Purificación de proteínas basada en cromatografía de afinidad de níquel: una técnica para purificar proteínas recombinantes marcadas con polihistidina a partir de lisado de células bacterianas

Para purificar la proteína recombinante fusionada con la etiqueta de polihistidina, una cadena de residuos de histidina en un extremo, de un lisado de células bacterianas, primero diluya el lisado celular para evitar la obstrucción de la columna durante la ejecución cromatográfica.

Ensamble una columna de afinidad que contenga cationes de níquel divalentes inmovilizados en una matriz de perlas de agarosa utilizando ácido nitrilotriacético, un agente quelante. El ácido nitrilotriacético se une a cationes de níquel a través de cuatro sitios covalentes coordinados, mientras que dos sitios en el ion metálico permanecen disponibles para interacciones con etiquetas de polihistidina en la proteína de interés.

Equilibre la columna con un tampón adecuado para optimizar las condiciones para interacciones efectivas entre metales y proteínas. Cargue el lisado de celdas en la columna.

Las proteínas recombinantes, que transportan residuos de histidina terminales accesibles, forman enlaces de coordinación con cationes de níquel debido a la alta afinidad del ion metálico por el imidazol, la cadena lateral de la histidina, y se unen a la matriz. El alto número de histidinas consecutivas en la proteína recombinante fortalece su unión a la matriz.

En comparación, las proteínas que carecen de residuos de histidina no se adhieren a la columna y eluyen en el flujo. Lave la columna con tampón de imidazol de baja concentración.

El imidazol compite con contaminantes proteicos débilmente unidos que pueden haberse adherido inespecíficamente a la matriz a través de residuos de histidina en su cadena polipeptídica, desplazándolos y facilitando la elución. Lave la columna con tampón de imidazol altamente concentrado para disociar las proteínas recombinantes marcadas con histidina fuertemente unidas del quelato de iones de níquel, eluyéndolas en el flujo.

Recolecte la fracción de proteína recombinante purificada para su posterior análisis.

Comience este protocolo con una sobreexpresión inducible de una proteína marcada con histidina como se describe en el protocolo de texto. Preparar 1 mililitro de resina de Ácido Nitriloacético de Níquel en una columna de gravedad, para purificar la proteína. El día antes de su uso, equilibre la columna durante la noche a 4 grados centígrados con 2 mililitros de tampón de equilibrio.

Al día siguiente, lleve la columna de 4 grados centígrados a temperatura ambiente, antes de cargar el lisado clarificado, y déjela reposar durante aproximadamente dos o tres horas. Luego, vuelva a suspender el gránulo en el tampón de lisis.

Sonica las células en hielo durante intervalos de 10 veces 10 segundos, haciendo una pausa de 30 segundos entre pulsos. Aclarar el lisado por centrifugación a 3080 x g durante 30 minutos a 4 grados centígrados utilizando una microcentrífuga.

Prepare el lisado clarificado con volúmenes iguales de tampón de lisis, luego, aplique el lisado clarificado preparado a la columna y recoja el flujo continuo. Vuelva a aplicar el flujo de lisado clarificado a la columna y recoja el flujo secundario.

Luego, lave la columna con 5 mililitros de tampón de lavado # 1 y recoja el flujo. Lave la columna nuevamente con 5 mililitros de tampón de lavado # 2 y recoja el flujo. Ahora, aplique 2 mililitros de tampón de elución. Recoge el flujo continuo en dos fracciones de 1 mililitro cada una.