortex a 800 rpm durante 15 min a 4 ° C. </li><li> Centrifugar las perlas a 1.500 xg durante 1 min a 4 ° C. Recoger el sobrenadante. Esta fracción corresponde a la muestra &quot;STREP AP elución&quot;. </li><li> Guardar la fracción perlas a 4 ° C para una segunda elución, lo que podría producir hasta la mitad de la cantidad de proteína obtenida con la primera elución. Alícuota de 10% de la STREP AP elución para la tinción de plata y / o el Western Blot16. </li></ol></li><li> Equilibrar las cuentas BANDERA <ol><li> Sacar (nx 16 l) n + l de solución de perlas de FLAG (n = número de muestras) y centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. NOTA: Utilice consejos de boca ancha a perlas de pipeta. </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir 500 l de tampón de lavado FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, y 0,1% NP-40) a las perlas. Centrifugar a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repita para un total de 3 lavados. </li><li> Resuspender las perlas en tampón de lavado FLAG a un volumen final de 16 l nx. </li><li> Añadir 16 l de la suspensión de la BANDERA de talón al resto de elución STREP AP y alojamiento inclinar la cabeza a 4 ° C. </li></ol></li></ol> 5. BANDERA IP <ol><li> Centrifugar la suspensión perlas FLAG a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C. Guardar el sobrenadante y tienda como la &quot;bandera IP de flujo continuo&quot; (FT) a 4 ° C. </li><li> Añadir 50081; l de tampón de lavado FLAG a la solución. Inclinar la cabeza durante 5 min a 4 ° C y se centrifuga a 1500 xg durante 2 min a 4 ° C. Repita para un total de 4 lavados y eliminar el sobrenadante después de cada lavado. NOTA: Antes de que el cuarto lavado, transferir la solución de proteína-cuentas a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para reducir el fondo. Este paso es esencial. </li><li> Eliminar el sobrenadante del centrifugado final y añadir 30 l de tampón de lavado que contiene FLAG 200 ng / l de péptido FLAG en las perlas. Vórtice a 800 rpm durante 2 horas a 4 ° C. </li><li> Centrifugar la suspensión a 1.500 xg durante 2 min a 4 ° C. Se recoge el sobrenadante y se almacena a 4 ° C como la &quot;bandera IP elución.&quot; NOTA: Las muestras de elución se pueden confirmar por tinción de plata y / o de transferencia de Western usando protocolos estándar 16, y están listos para más ensayos de proteínas. Al configurar una transferencia de western, ejecutar todas las siguientes muestras: (1) PEIF AP de entrada, (2) STREP AP FT, (3) STREP AP Elutien, (4) BANDERA IP FT, y (5) BANDERA IP elución. Los volúmenes cargados tendrán que ser determinado para cada experimento. Todas las muestras recogidas y los granos se pueden almacenar a 4 ° C para el almacenamiento a corto plazo y a -80 ° C para el almacenamiento a largo plazo. Muestras TAP podrían ser analizados mediante espectrometría de masas para verificar la identidad de sus componentes, para identificar nuevos modificaciones post-traduccionales (PTMs), y / o para descubrir cualquier interacción nueva proteína con el complejo purificado 2, 17. Para este propósito, después de ejecutar una mancha de gel de Coomassie o plata, las bandas pueden ser extirpados del gel utilizando un escalpelo limpio. Varios excelentes críticas que discuten métodos de espectrometría de masas se han publicado 18, 19. </li></ol>

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<li>Bensimon, A., Heck, A. J., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics+and+network+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics and network biology.</a> Annu Rev Biochem. 81, 379-405 (2012).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí para la expresión y el aislamiento de los complejos de proteínas a partir de células eucariotas no se limita a la caracterización bioquímica de tales conjuntos moleculares, pero también puede ser utilizado para la identificación de nuevos interactores y modificaciones posteriores a la traducción que podría regular su función. La utilización de etiquetas de afinidad no se limita a lo que se menciona en este protocolo; pero nuestra experiencia sugiere que el uso de STREP como el primer paso AP m...

<html> Interacciones proteína-proteína (IBP) son fundamentales para la regulación precisa de los procesos biológicos 1, y más estudios sobre estos IBP puede informar acerca de su función 2. Varios enfoques se han ideado para el estudio y caracterización de los IBP, así como para la identificación de novo de nuevos componentes de la proteína de regulación. En 1989, Stanley Fields y sus colegas informaron de la levadura de dos híbridos (Y2H) de ensayo 3. Este enfoque permite la identificación imparcial y exhaustiva de interactores (presas) para una proteína de interés definida (cebo) en Saccharomyces cerevisiae. Además de su notable utilidad para el descubrimiento de los IBP, el ensayo Y2H se puede utilizar para la caracterización de pares de proteínas en células de levadura, la definición de dominios que interactúan mínimas, y la identificación de mutaciones que suprimen tales interacciones. Modificando el ensayo Y2H, IBP también puede estudiarse en células de mamíferoclass = &quot;xref&quot;&gt; 4. Las variaciones del ensayo de Y2H (por ejemplo, sistema de levadura de tres híbridos) también se pueden aplicar para estudiar la proteína-ARN y las interacciones ligando orgánico de proteínas pequeñas en las células. Otra herramienta usada comúnmente para estudiar los IBP en un sistema homólogo es la co-inmunoprecipitación (co-IP) de ensayo 5. Mediante el uso de un anticuerpo para inmunoprecipitar una proteína de interés, el ensayo de co-IP permite a los investigadores monitorizar los IBP en las células para diferentes condiciones ambientales y situaciones experimentales. El uso de proteínas etiquetadas con epítopo (por ejemplo, FLAG, Myc, STREP, y HA, entre otros) en la purificación por afinidad (AP) métodos ha facilitado el aislamiento de proteínas a partir de mezclas complejas de proteínas de varios ensayos de aguas abajo, incluyendo transferencia de Western, tinción de plata , y análisis enzimático. Sin embargo, ninguno de estos enfoques anteriores permiten el aislamiento de grandes cantidades de complejos de proteínas para una caracterización adicional incluyendo in vitro unassays, descubrimiento de subunidades reguladoras por espectrometría de masas, y la identificación de las modificaciones post-traduccionales. Una versión mejorada del método de AP se llama Tandem AP (TAP), que es una técnica de purificación para el estudio de los IBP mediante la creación de una proteína de fusión con dos epítopos que se purifica a través de dos puntos de acceso posteriores 6, 7. En este artículo, se presenta una variación del método de TAP complejos de proteínas de purificación en el que dos subunidades etiquetados con diferentes epítopos y después se purificó a través de dos puntos de acceso secuencial (STREP AP seguido de FLAG IP). En primer lugar, proporcionar una visión minimalista de TAP (Figura 1) y, a continuación una descripción detallada de todos los pasos experimentales (Figura 2), por lo que los investigadores puedan aplicarlas a su complejo de proteína de interés. Para demostrar la aplicabilidad del método TAP, elegimos un bien caracterizado ciclina-CDK complejo (denominado PTEFB quinasa), que se compone de la ciclina T1 subunidad reguladora (CycT1) y una quinasa (CDK9), y está implicado en la regulación de la transcripción por la ARN polimerasa II (Pol II) 8, 9, 10. P-TEFb fosforila el dominio C-terminal de Pol II y sus asociados factores de elongación negativos, lo que alivia la pausa de la transcripción en el promotor y de ese modo facilita la elongación de la transcripción 11, 12, 13. Con esta interacción conocida en mente, Strep-etiquetados CycT1 y CDK9 marcado con FLAG fueron sobreexpresado en células HEK293T. Un experimento recíproco TAP se realizó con CDK9 Strep-etiquetados y la bandera de etiquetado CycT1 para validar además que la interacción de proteínas es independiente de los epítopos utilizados. Las células se recogieron y se lisaron 48 h después de la transfección. El lisado soluble se purificó por TAP (STREP AP seguido por FLAGIP). Entrada y proteínas purificadas se analizaron por Western blot y tinción de plata (Figura 3).

<table><tbody><tr><td>Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH3002.2FS</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>GE Healthcare Life Sciences/Hyclone</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP091670049</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SignaGen Laboratories</td><td>SL100688</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa&nbsp;</td><td>Roche&nbsp;</td><td></td><td></td>11836153001</tr><tr><td>STREP-Tactin Superflow</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1208-010</td><td></td></tr><tr><td>STREP-tag Buffer de elución</td><td>IBA Lifesciences</td><td>2-1000-025</td><td></td></tr><tr><td>EZview Red ANTI-FLAG M2 Affinity Gel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2426</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm &times; 20 mm estilo plato de cultivo celular poliestireno no pirogénico tratado 20/manga</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Protein Lo-Bind Eppendorf</td><td>Eppendorf 022431081</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de vórtice digital</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>02-215-370</td><td></td></tr><tr><td>Estante de espuma de microtubos de 48 orificios</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-386</td><td></td></tr><tr><td>Asador de agitadores Labquake&nbsp;</td><td>Termo&nbsp;</td><td>415110</td><td></td></tr></tbody></table>

tandem affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

La purificación de activo proteína-proteína y complejos de proteína-ácido nucleico es crucial para la caracterización de las actividades enzimáticas y de novo identificación de nuevas subunidades y modificaciones post-traduccionales. sistemas bacterianos permiten la expresión y purificación de una amplia variedad de polipéptidos individuales y complejos de proteínas. Sin embargo, este sistema no permite la purificación de subunidades de proteínas que contienen modificaciones post-traduccionales (por ejemplo, la fosforilación y la acetilación), y la identificación de nuevas subunidades reguladoras que sólo están presentes / expresadas en el sistema eucariota. Aquí, proporcionamos una descripción detallada de una novela, robusto y eficiente método de purificación por afinidad en tándem (TAP) usando estreptomicina y proteínas bandera de etiquetado que facilita la purificación de complejos de proteínas con proteínas de forma transitoria o estable expresado etiquetadas con epítopo de las células eucariotas. Este protocolo se puede aplicar a caracterizar protein funcionalidad compleja, para descubrir las modificaciones posteriores a la traducción en subunidades complejos, e identificar nuevos componentes complejos de regulación mediante espectrometría de masas. En particular, este método TAP se puede aplicar para estudiar complejos de proteínas formadas por componentes eucariotas o patógenos (virales y bacterianas), produciendo de este modo una amplia gama de oportunidades experimentales aguas abajo. Proponemos que los investigadores que trabajan con complejos de proteínas podrían utilizar este enfoque de muchas maneras diferentes.

En este artículo, se demuestra la aplicabilidad del método TAP para el bien caracterizado CycT1-CDK9 compleja (también conocido como P-TEFb quinasa). Los plásmidos que codifican la ciclina T1-STREP (CycT1: S) y CDK9-FLAG (CDK9: F), o CDK9-STREP (CDK9: S) y Ciclina T1-FLAG (CycT1: F) (Tabla 1), se transfectaron en células HEK293T . Los controles negativos incluyeron transfecciones con un vector vacío y la CDK9:...

Describimos aquí un novedoso, robusto y eficiente método de purificación de afinidad en tándem (TAP) para la expresión, aislamiento y caracterización de complejos de proteínas de células eucariotas. Este protocolo podría utilizarse para la caracterización bioquímica de complejos discretos, así como para la identificación de nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulen su función.

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

El objetivo general de este método de purificación por afinidad en tándem es aislar complejos proteicos expresados en células eucariotas para su caracterización bioquímica, el estudio de ensamblajes moleculares y la identificación de nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulen su función. Este método permite la purificación de complejos proteicos intactos a partir de células eucariotas, con el fin de identificar nuevos interactores y modificaciones postraduccionales regulatorias que ajustan finamente su función. La principal ventaja de esta técnica es que posibilita obtener complejos proteicos con alta pureza y rendimiento, para aplicaciones posteriores in vitro que permitan estudiar su función y actividad.Las células se recolectan a partir de la purificación de afinidad STREP 48 horas después de la transfección. Retire el medio y agregue ocho mililitros de PBS frío. Pipetee hacia arriba y hacia abajo para desprender las células de la placa.Recopile y transfiera la suspensión celular a un tubo de 15 mililitros y centrifugue las células a 800 ×g durante cuatro minutos a cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante de PBS. Centrifugue nuevamente a 800 ×g durante un minuto a cuatro grados Celsius para eliminar cualquier resto de PBS.Para comenzar este procedimiento, resuspenda cada pellet celular en cinco veces el volumen del pellet celular de tampón de lisis pasiva, o PLB. Transfiera la suspensión celular a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Vortex brevemente la suspensión y agite suavemente durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.Centrifugar la suspensión celular a 10.000 × g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Transferir el lisado soluble a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y desechar el pellet celular. Guardar el 10 % del volumen final del lisado soluble como entrada de STREP-AP y almacenarlo a cuatro grados Celsius.Es importante utilizar perlas STREP para el primer paso de purificación por afinidad porque los complejos obtenidos con perlas STREP recuperan significativamente más proteína que aquellos obtenidos con perlas FLAG. Con una punta de pipeta de boca ancha, retire la cantidad adecuada de suspensión al 50 % de perlas STREP para la purificación por afinidad. Centrifugue a 1.500 ×g durante dos minutos a cuatro grados Celsius.Retire el sobrenadante y agregue 500 microlitros de PLB a las perlas. Incube la mezcla de perlas en agitación suave durante cinco minutos a cuatro grados Celsius. Vuelva a centrifugar.Después del tercer lavado, retire el sobrenadante y resuspenda las perlas en PLB hasta un volumen final de n veces 40 microlitros, donde n es el número de muestras. Añada 40 microlitros de la suspensión al 50 % de perlas STREP a cada muestra de lisado celular y agite suavemente durante dos horas a cuatro grados Celsius. Durante esta producción y recuperación de proteínas, se pueden utilizar varias placas de células, y las mismas muestras de proteínas lisadas provenientes de diferentes placas pueden combinarse con una porción de perlas durante la purificación por afinidad STREP.Después de que las mezclas de lisado celular y suspensión de perlas STREP hayan incubado durante dos horas, centrifúgelas a 1.500 × g durante dos minutos a cuatro grados Celsius. Guarde el sobrenadante como flujo de salida del AP STREP y almacénelo a cuatro grados Celsius. Añada 500 microlitros de tampón de lavado AP STREP uno a las perlas.Agite suavemente las perlas en la mezcla de tampón durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y centrifugue a 1.500 × g durante dos minutos a cuatro grados Celsius. Descarte el sobrenadante y lave nuevamente con 500 microlitros de tampón de lavado STREP AP uno. Después del tercer lavado, transfiera la solución de perlas a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros para reducir el fondo proteico.Lave por cuarta vez con el tampón de lavado STREP AP uno. Después de la centrifugación, elimine el sobrenadante y agregue 500 microlitros del tampón de lavado dos. Equilibre las perlas invirtiendo los tubos y luego centrifugue a 1.500 × g durante dos minutos a cuatro grados Celsius.Deseche el sobrenadante. Eluya la proteína de interés con 50 microlitros de tampón de elución STREP. Vortexee a 800 rpm durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.Centrifugar las perlas a 1 500 ×g durante un minuto a cuatro grados Celsius. Recoger el sobrenadante. Esta fracción corresponde a la muestra de elución STREP AP.Guarde la fracción de perlas a cuatro grados Celsius para una segunda elución. Aliquote el 10 % de la elución STREP AP para tinción con plata y/o inmunotransferencia. Para aumentar la cantidad de material inicial para la inmunoprecipitación con FLAG subsiguiente, las primeras y segundas eluciones STREP pueden agruparse juntas para lograr una recuperación más eficiente de la elución con FLAG.Comience este procedimiento utilizando una punta de pipeta de boca ancha para transferir la cantidad adecuada de solución de perlas FLAG a un tubo de microcentrifugado. Centrifugue a 1.500 ×g durante dos minutos a cuatro grados Celsius. Retire el sobrenadante y agregue 500 microlitros de tampón de lavado FLAG a las perlas.Centrifugar a 1.500 ×g durante dos minutos a cuatro grados Celsius. Descartar el sobrenadante y lavar nuevamente con tampón de lavado FLAG. Después del tercer lavado, eliminar el sobrenadante y resuspender las perlas en tampón de lavado FLAG hasta un volumen final de n veces 16 microlitros, donde n es el número de muestras.Añada 16 microlitros de la suspensión de perlas FLAG a la elución STREP AP restante y agite suavemente durante la noche a cuatro grados Celsius. Tras una incubación nocturna de la suspensión de perlas FLAG y la elución STREP AP, continúe con la inmunoprecipitación FLAG. Centrifugue la suspensión de perlas FLAG a 1.500 × g durante dos minutos a cuatro grados Celsius.Guarde el sobrenadante como el flujo pasado del IP de FLAG y almacénelo a cuatro grados Celsius. Añada 500 microlitros de tampón de lavado de FLAG a las perlas. Incube con agitación rotatoria durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y centrifugue a 1,500 ×g durante dos minutos a cuatro grados Celsius.Descarte el sobrenadante y lave nuevamente con 500 microlitros de tampón de lavado FLAG. Después del tercer lavado, transfiera la solución de perlas proteicas a un nuevo tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros para reducir el fondo. Lave una cuarta vez con tampón de lavado FLAG.Elimine el sobrenadante del último centrifugado y añada a las perlas 30 microlitros de tampón de lavado FLAG que contenga 200 nanogramos por microlitro de péptido FLAG. Vortexee a 800 rpm durante dos horas a cuatro grados Celsius. Después de dos horas, centrifugue la suspensión a 1.500 × g durante dos minutos a cuatro grados Celsius.Recolecte el sobrenadante y almacénelo a cuatro grados Celsius como el eluato de la inmunoprecipitación con FLAG. En este video, el método de purificación por afinidad en tándem, o TAP, se aplicó al complejo Cyclin-T1 CDK9. Cyclin-T1 con marca STREP y CKD9 con marca FLAG se sobreexpresaron en células HEK293 T.También se realizó un experimento recíproco con CDK9 marcado con STREP y Ciclina-T1 marcada con FLAG. El análisis por inmunotransferencia muestra que CDK9 marcado con FLAG coeluyó con Ciclina-T1 marcada con STREP de las perlas STREP, pero no en el control negativo, AP sin Ciclina-T1 marcada con STREP. Ambas proteínas se detectaron en la elución con FLAG, lo que confirmó aún más la formación del complejo.Los resultados de TAP recíproco muestran que la Ciclina-T1 marcada con FLAG se coeluyó con CDK9 marcado con STREP, lo que valida aún más que la interacción entre Ciclina-T1 y CDK9 es independiente de los epítopos utilizados. Los resultados del TAP y del TAP recíproco también se analizaron mediante tinción con plata. Los asteriscos indican impurezas coeluidas.CKD9 con marca FLAG coeluyó con Ciclina-T1 con marca STREP de las perlas STREP, pero no del AP control. En la elución posterior con FLAG, la Ciclina-T1 con marca STREP coeluyó con CDK9 con marca FLAG de las perlas FLAG. De manera similar, la Ciclina-T1 con marca FLAG coeluyó con CDK9 con marca STREP de las perlas STREP, pero no del AP control. Y el complejo proteína-proteína se recuperó eficientemente tras el segundo paso de IP con FLAG. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos días, comenzando cuando las células están listas para ser recolectadas, siempre que se realice adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar aumentar el número de placas de células por experimento de manera adecuada para asegurar que se pueda recuperar y detectar suficiente proteína. Por ejemplo, identificar nuevas subunidades reguladoras y/o estudiar las modificaciones postraduccionales en subunidades del complejo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores que estudian interacciones proteína-proteína exploraran nuevos interactores y modificaciones postraduccionales en células eucariotas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y caracterizar proteínas utilizando etiquetas STREP y FLAG.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Tandem purificación de afinidad es un enfoque sólido para la identificación de socios de la unión a proteínas. Como prueba de concepto, esta metodología se aplicó a la traducción factor eIF4E bien caracterizado iniciación a co-precipitado los factores implicados en la célula huésped iniciación de la traducción. Este método se adapta fácilmente a cualquier proteína celular o viral.

Identificación de los socios interacción de proteínas en tándem de purificación de afinidad

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la...

Identificación de los complejos de proteínas en<em&gt; Escherichia coli</em&gt; La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Este video muestra la purificación por afinidad en tándem, una técnica para purificar complejos de proteínas de células eucariotas para estudiar la interacción proteína-proteína. El complejo contiene dos proteínas marcadas con diferentes etiquetas de epítopos. Tras la purificación del complejo utilizando dos resinas con afinidad por las dos marcas diferentes de forma secuencial, la presencia de ambas proteínas en el eluido confirma la interacción entre ambas.

Ensayo de purificación de afinidad en tándem para estudiar las interacciones proteína-proteína

Complejos de proteínas catalizan las funciones celulares clave. Caracterización detallada funcional y estructural de muchos complejos esenciales requiere la producción recombinante. MultiBac es un sistema de células de baculovirus / insecto particularmente adaptado para la expresión de proteínas eucarióticas y sus complejos. MultiBac se implementó como una plataforma de acceso libre, y los procedimientos operativos estándar desarrollados para maximizar su utilidad.

El Protein Complex Plataforma de Producción MultiBac en el EMBL

Drosophila es famoso por su gran alcance de la manipulación genética, pero no por su idoneidad del análisis bioquímico en profundidad. Aquí presentamos un procedimiento basado en TAP para identificar socios que interactúan de cualquier proteína de interés a partir de cerebro de la mosca. Este procedimiento puede potencialmente conducir a nuevas vías de investigación.

La identificación de la interacción proteína-proteína en<em&gt; Drosophila</em&gt; Jefes adultas por Tandem Affinity purificación (TAP)

El método de Purificación por Afinidad en Tándem (TAP) se ha utilizado ampliamente para aislar complejos nativos de extractos celulares, principalmente eucariotas, para proteómica. Aquí, presentamos un protocolo de método TAP optimizado para la purificación de complejos nativos para estudios estructurales.

Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity

Aquí se describe protocolos para romper las células de mamíferos por molienda en estado sólido a una temperatura criogénica, producir un extracto celular a partir del polvo de células resultante, y aislar los complejos de proteínas de interés por captura de afinidad sobre perlas paramagnéticas a escala micrométrica de anticuerpos acoplados.

Complejo de proteínas de captura por afinidad a partir de células de mamífero Cryomilled

Aquí presentamos protocolos para la purificación por afinidad de los complejos de proteínas y su separación por PAGE nativa azul, seguido por la proteína de perfiles de correlación utilizando etiqueta espectrometría de masa libre cuantitativo. Este método es útil para resolver interactomes en complejos de proteínas distintas.

Resolver purificado por afinidad Complejos de Proteína de Blue nativo PAGE y de proteínas de perfiles de correlación

Las interacciones proteína-proteína y proteína-metabolito son cruciales para todas las funciones celulares. Adjunto, describimos un protocolo que permite el análisis paralelo de estas interacciones con una proteína de elección. Nuestro protocolo fue optimizado para cultivos de células vegetales y combina la purificación de la afinidad con la proteína basada en espectrometría de masa y detección de metabolitos.

2 en 1: purificación de la afinidad para el análisis paralelo de proteínas y complejos de proteína-metabolito de un solo paso

Aquí presentamos un protocolo probado y comprobado para la purificación del cloroplasto importación complejos (complejo TIC TOC) usando la etiqueta de grifo. El protocolo de aislamiento de afinidad de un paso potencialmente se puede aplicar a cualquier proteína y se utiliza para identificar a nuevos socios de interacción por espectrometría de masas.

Purificación de la afinidad del cloroplasto Translocon complejos utilizando la etiqueta de grifo

Este artículo proporciona un procedimiento para la purificación por afinidad de una proteína recombinante humana, la endonucleasa flap 1 (FEN1), que ha sido marcada con una etiqueta de histidina 6X. El protocolo implica la utilización de dos columnas de iones metálicos inmovilizadas distintas para la purificación de la proteína marcada.

Purificación por afinidad de una proteína marcada con 6X His utilizando un sistema de cromatografía líquida rápida de proteínas 

Aprende el método de purificación de afinidad en tándem (TAP) para aislar complejos proteicos de células eucariotas con alta pureza. Esta técnica permite identificar nuevos interactores y modificaciones postraduccionales que regulan la función celular.

Tandem Affinity purificación de complejos de proteínas a partir de células eucariotas

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