Name: Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprende a estimular mecánicamente nematodos inmovilizados mediante un dispositivo de microfluidos para imagen de alta resolución de respuestas neuronales en C. elegans. Este método avanza la investigación en mecanobiología.

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Agradecemos a Sandra N. Manosalvas-Kjono, Ladpli de Purim, Farah Memon, Divya Gopisetty y Verónica Sánchez por apoyan en la generación de animales mutantes y diseño del dispositivo. Esta investigación fue apoyada por subvenciones de NIH R01EB006745 (Para BLP), R01NS092099 (a MBG), K99NS089942 (de MK), F31NS100318 (a ALN) y recibió financiación del Consejo Europeo de investigación (ERC) bajo investigación horizonte 2020 de la Unión Europea y la innovación programa () otorgar el acuerdo no. 715243 a MK).

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo muestra un método para entregar precisa estimulación mecánica sobre la piel de un ascáride atrapado en un chip de microfluidos. Se pretende facilitar la integración de los estímulos físicos para responder a cuestiones biológicas y pretende agilizar investigación mecanobiología en laboratorios biológicos. Este método amplía análisis anteriores para evaluar la función de mechanosensory neuronas en C. elegans. Técnicas cuantitativas y semi cuantitativas anteriores miden fuerzas1</su...

El sentido del tacto ofrece animales información crucial acerca de su entorno. Dependiendo de la fuerza aplicada, touch es percibida como inocua, placentera o dolorosa. La deformación del tejido durante el tacto es detectada por células especializadas mechanoreceptor incrustadas en la piel que expresan proteínas del receptor, comúnmente canales del ion. Los pasos a fuerza de percepción a la activación de canal de iones durante el tacto y el dolor no se entienden completamente. Menos aún se sabe sobre cómo el tejido de la piel filtros de deformación mecánica y si mecanorreceptores detectan cambios en la tensión o estrés1,2,3. Esta brecha en la comprensión se presenta, en parte, de la falta de herramientas adecuadas para aplicar estímulos mecánicos precisos a la superficie de la piel de un animal vivo observando las respuestas a nivel celular. Mientras que la microscopía de fuerza atómica se ha utilizado extensivamente para aplicar y medir fuerzas en células aisladas4,5 y activan los receptores Piezo1 en la vida de las células6, experimentos similares usando animales vivos, especialmente C. elegans, han sido notoriamente difícil debido a la movilidad intrínseca del sujeto. Este desafío es eludido tradicionalmente mediante el uso de pegamento del cianocrilato de grado quirúrgico o veterinario para inmovilizar animales individuales en agar cojines1,7,8,9. Este enfoque ha sido productivo, pero tiene limitaciones relacionadas con la habilidad necesaria para la inmovilización por encolado y la superficie del agar suave sobre el cumplimiento de la mecánica. Una estrategia de la microfluídica es una alternativa gratuita que evita algunas de las complicaciones vinculadas a pegar.
El nematodo C. elegans es un organismo modelo genético con un sistema nervioso completamente asignado que, debido al tamaño del animal, es un buen ajuste para la tecnología de microfluídica. Dispositivos de microfluidos ofrece la ventaja que los animales lo contrario extremadamente móviles pueden ser refrenados mientras se realiza la proyección de imagen de alta resolución y entrega de los estímulos neuro-modulador pertinentes. Con la ayuda de microfluidos tecnologías, animales vivos pueden ser inmovilizadas sin daño10,11, que permite el monitoreo de la actividad conductual sobre la vida de12,13 y alta resolución proyección de imagen de la actividad neuronal14,15,16,17. Además, muchas neuronas de mechanoreceptor necesarias para el sentido del tacto y del dolor puede ser caracterizado en su fisiológico1,8, mecánico4,18,19y molecular nivel20,21,22.
C. elegans detecta estímulos mecánicos suaves a la pared del cuerpo usando seis TRNs, tres de los cuales inervan el animal anterior (ALML más baja/R y AVM) y tres de los cuales inervan la parte posterior del animal (PLML/R y PVM). Las moléculas de canal de iones necesarias para la transducción de una fuerza aplicada en una señal bioquímica se han estudiado ampliamente en su TRNs8. Este artículo presenta una plataforma de microfluidos23 que permite a los investigadores a aplicar fuerzas mecánicas precisas a la piel de un inmovilizado de C. elegans ascáride, mientras leía a la deformación de los tejidos internos por proyección de imagen óptica. Además de presentar estímulos mecánicos bien definidos, transitorios de calcio pueden ser grabados en las neuronas mechanoreceptor con resolución subcelular y correlacionados con características morfológicas y anatómicas. El dispositivo consta de un canal central reventado que tiene un solo animal y presenta su piel junto a seis canales de accionamiento neumático (figura 1 y figura 2). Los seis canales se colocan a lo largo del canal de captura para entregar estímulos mecánicos a cada uno de seis TRNs del gusano. Estos canales están separados de la cámara de captura por finas membranas PDMS, que pueden ser impulsados por una fuente de presión de aire externa (figura 1). Calibrado de la desviación con respecto a la presión y proporcionar las medidas en este artículo. Cada actuador puede ser abordado individualmente y utilizado para estimular la mechanoreceptor de elección. La presión se suministra con una bomba de presión piezo-conducido pero puede utilizarse cualquier dispositivo alternativo. Mostramos que el protocolo de presión puede utilizarse para activar TRNs en vivo y demostrar funcionamiento dispositivos adecuados para entregar estímulos mecánicos para adultos C. elegans, carga de animales adultos en dispositivos, realizar proyección de imagen del calcio experimentos y analizar los resultados. Fabricación de dispositivo consta de dos pasos principales: 1) Fotolitografía para hacer un molde de SU-8; y 2) PDMS para hacer un dispositivo de moldeo. Aras de la brevedad y claridad, los lectores se conocen previamente publicados artículos y protocolos24,25 para obtener instrucciones sobre cómo producir los moldes y dispositivos.

<table><tbody><tr><td>Máscara de cromo</td><td>Compugraphics (http://www.compugraphics-photomasks.com/)</td><td></td><td>5'', diseñada en AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Mascarilla</td><td>cromada Mitani-Micronics (http://www.mitani-micro.co.jp/en/)</td><td></td><td>5'', diseñada en AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Mascarilla cromada</td><td>Kuroda-Electric (http://www.kuroda-electric.eu/</td><td></td> <td>5'', diseñada en AutoCAD (Autodesk, Inc.)</td></tr><tr><td>Oblea de silicio de 4 '' (prueba B)</td><td>Instalación</td><td></td><td></td>de nanofabricación de Stanford</tr><tr><td>SU-8 2002</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spin-coater</td><td>Laurell Technologies</td><td>WS-400BZ-6NPP/LITE</td><td></td></tr><tr><td>Temporizador de exposición</td><td>Optical Associates, Inc</td><td>OAI 150</td><td></td></tr><tr><td>Controlador</td> <td>de iluminaciónOptical Associates, Inc</td><td>2105C2</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 revelador</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A426F-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Fisher Scientific</td><td>A18-4</td><td></td></tr><tr><td>Triclorometilsilano (TCMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92361-500ML</td><td>Precaución: TCMS es tóxico y reactivo al agua</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastómero</td><td>Dow Prepolímero Corning</td><td></td><td>PDMS</td></tr><tr><td>Punzón de biopsia, 1 mm</td><td>VWR</td><td>95039-090</td><td></td></tr><tr><td>Plasma de oxígeno Asher</td><td>Branson/IPC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo metálico pequeño (0,635 mm de diámetro exterior, 0,4318 mm de diámetro interior, 12,7 mm de largo); tamaño de calibre 23TW</td><td>New England Small Tube Corporation</td><td>NE-1300-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa Nalgene, 0,22 &mu; m</td><td>Thermo Scientific</td><td>725-2520</td><td>para filtrar toda la solución, las partículas pequeñas obstruirían el chip</td></tr><tr><td>Tubo de polietileno; 0,9652 mm de diámetro exterior, 0,5842 mm de diámetro interno</td><td>Solomon Scientific</td><td>Jeringa BPE-T50</td><td></td></tr><tr><td>, 1 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309628</td><td>para atrapar y liberar lombrices</td></tr><tr><td>Jeringa, 20 ml</td><td>BD Scientific</td><td>309661</td><td>para flujo basado en la gravedad</td></tr><tr><td>Gilson Minipuls 3, Peristáltico bomba</td><td>Gilson</td><td></td><td>para succionar soluciones y gusanos del chip</td></tr><tr><td>Controlador de flujo microfluídico, equipado con 0&ndash; Canal de presión de 800 kPa</td><td>Suministro de presión</td><td>Elveflow</td><td>OB1 MK3</td></tr><tr><td>Tubo de poliuretano transparente resistente al agua, 4 mm de diámetro interno y 6 mm de diámetro exterior</td><td>Conexión McMaster-Carr</td><td>5195 T52</td><td>del aire de la casa a la bomba</td></tr><tr><td>a presión Tubo de poliuretano transparente resistente al agua, 2,6 mm de diámetro interno y 4 mm de diámetro exterior</td><td>McMaster-Carr</td><td>5195 T51</td><td>Conecte la bomba de presión a un tubo pequeño</td></tr><tr><td>Racor de tubo push-to-connect para aire</td><td>McMaster-Carr</td><td>5111K468</td><td>métrico - convertidor imperial</td></tr><tr><td>Conector recto para 6 mm y veces; 1/4&Prime; Tubo OD</td><td>McMaster-Carr</td><td>5779 K258</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI 4000 B Sistema de microscopía</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>63&times;/1.32 NA HCX PL APO objetivo de aceite</td><td>Leica</td><td>506081</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CMOS digital Hamamatsu Orca-Flash 4.0LT Hamamatsu</td><td></td><td>C11440-42U</td><td></td></tr><tr><td>Lumencor Spectra X motor de luz</td><td>Lumencor</td><td></td><td>Con fuente de luz cian y verde/amarilla</td></tr><tr><td>Divisor de haz de excitación</td><td>Chroma</td><td>59022bs</td><td>en el microscopio</td></tr><tr><td>Hamamatsu W-view Gemini Óptica de división de imagen</td><td>Hamamatsu</td><td>A12801-01</td><td>para dividir la emisión verde y roja y proyectarlas en diferentes áreas en el chip de la cámara</td></tr><tr><td>Divisor de haz de emisión</td><td>Chroma</td><td>T570lpxr</td><td>en el divisor de imagen</td></tr><tr><td>Filtros de emisión GCamp6s</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>en el divisor de imagen</td></tr><tr><td>Filtros de emisión mCherry</td><td>Chroma</td><td>ET632/60m</td><td>en el divisor de imagen</td></tr></tbody></table>

usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de c. elegans

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

Un objetivo central de la mecanobiología es entender el efecto recíproco del estrés mecánico sobre las proteínas y las células. A pesar de su importancia, la influencia del estrés mecánico sobre la función celular es todavía mal entendida. En parte, esta brecha de conocimiento existe porque algunas herramientas permiten deformación simultánea de tejidos y células, la proyección de imagen de la actividad celular en los animales vivos y eficiente de movilidad en organismos modelo lo contrario altamente móviles, tales como el nematodo Elegans de Caenorhabditis. El tamaño pequeño de C. elegans hace un excelente partido a los dispositivos de investigación basada en microfluídica, y se presentan soluciones para la inmovilización con dispositivos microfluídicos. Aunque estos dispositivos permiten obtener imágenes de alta resolución, el animal está completamente dentro de polidimetilsiloxano (PDMS) y el vidrio, limita el acceso físico para la entrega de fuerza mecánica o las grabaciones electrofisiológicas. Recientemente, hemos creado un dispositivo que integra los actuadores neumáticos con un diseño de captura compatible con microscopía de fluorescencia de alta resolución. El canal de actuación se separa del canal atrapa el gusano por una delgada membrana PDMS. Este diafragma se encuentra en el lado de un gusano aplicando presión desde una fuente externa. El dispositivo puede dirigirse a las neuronas individuales mechanosensitive. La activación de estas neuronas es fotografiada en alta resolución con indicadores calcio codificados genéticamente. Este artículo presenta el método general utilizando cepas de C. elegans expresando su indicador de actividad de calcio-sensible (GCaMP6s) en sus neuronas de receptor del tacto (TRNs). El método, sin embargo, no se limita a TRNs ni sensores de calcio como una punta de prueba, pero puede ser ampliado a otras células mecánicamente sensibles o sensores.

Litografía de SU-8 y la vinculación de la viruta El protocolo de litografía y moldeado de PDMS siguen los procedimientos estándar. Detalles pueden encontrarse en otros lugares23,24,25,26. El PDMS debe despegarse de la ostia sin problemas después de curar. Si las características de SU-8 rip off durante la peladura de PDMS, la capa de adherenci...

Nuevas herramientas para la investigación de la mecanobiología se necesitan entender cómo mecánico estrés activa vías bioquímicas y produce respuestas biológicas. Aquí, nos muestra un nuevo método de estimulación mecánica selectiva de animales inmovilizados con una trampa de microfluidos que permite proyección de imagen de alta resolución de las respuestas celulares.

Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

El objetivo general de esta técnica es medir cómo los nematodos y sus neuronas responden a los estímulos mecánicos externos utilizando una configuración de chip microfluídico con actuadores de presión. Este método puede responder a preguntas clave en los campos de la mecanobiología y la biología sensorial, como la forma en que las células, los tejidos y los animales responden a la estimulación mecánica. La principal ventaja de esta técnica es que reduce lo suficiente la movilidad del gusano de forma no invasiva para permitir la obtención de imágenes de alta resolución sin dejar de tener acceso a la cutícula del gusano para la estimulación mecánica.Este método también se puede utilizar para estudiar la influencia de las señales mecánicas en el desarrollo. Incluso podría aplicarse a otros sistemas como la exposición de órganos ex vivo u otros animales de tamaño similar al C. Elegans. Configure un sistema de microscopio para la excitación simultánea de GCaMP y RFP.Una opción es una fuente de luz discreta que transmita solo luz cian y amarilla. Para la visualización, utilice un objetivo de 10 aumentos y un objetivo de gran aumento. Además, envíe la imagen a una computadora a través de una cámara digital.A continuación, incluya un cubo de fluorescencia y, si es necesario, un filtro de excitación. Añade un espejo dicroico al cubo que refleje la luz cian y amarilla y transmita la luz verde y roja. Configure un divisor de haz con un espejo dicroico de paso largo con un corte de 570 nanómetros.Además, proporcione un filtro de emisión de paso de banda para luz verde a 525 nanómetros con un ancho de 50 nanómetros y un filtro de emisión de paso de banda para luz roja a 632 nanómetros con un ancho de 60 nanómetros. Proyecte ambos haces en el campo de visión de la cámara. Asegúrate de que la parte verde se proyecte en la mitad superior de la pantalla y la parte roja en la parte inferior.Utilice siempre chips microfluídicos que tengan menos de un mes de antigüedad. Para la configuración, primero cargue el depósito de flujo por gravedad con M9 filtrado. Coloque el depósito a unos 60 centímetros por encima del chip y conéctelo a una toma de corriente de chip. A continuación, conecte la otra salida a un contenedor de residuos con dos entradas y conecte la segunda entrada al contenedor de residuos a una bomba peristáltica.Realice todas las conexiones con tubería de polietileno. A continuación, ensamble las interconexiones, longitudes de tubería de 50 milímetros con conectores de tubería de metal en ambos extremos. Ajuste a presión e interconéctelo en cada uno de los seis dedos de accionamiento y en la entrada del tornillo sin fin.Ahora, coloque el chip debajo de la óptica. Asegúrese de dejar las interconexiones conectadas al chip, ya que el PDMS se desgastará rápidamente con manipulaciones repetidas. Es vital que el actuador PDMS y el tubo que conecta el chip al depósito de aire estén debidamente sellados para garantizar un buen accionamiento cromático del diafragma.Antes de cargar animales, compruebe si hay pérdida de presión en el chip microfluídico. Mida la deflexión del diafragma realizando varios ciclos de accionamiento a la presión deseada. A continuación, compara los valores cuantitativos con las predicciones teóricas.Si los valores medidos no son los esperados, compruebe si hay fugas en la tubería o en los conectores de la tubería. El PDMS también puede tener una elasticidad diferente debido a una proporción alternativa de polímero base y agente de curado, o la masa de PD puede ser vieja y excesivamente reticulada. Han preparado C.elegans sincronizados con la edad de un adulto o un adulto según lo descrito por Porta-de-la-Riva y compañía en su publicación Jove de 2012.Ahora, elija de dos a cinco adultos jóvenes o hermafroditas de un día de edad. Elegir animales del tamaño correcto es fundamental. Los animales pequeños no quedarán atrapados en el canal, y los animales demasiado grandes serán difíciles de eliminar y pueden obstruir el dispositivo.Tira de los gusanos recogidos en una gota de M9 filtrado. Luego, extiéndalos en un trozo de tubo con una jeringa de un mililitro sin meterlos en el cuerpo de la jeringa. A continuación, conecte el tubo a la interconexión en la entrada del tornillo sin fin del chip. Luego, active el flujo de gravedad abriendo la válvula del depósito y encendiendo la bomba.Ahora, observe el canal de captura con un aumento cuatro veces mayor y empuje suavemente a los animales hacia el dispositivo. Después de cargar los animales en la cámara de espera, use el émbolo para hacer fluir suavemente uno de ellos hacia el frente del canal de captura de modo que su cabeza ingrese a la forma cónica del canal. Si el gusano no llena toda la sección transversal del canal desde la nariz hasta cerca del final del cuerpo, retíralo.Muchas veces, los gusanos que son demasiado pequeños atravesarán directamente el chip sin quedar atrapados. Si es necesario retirar un animal que quedó atrapado en el canal de captura, simplemente presione el émbolo de la jeringa hasta que el gusano desaparezca del canal y luego cargue un nuevo gusano. Una vez que un gusano esté cargado correctamente, cambie al modo de fluorescencia y aumente el aumento.Para evitar la saturación, asegúrese de ajustar la intensidad de excitación en función de la intensidad de la florescencia. Compruebe si la neurita de una neurona de interés se encuentra a través del diafragma de uno de los actuadores. Ese actuador también debe ser anterior al cuerpo celular de la neurona.De lo contrario, ajuste la posición del animal tirando o empujando el émbolo. Si eso no ayuda, retire el gusano y cargue uno nuevo. Además, si hay autofluorescencia alrededor de la neurona, reemplace el gusano.Una vez que un gusano esté cargado correctamente, concéntrese en el cuerpo celular de la neurona de interés, luego determine qué actuador está el chip en su lado anterior y conecte este actuador a la bomba de presión programable utilizando la interconexión asociada. Si el experimento requiere medir la distancia entre el actuador y la neurona, encaje ambos en el campo de visión con la pared del canal paralela al borde superior e inferior de la imagen. A continuación, defina un protocolo de presión utilizando la bomba de presión programable.Comience siempre tomando al menos 50 imágenes a cero kilopascales para definir una línea de base. Luego, programe la forma de onda y la presión del estímulo. Ahora, ejecute el protocolo de imágenes y presión.Durante la grabación, la neurona de interés debe ser el punto más brillante en un área de 10 píxeles cuadrados. No puede moverse más de 10 píxeles en dos imágenes secuenciales y debe permanecer en el campo de visión. Durante el registro, puede observar cambios en la intensidad de la florescencia cuando cambian la presión y los actuadores.Esto indica una estimulación exitosa de las neuronas. Entre estímulos, incluir 10 segundos a una presión constante de cero kilopascales. Es posible registrar simultáneamente señales de múltiples neuronas en el campo de visión siempre que estén separadas por al menos 10 píxeles durante toda la grabación.Para guardar los gusanos para un estudio posterior, desconecte las salidas del chip hacia el flujo de gravedad y el contenedor de desechos. Luego, presione suavemente el émbolo hasta que todo el gusano sea empujado a través del canal de captura hacia el canal de flujo, y continúe presionando el émbolo hasta que el animal aparezca en una gota fuera del chip. Ahora, desconecte la jeringa del tubo y aspire el gusano en la gota sobre una placa de agar.Para eliminar y sacrificar un gusano en el canal, presione el émbolo hasta que todo el gusano sea empujado a través del canal de captura y hacia el canal de flujo. Luego, el gusano saldrá del chip y entrará en el contenedor de desechos. Después de configurar el chip microfluídico, se probó la deflexión del diafragma.Los valores medidos fueron reproducibles con una ligera variación que no excedió de una micra a 450 kilopascales de presión. Después de insertar los gusanos en la entrada del chip, la piel de un solo animal dentro del canal de captura se presentó a los seis actuadores. Con este diseño, la neurona PLM generalmente no se puede inmovilizar por completo, por lo que puede moverse lateral y verticalmente.Aunque es posible la activación exitosa de las neuronas PLM, el registro de los transitorios de calcio de ellas es difícil debido al movimiento de la cola. Una vez en su lugar, el animal fue estimulado utilizando uno de los seis actuadores colocados para entregar estímulos mecánicos a cada uno de los seis TRN. Se presentó uno de los tres estímulos diferentes de dos segundos.Una retención a 275 kilopascales, una rampa a 275 kilopascales o un zumbido que consiste en un seno de 10 hercios de 75 kilopascales superpuesto con el paso de 275 kilopascales. Intervalos de 10 segundos sin presión separaban los estímulos. Las rampas de presión y los escalones de presión activaban las TRN solo si los estímulos alcanzaban presiones superiores a 400 kilopascales, mientras que los estímulos de zumbido activaban de forma robusta todas las TRN.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco minutos por gusano. Es importante recordar que un mal sellado entre el chip y el cubreobjetos, o entre el chip y los interconectores, hará que el dispositivo tenga fugas y falle. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes de voltaje o la administración dirigida de estímulos mecánicos a diferentes neuronas, con el fin de caracterizar la respuesta mecánica de los nociceptores.Además, debido a que los animales pueden recuperarse siguiendo este procedimiento, la técnica podría usarse para detectar mutantes defectuosos en su respuesta a estímulos mecánicos. No olvide que trabajar con gases comprimidos y productos químicos puede ser extremadamente peligroso. Tome precauciones, como usar prendas de protección personal y trabajar en campanas extractoras cuando sea necesario para evitar esos peligros.

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Investigación

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El presente protocolo describe el diseño, fabricación y caracterización de un sistema microfluídico capaz de alinear, inmovilizar y comprimir con precisión cientos de embriones de Drosophila melanogaster con una intervención mínima del usuario. Este sistema permite obtener imágenes de alta resolución y recuperar muestras para el análisis posterior a la estimulación y se puede escalar para adaptarse a otros sistemas biológicos multicelulares.

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