Purificación de proteínas basada en cromatografía de afinidad de níquel: una técnica para purificar proteínas recombinantes marcadas con polihistidina a partir de lisado de células bacterianas

Para purificar la proteína recombinante fusionada con la etiqueta de polihistidina, una cadena de residuos de histidina en un extremo, de un lisado de células bacterianas, primero diluya el lisado celular para evitar la obstrucción de la columna durante la ejecución cromatográfica.

Ensamble una columna de afinidad que contenga cationes de níquel divalentes inmovilizados en una matriz de perlas de agarosa utilizando ácido nitrilotriacético, un agente quelante. El ácido nitrilotriacético se une a cationes de níquel a través de cuatro sitios covalentes coordinados, mientras que dos sitios en el ion metálico permanecen disponibles para interacciones con etiquetas de polihistidina en la proteína de interés.

Equilibre la columna con un tampón adecuado para optimizar las condiciones para interacciones efectivas entre metales y proteínas. Cargue el lisado de celdas en la columna.

Las proteínas recombinantes, que transportan residuos de histidina terminales accesibles, forman enlaces de coordinación con cationes de níquel debido a la alta afinidad del ion metálico por el imidazol, la cadena lateral de la histidina, y se unen a la matriz. El alto número de histidinas consecutivas en la prote