Purificación de proteínas libre de Método de Determinación afinidad de unión por termoforesis Microscale

El objetivo general de este procedimiento es determinar la afinidad de unión de la interacción de un ligando de proteína sin purificar la proteína de un lisado celular. Esto se logra expresando primero la proteína fusionada GFP de interés en cualquier línea celular adherente. Después de la preparación del lisado celular y las diluciones de ligandos, las mezclas de ligandos de lisado celular se preparan y se cargan en los capilares.

A continuación, se mide la termorresis de la proteína fusionada con GFP en presencia de concentraciones variables de ligando. El paso final es el análisis de datos de mediciones de termoaféresis o MST a microescala. En última instancia, la termorresis a microescala se utiliza para determinar las afinidades de unión de las interacciones entre las proteínas fusionadas con GFP y varios ligandos.

La principal ventaja de esta técnica de métodos existentes como la titulación, la calorimetría o la mononucleosis de plasma de superficie, es que evita la purificación de proteínas, simplificando y acelerando significativamente la caracterización cuantitativa de las interacciones binarias. Este método presenta ventajas significativas cuando se trabaja con proteínas que son difíciles de expresar y purificar, como las proteínas de membrana y los factores de transcripción. Una de las mayores ventajas de la termoféresis a microescala es que funciona en una variedad de tampones y tolera la presencia de detergentes y mis células en el sistema. La demostración de la técnica estará a cargo de Karen Stefka, bióloga de mi laboratorio. Para comenzar, lave las células brevemente con solución salina tamponada con fosfato helado o PBS usando 10 mililitros de tampón por matraz T 75.

Mantenga las células en hielo durante cinco minutos o hasta que comiencen a desprenderse del matraz. Raspe las células con el raspador de células para separarlas si es necesario. Vuelva a suspender las celdas en 10 mililitros de PBS helado y transfiéralas a un tubo de centrífuga de fondo redondo de 14 mililitros preenfriado.

Granular las células por centrifugación a 400 a 600 Gs y cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en 200 microlitros de tampón de lisis helado. Transfiera la suspensión a un tubo einor preenfriado de 1,5 mililitros para la extracción de proteínas citosólicas.

Coloque las células en hielo para minimizar el sobrecalentamiento local y aplique a las células pulsos de sonicación tres veces diez segundos al 30% de amplitud. Con una punta de preenfriamiento de dos a tres milímetros, mantenga la punta debajo de la superficie para minimizar la formación de espuma. Omita este paso cuando use un tampón que contenga detergente e incube en hielo durante 30 minutos.

En su lugar, corrija la solución de lisado para que contenga una concentración de sal fisiológica de cloruro de sodio de 100 milimolares si es necesario a partir de una solución madre de cloruro de sodio de cinco molares. Por último, recoja los lisados por centrifugación a unos 25.000 Gs y cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Seleccione el diodo emisor de luz o la fuente de excitación LED con una longitud de onda igual a 470 nanómetros en el instrumento MST.

Cargue los capilares con extracto celular diluido dos y 10 veces con tampón MST y colóquelos en el instrumento MST. Realice la operación de búsqueda de capilares en el software de control del instrumento MST. El rango óptimo de fluorescencia en el lisado diluido es de 400 a 1500 unidades de fluorescencia.

Proceda a determinar el rango óptimo de concentración de ligando como se describe en el protocolo de texto. Coloque una gradilla de tubos con el número necesario de tubos de centrífuga de bajo enlace de 0,5 mililitros en una pipeta de hielo, 25 microlitros de tampón MST en el fondo de cada tubo a 25 microlitros de la solución madre del ligando en el primer tubo y realice una dilución doble en serie del ligando utilizando el resto de los tubos. Mantenga la rejilla con muestras de ligandos en hielo.

Calcule la dilución del lisado celular para obtener el nivel óptimo de la proteína diana fluorescente en las reacciones de unión. La concentración final de proteínas debe estar cerca de la constante de disociación de unión esperada o ser menor, y debe ajustarse para obtener el número necesario de recuentos de fluorescencia. En la solución final, proceda a diluir el lisado celular con MST Buffer.

Coloque los tubos de baja unión de 0,5 mililitros en la gradilla de tubos frente a los tubos con muestras de dilución en serie de ligandos. Agregue con cuidado 15 microlitros del lisado celular al fondo de cada tubo. Trate de no tocar las paredes del tubo para evitar la pérdida de muestra.

Añadir 15 microlitros de la muestra de ligando con la concentración más alta al tubo correspondiente. Número uno, con el lisado celular. Mezclar bien y cambiar la punta de la pipeta.

Repite este paso con el resto de los tubos excepto el último, que no debe contener ligando. Agregue 15 microlitros de tampón MST al último tubo y mezcle. Llene aproximadamente dos tercios del primer capilar con la mezcla aglutinante del tubo número uno.

Inclínelo para mover la solución hacia el centro y coloque el capilar en la bandeja capilar a la posición. Número uno, repite este paso con el resto de los capilares. Los extremos capilares se pueden taponar con cera para experimentos más largos.

Coloque la bandeja dentro del instrumento MST y cierre la puerta del instrumento. A continuación, seleccione la fuente de excitación LED con una longitud de onda igual a 470 nanómetros. En el instrumento MST, realice el comando de búsqueda de capilares para permitir que el instrumento encuentre las posiciones exactas de los capilares y mida la fluorescencia de las muestras en función de la intensidad de la señal fluorescente.

Ajuste la potencia del LED para llevarlo al intervalo de 400 a 1500 unidades. Haga clic en el botón de inicio para realizar el experimento Thermo Resis. Se puede elegir más de una potencia de láser infrarrojo para el experimento.

Con el fin de encontrar el gradiente de temperatura óptimo para el sistema en particular, se necesitan de 10 a 12 minutos para hacer funcionar un conjunto de 16 capilares. Recopile datos de dos a tres corridas para el mismo conjunto de capilares para garantizar la reproducibilidad de las mediciones. Para comenzar el análisis de datos, abra el software de análisis y cargue la carpeta del proyecto.

En la información que aparece, seleccione el visor de ejecución recopilado en una potencia láser IR específica curvas termorreticadas. Existía la opción de abrir todas las trazas termorretéticas recogidas en varias condiciones a la vez, y luego elegir las curvas para el análisis activándolas y desactivándolas. En la ventana del gráfico de puntos de evaluación, seleccione la termorresis o la termoféresis con las líneas azul y roja del salto en T.

Defina dos regiones de las curvas experimentales que el software selecciona manualmente para el análisis. Asegúrese de que las líneas azul y roja estén colocadas correctamente para proporcionar el cambio máximo en Thermo Resis. Para obtener los puntos promediados con desviaciones estándar, seleccione usar promedio o distinguir corridas para corridas separadas.

Para trazar un ajuste de la constante de disociación, seleccione usar promedio, ingrese y fije el valor de concentración de molécula marcada y ajuste la curva. La constante de disociación de enlace o el valor KD con su desviación estándar aparece en una ventana emergente de información separada. Guarde los datos de ajuste promedio en un archivo de texto y transfiéralos a Excel.Heck.

Se utilizaron 2 9 3 células que expresan STAT 3G FP como fuente de stat three marcado con fluorescencia. Para el ensayo de unión al ADN, la unión de oligonucleótidos altamente cargados dio lugar a cambios significativos en la movilidad de STAT tres. En el gradiente de temperatura.

La señal termorretética se representa gráficamente en función de la concentración de oligonucleótidos. Cada punto de datos representa la media de tres mediciones. Se utilizó un software de análisis nanotemporal para ajustar el y determinar los valores aparentes de KD.

Las constantes de disociación aparentes fueron de 37,9 más o menos 1,0 micromolar para unirse al motivo gaseoso, y de 23,3 más o menos 0,6 micromolares para unirse al oligonucleótido rico s más 100. Sorprendentemente, las secuencias s s más 100 mostraron una unión ligeramente más estrecha que el gas. En tres repeticiones de medición, la sustitución de A a G resultó en una disminución drástica en la afinidad del mutante s más 100.

Mientras que el mutante s más 100 dos no mostró una unión detectable, lo que confirma la unión selectiva de la secuencia de STAT tres a s más 100 Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de dos horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las condiciones óptimas para la extracción de proteínas de membrana diferirán para diferentes proteínas y, por lo general, requieren optimización. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo determinar la afinidad de unión de una proteína a una elegante sin purificar la proteína de la célula. Lisado.