Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

El objetivo general de este procedimiento es determinar la afinidad de unión de una interacción entre una proteína y un ligando sin necesidad de purificar la proteína a partir de un lisado celular. Esto se logra primero expresando la proteína de interés fusionada con GFP en cualquier línea celular adherente. Tras la preparación del lisado celular y de las diluciones del ligando, se preparan mezclas de lisado celular y ligando, que luego se cargan en capilares.

A continuación, se mide la termorresistencia de la proteína fusionada con GFP en presencia de concentraciones variables de ligando. El paso final es el análisis de datos de las mediciones de termoforesis en microescala o MST. En última instancia, la termorresistencia en microescala se utiliza para determinar las afinidades de unión de las interacciones entre proteínas fusionadas con GFP y diversos ligandos.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la titulación, la calorimetría o la resonancia de plasmón superficial es que evita la purificación de proteínas, simplificando y acelerando significativamente la caracterización cuantitativa de interacciones binarias. Este método presenta ventajas importantes al trabajar con proteínas difíciles de expresar y purificar, como las proteínas de membrana y los factores de transcripción. Una de las mayores ventajas de la termoforesis a microescala es que funciona en una variedad de tampones y tolera la presencia de detergentes y micelas en el sistema. Karen Stefka, bióloga de mi laboratorio, demostrará la técnica. Para comenzar, lave brevemente las células con solución salina tamponada con fosfato fría o PBS, utilizando 10 mililitros de tampón por matraz T 75.

Mantenga las células en hielo durante cinco minutos o hasta que comiencen a desprenderse del frasco. Raspe las células con el raspador celular para desprenderlas, si es necesario. Re suspenda las células en 10 mililitros de PBS frío con hielo y transfiera a un tubo cónico de centrífuga redondo de 14 mililitros previamente enfriado.

Centrifugar las células a 400-600 G y cuatro grados Celsius durante cinco minutos para obtener el sedimento. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 200 microlitros de tampón de lisis frío con hielo. Transferir la suspensión a un tubo einor de 1,5 mililitros previamente enfriado para la extracción de proteínas citosólicas.

Coloque las células en hielo para minimizar el sobrecalentamiento local y lisar las células con tres pulsos de diez segundos de sonicación al 30 % de amplitud. Utilice una punta previamente enfriada de dos a tres milímetros y mantenga la punta por debajo de la superficie para minimizar la formación de espuma. Omita este paso cuando utilice un tampón que contenga detergente e incube en hielo durante 30 minutos.

En cambio, corrija la solución de lisado para que contenga una concentración fisiológica de sal de 100 milimolar de cloruro de sodio, si es necesario, a partir de una solución stock de cinco molar de cloruro de sodio. Finalmente, recoja los lisados mediante centrifugación a aproximadamente 25.000 Gs y cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Seleccione la fuente de excitación de diodo emisor de luz o LED con una longitud de onda igual a 470 nanómetros en el instrumento de MST.

Cargue los capilares con extracto celular diluido dos y diez veces con tampón MST y colóquelos en el instrumento MST. Realice la operación de búsqueda de capilares en el software de control del instrumento MST. El rango de fluorescencia óptimo en el lisado diluido es de 400 a 1500 unidades de fluorescencia.

Proceda a determinar el rango de concentración óptimo del ligando según se describe en el protocolo escrito. Coloque una gradilla para tubos con el número necesario de tubos de centrífuga de baja unión de 0,5 mililitros sobre hielo; agregue por pipeta 25 microlitros de tampón MST en el fondo de cada tubo y añada 25 microlitros de la solución stock del ligando al primer tubo, luego realice una dilución seriada al doble usando el resto de los tubos. Mantenga la gradilla con las muestras de ligando sobre hielo.

Calcule la dilución del lisado celular para obtener el nivel óptimo de la proteína diana fluorescente en las reacciones de unión. La concentración final de proteína debe estar cercana a la constante esperada de disociación de unión o ser inferior, y debe ajustarse para obtener el número necesario de cuentas de fluorescencia. En la solución final, proceda a diluir el lisado celular con tampón MST.

Coloque tubos de 0,5 mililitros de baja unión en la rejilla para tubos, enfrente de los tubos con muestras de dilución seriada del ligando. Añada cuidadosamente 15 microlitros del lisado celular en el fondo de cada tubo. Evite tocar las paredes del tubo para prevenir la pérdida de muestra.

Añada 15 microlitros de la muestra del ligando con la mayor concentración al tubo correspondiente. Número uno, con el lisado celular. Mezcle bien y cambie la punta de la pipeta.

Repita este paso con el resto de los tubos, excepto con el último, que no debe contener ligando. Añada 15 microlitros de tampón MST al último tubo y mezcle. Llene aproximadamente dos tercios de la primera capilar con la mezcla de unión del tubo número uno.

Inclínelo para mover la solución hacia el centro y coloque el capilar en la bandeja de capilares en la posición número uno. Repita este paso con el resto de los capilares. Los extremos de los capilares pueden taparse con cera para experimentos más largos.

Coloque la bandeja dentro del instrumento de MST y cierre la puerta del instrumento. A continuación, seleccione la fuente de excitación LED con una longitud de onda igual a 470 nanómetros. En el instrumento de MST, ejecute el comando de búsqueda de capilares para permitir que el instrumento encuentre las posiciones exactas de los capilares y mida la fluorescencia de las muestras según la intensidad de la señal fluorescente.

Ajuste la potencia del LED para llevarla al intervalo de 400 a 1500 unidades. Haga clic en el botón de inicio para realizar el experimento de Resistencia Térmica. Puede seleccionarse más de una potencia de láser infrarrojo para el experimento.

Para encontrar el gradiente de temperatura óptimo para el sistema particular, se necesitan de 10 a 12 minutos para ejecutar un conjunto de 16 capilares. Recolecte datos de dos o tres ejecuciones para el mismo conjunto de capilares para asegurar la reproducibilidad de las mediciones. Para comenzar el análisis de datos, abra el software de análisis y cargue la carpeta del proyecto.

En el visor de ejecución de información que aparece, seleccione las curvas termorreticulares recopiladas a una potencia específica del láser de infrarrojo. Había una opción para abrir todas las trazas termorreticulares recopiladas bajo diversas condiciones de una vez, y luego elegir cualquier curva para su análisis activándolas o desactivándolas. En la ventana del gráfico de puntos de evaluación, seleccione la termorresistencia o la termoforesis con las líneas azul y roja de salto de T.

Defina dos regiones de las curvas experimentales que se seleccionan manualmente para el análisis por el software. Asegúrese de que las líneas azul y roja estén posicionadas correctamente para proporcionar el cambio máximo en Thermo Resis. Para obtener los puntos promediados con desviaciones estándar, seleccione usar promedio o distinguir ejecuciones para corridas separadas.

Para trazar un ajuste de la constante de disociación, seleccione usar el promedio, ingrese y fije el valor de la concentración de la molécula marcada y ajuste la curva. La constante de disociación de unión o valor de KD con su desviación estándar aparece en una ventana emergente de información separada. Guarde los datos del ajuste promedio en un archivo de texto y transfiera a Excel.Heck.

Células 293 que expresan STAT3-GFP se utilizaron como fuente de stat tres marcado con fluorescencia. Para un ensayo de unión al ADN, la unión de oligonucleótidos altamente cargados provocó cambios significativos en la movilidad de stat tres. En el gradiente de temperatura.

La señal térmica se representa como una función de la concentración de oligonucleótidos. Cada punto de datos representa la media de tres mediciones. Se utilizó el software de análisis nano temporal para ajustar los datos y determinar los valores aparentes de KD.

Las constantes aparentes de disociación fueron de 37,9 ± 1,0 micromolar para la unión al motivo gas y de 23,3 ± 0,6 micromolar para la unión al oligonucleótido rico en A-T s más 100. Sorprendentemente, las secuencias s más 100 mostraron una unión ligeramente más fuerte que gas. En tres repeticiones de la medición, la sustitución de A por G provocó una disminución drástica en la afinidad del mutante s más 100 uno.

Aunque el mutante s más 100 dos no mostró unión detectable, lo que confirma la unión selectiva de secuencia de STAT tres a s más 100. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de dos horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las condiciones óptimas para la extracción de proteínas de membrana variarán según la proteína y generalmente requerirán una optimización. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la afinidad de unión de una proteína a una secuencia sin necesidad de purificar la proteína a partir del lisado celular.