Name: Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprende a estimular mecánicamente nematodos inmovilizados mediante un dispositivo de microfluidos para imagen de alta resolución de respuestas neuronales en C. elegans. Este método avanza la investigación en mecanobiología.

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Agradecemos a Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli de Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty y Verónica Sánchez por apoyan en la generación de animales mutantes y diseño del dispositivo. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de NIH R01EB006745 (Para BLP), R01NS092099 (a MBG), K99NS089942 (de MK), F31NS100318 (a ALN) y recibió financiación del Consejo Europeo de investigación (ERC) bajo investigación horizonte 2020 de la Unión Europea y la innovación programa () otorgar el acuerdo no. 715243 a MK).

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo muestra un método para entregar precisa estimulación mecánica sobre la piel de un ascáride atrapado en un chip de microfluidos. Se pretende facilitar la integración de los estímulos físicos para responder a cuestiones biológicas y pretende agilizar investigación mecanobiología en laboratorios biológicos. Este método amplía análisis anteriores para evaluar la función de mechanosensory neuronas en C. elegans. Técnicas cuantitativas y semi cuantitativas anteriores miden fuerzas1</su...

El sentido del tacto ofrece animales información crucial acerca de su entorno. Dependiendo de la fuerza aplicada, touch es percibida como inocua, placentera o dolorosa. La deformación del tejido durante el tacto es detectada por células especializadas mechanoreceptor incrustadas en la piel que expresan proteínas del receptor, comúnmente canales del ion. Los pasos a fuerza de percepción a la activación de canal de iones durante el tacto y el dolor no se entienden completamente. Menos aún se sabe sobre cómo el tejido de la piel filtros de deformación mecánica y si mecanorreceptores detectan cambios en la tensión o estrés1,2,3. Esta brecha en la comprensión se presenta, en parte, de la falta de herramientas adecuadas para aplicar estímulos mecánicos precisos a la superficie de la piel de un animal vivo observando las respuestas a nivel celular. Mientras que la microscopía de fuerza atómica se ha utilizado extensivamente para aplicar y medir fuerzas en células aisladas4,5 y activan los receptores Piezo1 en la vida de las células6, experimentos similares usando animales vivos, especialmente C. elegans, han sido notoriamente difícil debido a la movilidad intrínseca del sujeto. Este desafío es eludido tradicionalmente mediante el uso de pegamento del cianocrilato de grado quirúrgico o veterinario para inmovilizar animales individuales en agar cojines1,7,8,9. Este enfoque ha sido productivo, pero tiene limitaciones relacionadas con la habilidad necesaria para la inmovilización por encolado y la superficie del agar suave sobre el cumplimiento de la mecánica. Una estrategia de la microfluídica es una alternativa gratuita que evita algunas de las complicaciones vinculadas a pegar.
El nematodo C. elegans es un organismo modelo genético con un sistema nervioso completamente asignado que, debido al tamaño del animal, es un buen ajuste para la tecnología de microfluídica. Dispositivos de microfluidos ofrece la ventaja que los animales lo contrario extremadamente móviles pueden ser refrenados mientras se realiza la proyección de imagen de alta resolución y entrega de los estímulos neuro-modulador pertinentes. Con la ayuda de microfluidos tecnologías, animales vivos pueden ser inmovilizadas sin daño10,11, que permite el monitoreo de la actividad conductual sobre la vida de12,13 y alta resolución proyección de imagen de la actividad neuronal14,15,16,17. Además, muchas neuronas de mechanoreceptor necesarias para el sentido del tacto y del dolor puede ser caracterizado en su fisiológico1,8, mecánico4,18,19y molecular nivel20,21,22.
C. elegans detecta estímulos mecánicos suaves a la pared del cuerpo usando seis TRNs, tres de los cuales inervan el animal anterior (ALML más baja/R y AVM) y tres de los cuales inervan la parte posterior del animal (PLML/R y PVM). Las moléculas de canal de iones necesarias para la transducción de una fuerza aplicada en una señal bioquímica se han estudiado ampliamente en su TRNs8. Este artículo presenta una plataforma de microfluidos23 que permite a los investigadores a aplicar fuerzas mecánicas precisas a la piel de un inmovilizado de C. elegans ascáride, mientras leía a la deformación de los tejidos internos por proyección de imagen óptica. Además de presentar estímulos mecánicos bien definidos, transitorios de calcio pueden ser grabados en las neuronas mechanoreceptor con resolución subcelular y correlacionados con características morfológicas y anatómicas. El dispositivo consta de un canal central reventado que tiene un solo animal y presenta su piel junto a seis canales de accionamiento neumático (figura 1 y figura 2). Los seis canales se colocan a lo largo del canal de captura para entregar estímulos mecánicos a cada uno de seis TRNs del gusano. Estos canales están separados de la cámara de captura por finas membranas PDMS, que pueden ser impulsados por una fuente de presión de aire externa (figura 1). Calibrado de la desviación con respecto a la presión y proporcionar las medidas en este artículo. Cada actuador puede ser abordado individualmente y utilizado para estimular la mechanoreceptor de elección. La presión se suministra con una bomba de presión piezo-conducido pero puede utilizarse cualquier dispositivo alternativo. Mostramos que el protocolo de presión puede utilizarse para activar TRNs en vivo y demostrar funcionamiento dispositivos adecuados para entregar estímulos mecánicos para adultos C. elegans, carga de animales adultos en dispositivos, realizar proyección de imagen del calcio experimentos y analizar los resultados. Fabricación de dispositivo consta de dos pasos principales: 1) Fotolitografía para hacer un molde de SU-8; y 2) PDMS para hacer un dispositivo de moldeo. Aras de la brevedad y claridad, los lectores se conocen previamente publicados artículos y protocolos24,25 para obtener instrucciones sobre cómo producir los moldes y dispositivos.

<table><tbody><tr><td>Máscara de cromo</td><td>Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td><td></td><td>5'', diseñada en AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Mascarilla</td><td>cromada Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td><td></td><td>5'', diseñada en AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Mascarilla cromada</td><td>Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/</td><td></td> <td>5'', diseñada en AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Oblea de silicio de 4 '' (prueba B)</td><td>Instalación</td><td></td><td></td>de nanofabricación de Stanford</tr><tr><td>SU-8 2002</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador de exposición</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>OAI 150</td><td></td></tr><tr><td>Controlador</td> <td>de iluminaciónOptical Associates, Inc</td><td>2105C2</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 revelador</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426F-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>Triclorometilsilano (TCMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92361-500ML</td><td>Precaución: TCMS es tóxico y reactivo al agua</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastómero</td><td>Dow Prepolímero Corning</td><td></td><td>PDMS</td></tr><tr><td>Punzón de biopsia, 1 mm</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>Plasma de oxígeno Asher</td><td>Branson/IPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo metálico pequeño (0,635 mm de diámetro exterior, 0,4318 mm de diámetro interior, 12,7 mm de largo); tamaño de calibre 23TW</td><td>New England Small Tube Corporation</td><td>NE-1300-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa Nalgene, 0,22 &mu; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>725-2520</td><td>para filtrar toda la solución, las partículas pequeñas obstruirían el chip</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno; 0,9652 mm de diámetro exterior, 0,5842 mm de diámetro interno</td><td>Solomon Scientific</td><td>Jeringa BPE-T50</td><td></td></tr><tr><td>, 1 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309628</td><td>para atrapar y liberar lombrices</td></tr><tr><td>Jeringa, 20 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309661</td><td>para flujo basado en la gravedad</td></tr><tr><td>Gilson Minipuls 3, Peristáltico bomba</td><td>Gilson</td><td></td><td>para succionar soluciones y gusanos del chip</td></tr><tr><td>Controlador de flujo microfluídico, equipado con 0&ndash; Canal de presión de 800 kPa</td><td>Suministro de presión</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td></tr><tr><td>Tubo de poliuretano transparente resistente al agua, 4 mm de diámetro interno y 6 mm de diámetro exterior</td><td>Conexión McMaster-Carr</td><td>5195 T52</td><td>del aire de la casa a la bomba</td></tr><tr><td>a presión Tubo de poliuretano transparente resistente al agua, 2,6 mm de diámetro interno y 4 mm de diámetro exterior</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T51</td><td>Conecte la bomba de presión a un tubo pequeño</td></tr><tr><td>Racor de tubo push-to-connect para aire</td><td>McMaster-Carr</td><td>5111K468</td><td>métrico - convertidor imperial</td></tr><tr><td>Conector recto para 6 mm y veces; 1/4&Prime; Tubo OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5779 K258</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI 4000 B Sistema de microscopía</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63&times;/1.32 NA HCX PL APO objetivo de aceite</td><td>Leica</td><td>506081</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CMOS digital Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT Hamamatsu</td><td></td><td>C11440-42U</td><td></td></tr><tr><td>Lumencor Spectra X motor de luz</td><td>Lumencor</td><td></td><td>Con fuente de luz cian y verde/amarilla</td></tr><tr><td>Divisor de haz de excitación</td><td>Chroma</td><td>59022bs</td><td>en el microscopio</td></tr><tr><td>Hamamatsu W-view Gemini Óptica de división de imagen</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>para dividir la emisión verde y roja y proyectarlas en diferentes áreas en el chip de la cámara</td></tr><tr><td>Divisor de haz de emisión</td><td>Chroma</td><td>T570lpxr</td><td>en el divisor de imagen</td></tr><tr><td>Filtros de emisión GCamp6s</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>en el divisor de imagen</td></tr><tr><td>Filtros de emisión mCherry</td><td>Chroma</td><td>ET632/60m</td><td>en el divisor de imagen</td></tr></tbody></table>

usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de c. elegans

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Un objetivo central de la mecanobiología es entender el efecto recíproco del estrés mecánico sobre las proteínas y las células. A pesar de su importancia, la influencia del estrés mecánico sobre la función celular es todavía mal entendida. En parte, esta brecha de conocimiento existe porque algunas herramientas permiten deformación simultánea de tejidos y células, la proyección de imagen de la actividad celular en los animales vivos y eficiente de movilidad en organismos modelo lo contrario altamente móviles, tales como el nematodo Elegans de Caenorhabditis. El tamaño pequeño de C. elegans hace un excelente partido a los dispositivos de investigación basada en microfluídica, y se presentan soluciones para la inmovilización con dispositivos microfluídicos. Aunque estos dispositivos permiten obtener imágenes de alta resolución, el animal está completamente dentro de polidimetilsiloxano (PDMS) y el vidrio, limita el acceso físico para la entrega de fuerza mecánica o las grabaciones electrofisiológicas. Recientemente, hemos creado un dispositivo que integra los actuadores neumáticos con un diseño de captura compatible con microscopía de fluorescencia de alta resolución. El canal de actuación se separa del canal atrapa el gusano por una delgada membrana PDMS. Este diafragma se encuentra en el lado de un gusano aplicando presión desde una fuente externa. El dispositivo puede dirigirse a las neuronas individuales mechanosensitive. La activación de estas neuronas es fotografiada en alta resolución con indicadores calcio codificados genéticamente. Este artículo presenta el método general utilizando cepas de C. elegans expresando su indicador de actividad de calcio-sensible (GCaMP6s) en sus neuronas de receptor del tacto (TRNs). El método, sin embargo, no se limita a TRNs ni sensores de calcio como una punta de prueba, pero puede ser ampliado a otras células mecánicamente sensibles o sensores.

Litografía de SU-8 y la vinculación de la viruta El protocolo de litografía y moldeado de PDMS siguen los procedimientos estándar. Detalles pueden encontrarse en otros lugares23,24,25,26. El PDMS debe despegarse de la ostia sin problemas después de curar. Si las características de SU-8 rip off durante la peladura de PDMS, la capa de adherenci...

Nuevas herramientas para la investigación de la mecanobiología se necesitan entender cómo mecánico estrés activa vías bioquímicas y produce respuestas biológicas. Aquí, nos muestra un nuevo método de estimulación mecánica selectiva de animales inmovilizados con una trampa de microfluidos que permite proyección de imagen de alta resolución de las respuestas celulares.

Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

El objetivo general de esta técnica es medir cómo los nematodos y sus neuronas responden a los estímulos mecánicos externos utilizando una configuración de chip microfluídico con actuadores de presión. Este método puede responder a preguntas clave en los campos de la mecanobiología y la biología sensorial, como la forma en que las células, los tejidos y los animales responden a la estimulación mecánica. La principal ventaja de esta técnica es que reduce lo suficiente la movilidad del gusano de forma no invasiva para permitir la obtención de imágenes de alta resolución sin dejar de tener acceso a la cutícula del gusano para la estimulación mecánica.Este método también se puede utilizar para estudiar la influencia de las señales mecánicas en el desarrollo. Incluso podría aplicarse a otros sistemas como la exposición de órganos ex vivo u otros animales de tamaño similar al C. Elegans. Configure un sistema de microscopio para la excitación simultánea de GCaMP y RFP.Una opción es una fuente de luz discreta que transmita solo luz cian y amarilla. Para la visualización, utilice un objetivo de 10 aumentos y un objetivo de gran aumento. Además, envíe la imagen a una computadora a través de

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Un dispositivo microfluídico simple ha sido desarrollado para realizar anestésico...

Simples dispositivos de microfluidos para<em&gt; In vivo</em&gt; Imágenes de<em&gt; C. elegans</em&gt;,<em&gt; Drosophila</em&gt; Y pez cebra

Los investigadores pueden desencadenar el movimiento a demanda en C. elegans mediante la aplicación de un campo eléctrico que los gusanos detectan y responden. Este video presenta el comportamiento electrotáctico y muestra un protocolo de muestra que se realiza en un dispositivo microfluídico.

Ensayo de electrotaxis: un método para observar la locomoción en C. elegans

Un método de micro-electro-fluido semi-automático para inducir la locomoción en la demanda...

Electrotaxis microfluidos basados ​​en On-Demand Análisis cuantitativo de<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

El uso de un chip olfativo de"adaptado" para la proyección de imagen del calcio eficiente de los machos de C. elegans se describe aquí. También se muestran estudios de exposición masculina a glicerol y una feromona.

Usando un Chip de microfluidos adaptado olfativo para la proyección de imagen de la actividad Neuronal en respuesta a las feromonas en las neuronas de cabeza de macho de C. Elegans

En este artículo demostramos en proyección de imagen de gusanos individuales empleando un dispositivo de microfluidos personalizado. En el dispositivo, gusanos varios individualmente se limitan para separar compartimientos, lo que permite vigilancia longitudinal multiplexada de varios procesos biológicos.

Una plataforma de microfluidos para la proyección de imagen Longitudinal en Caenorhabditis elegans

Se ha establecido una serie de métodos de inmovilización para permitir la irradiación dirigida de vivo Caenorhabditis elegans individuos utilizando un microfluídicos polidimetilsiloxano ultrafino recientemente desarrollados de la viruta con retención de agua. Esta novela inmovilización de la en-viruta también es adecuado para observaciones de imágenes. El tratamiento detallado y ejemplos de aplicación de la viruta se explican.

Inmovilización de personas en Caenorhabditis elegans con un Chip de microfluidos polidimetilsiloxano ultra-delgada de retención de agua

El protocolo describe un diseño simple de chip microfluídico y una metodología de microfabricación utilizada para cultivar C. elegans en presencia de un suministro continuo de alimentos durante hasta 36 h. El dispositivo de crecimiento e imágenes también permite obtener imágenes intermitentes de alta resolución a largo plazo de procesos celulares y subcelulares durante el desarrollo durante varios días.

Un chip microfluídico simple para el crecimiento a largo plazo y la obtención de imágenes de Caenorhabditis elegans

El presente protocolo describe el diseño, fabricación y caracterización de un sistema microfluídico capaz de alinear, inmovilizar y comprimir con precisión cientos de embriones de Drosophila melanogaster con una intervención mínima del usuario. Este sistema permite obtener imágenes de alta resolución y recuperar muestras para el análisis posterior a la estimulación y se puede escalar para adaptarse a otros sistemas biológicos multicelulares.

Mecanoestimulación de organismos multicelulares mediante un sistema de compresión microfluídica de alto rendimiento

Este protocolo describe la obtención de imágenes de lapso de tiempo de C. elegans basadas en microfluidos a lo largo de todo el desarrollo postembrionario.

Imágenes de alta resolución de C. elegans en todas las etapas larvales

Ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico C. elegans Modelo

Aprende a estimular mecánicamente nematodos inmovilizados mediante un dispositivo de microfluidos para imagen de alta resolución de respuestas neuronales en C. elegans. Este método avanza la investigación en mecanobiología.

Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans

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