Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans

El objetivo general de esta técnica es medir cómo los nematodos y sus neuronas responden a los estímulos mecánicos externos utilizando una configuración de chip microfluídico con actuadores de presión. Este método puede responder a preguntas clave en los campos de la mecanobiología y la biología sensorial, como la forma en que las células, los tejidos y los animales responden a la estimulación mecánica. La principal ventaja de esta técnica es que reduce lo suficiente la movilidad del gusano de forma no invasiva para permitir la obtención de imágenes de alta resolución sin dejar de tener acceso a la cutícula del gusano para la estimulación mecánica.

Este método también se puede utilizar para estudiar la influencia de las señales mecánicas en el desarrollo. Incluso podría aplicarse a otros sistemas como la exposición de órganos ex vivo u otros animales de tamaño similar al C. Elegans. Configure un sistema de microscopio para la excitación simultánea de GCaMP y RFP.

Una opción es una fuente de luz discreta que transmita solo luz cian y amarilla. Para la visualización, utilice un objetivo de 10 aumentos y un objetivo de gran aumento. Además, envíe la imagen a una computadora a través de una cámara digital.

A continuación, incluya un cubo de fluorescencia y, si es necesario, un filtro de excitación. Añade un espejo dicroico al cubo que refleje la luz cian y amarilla y transmita la luz verde y roja. Configure un divisor de haz con un espejo dicroico de paso largo con un corte de 570 nanómetros.

Además, proporcione un filtro de emisión de paso de banda para luz verde a 525 nanómetros con un ancho de 50 nanómetros y un filtro de emisión de paso de banda para luz roja a 632 nanómetros con un ancho de 60 nanómetros. Proyecte ambos haces en el campo de visión de la cámara. Asegúrate de que la parte verde se proyecte en la mitad superior de la pantalla y la parte roja en la parte inferior.

Utilice siempre chips microfluídicos que tengan menos de un mes de antigüedad. Para la configuración, primero cargue el depósito de flujo por gravedad con M9 filtrado. Coloque el depósito a unos 60 centímetros por encima del chip y conéctelo a una toma de corriente de chip. A continuación, conecte la otra salida a un contenedor de residuos con dos entradas y conecte la segunda entrada al contenedor de residuos a una bomba peristáltica.

Realice todas las conexiones con tubería de polietileno. A continuación, ensamble las interconexiones, longitudes de tubería de 50 milímetros con conectores de tubería de metal en ambos extremos. Ajuste a presión e interconéctelo en cada uno de los seis dedos de accionamiento y en la entrada del tornillo sin fin.

Ahora, coloque el chip debajo de la óptica. Asegúrese de dejar las interconexiones conectadas al chip, ya que el PDMS se desgastará rápidamente con manipulaciones repetidas. Es vital que el actuador PDMS y el tubo que conecta el chip al depósito de aire estén debidamente sellados para garantizar un buen accionamiento cromático del diafragma.

Antes de cargar animales, compruebe si hay pérdida de presión en el chip microfluídico. Mida la deflexión del diafragma realizando varios ciclos de accionamiento a la presión deseada. A continuación, compara los valores cuantitativos con las predicciones teóricas.

Si los valores medidos no son los esperados, compruebe si hay fugas en la tubería o en los conectores de la tubería. El PDMS también puede tener una elasticidad diferente debido a una proporción alternativa de polímero base y agente de curado, o la masa de PD puede ser vieja y excesivamente reticulada. Han preparado C.elegans sincronizados con la edad de un adulto o un adulto según lo descrito por Porta-de-la-Riva y compañía en su publicación Jove de 2012.

Ahora, elija de dos a cinco adultos jóvenes o hermafroditas de un día de edad. Elegir animales del tamaño correcto es fundamental. Los animales pequeños no quedarán atrapados en el canal, y los animales demasiado grandes serán difíciles de eliminar y pueden obstruir el dispositivo.

Tira de los gusanos recogidos en una gota de M9 filtrado. Luego, extiéndalos en un trozo de tubo con una jeringa de un mililitro sin meterlos en el cuerpo de la jeringa. A continuación, conecte el tubo a la interconexión en la entrada del tornillo sin fin del chip. Luego, active el flujo de gravedad abriendo la válvula del depósito y encendiendo la bomba.

Ahora, observe el canal de captura con un aumento cuatro veces mayor y empuje suavemente a los animales hacia el dispositivo. Después de cargar los animales en la cámara de espera, use el émbolo para hacer fluir suavemente uno de ellos hacia el frente del canal de captura de modo que su cabeza ingrese a la forma cónica del canal. Si el gusano no llena toda la sección transversal del canal desde la nariz hasta cerca del final del cuerpo, retíralo.

Muchas veces, los gusanos que son demasiado pequeños atravesarán directamente el chip sin quedar atrapados. Si es necesario retirar un animal que quedó atrapado en el canal de captura, simplemente presione el émbolo de la jeringa hasta que el gusano desaparezca del canal y luego cargue un nuevo gusano. Una vez que un gusano esté cargado correctamente, cambie al modo de fluorescencia y aumente el aumento.

Para evitar la saturación, asegúrese de ajustar la intensidad de excitación en función de la intensidad de la florescencia. Compruebe si la neurita de una neurona de interés se encuentra a través del diafragma de uno de los actuadores. Ese actuador también debe ser anterior al cuerpo celular de la neurona.

De lo contrario, ajuste la posición del animal tirando o empujando el émbolo. Si eso no ayuda, retire el gusano y cargue uno nuevo. Además, si hay autofluorescencia alrededor de la neurona, reemplace el gusano.

Una vez que un gusano esté cargado correctamente, concéntrese en el cuerpo celular de la neurona de interés, luego determine qué actuador está el chip en su lado anterior y conecte este actuador a la bomba de presión programable utilizando la interconexión asociada. Si el experimento requiere medir la distancia entre el actuador y la neurona, encaje ambos en el campo de visión con la pared del canal paralela al borde superior e inferior de la imagen. A continuación, defina un protocolo de presión utilizando la bomba de presión programable.

Comience siempre tomando al menos 50 imágenes a cero kilopascales para definir una línea de base. Luego, programe la forma de onda y la presión del estímulo. Ahora, ejecute el protocolo de imágenes y presión.

Durante la grabación, la neurona de interés debe ser el punto más brillante en un área de 10 píxeles cuadrados. No puede moverse más de 10 píxeles en dos imágenes secuenciales y debe permanecer en el campo de visión. Durante el registro, puede observar cambios en la intensidad de la florescencia cuando cambian la presión y los actuadores.

Esto indica una estimulación exitosa de las neuronas. Entre estímulos, incluir 10 segundos a una presión constante de cero kilopascales. Es posible registrar simultáneamente señales de múltiples neuronas en el campo de visión siempre que estén separadas por al menos 10 píxeles durante toda la grabación.

Para guardar los gusanos para un estudio posterior, desconecte las salidas del chip hacia el flujo de gravedad y el contenedor de desechos. Luego, presione suavemente el émbolo hasta que todo el gusano sea empujado a través del canal de captura hacia el canal de flujo, y continúe presionando el émbolo hasta que el animal aparezca en una gota fuera del chip. Ahora, desconecte la jeringa del tubo y aspire el gusano en la gota sobre una placa de agar.

Para eliminar y sacrificar un gusano en el canal, presione el émbolo hasta que todo el gusano sea empujado a través del canal de captura y hacia el canal de flujo. Luego, el gusano saldrá del chip y entrará en el contenedor de desechos. Después de configurar el chip microfluídico, se probó la deflexión del diafragma.

Los valores medidos fueron reproducibles con una ligera variación que no excedió de una micra a 450 kilopascales de presión. Después de insertar los gusanos en la entrada del chip, la piel de un solo animal dentro del canal de captura se presentó a los seis actuadores. Con este diseño, la neurona PLM generalmente no se puede inmovilizar por completo, por lo que puede moverse lateral y verticalmente.

Aunque es posible la activación exitosa de las neuronas PLM, el registro de los transitorios de calcio de ellas es difícil debido al movimiento de la cola. Una vez en su lugar, el animal fue estimulado utilizando uno de los seis actuadores colocados para entregar estímulos mecánicos a cada uno de los seis TRN. Se presentó uno de los tres estímulos diferentes de dos segundos.

Una retención a 275 kilopascales, una rampa a 275 kilopascales o un zumbido que consiste en un seno de 10 hercios de 75 kilopascales superpuesto con el paso de 275 kilopascales. Intervalos de 10 segundos sin presión separaban los estímulos. Las rampas de presión y los escalones de presión activaban las TRN solo si los estímulos alcanzaban presiones superiores a 400 kilopascales, mientras que los estímulos de zumbido activaban de forma robusta todas las TRN.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco minutos por gusano. Es importante recordar que un mal sellado entre el chip y el cubreobjetos, o entre el chip y los interconectores, hará que el dispositivo tenga fugas y falle. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la obtención de imágenes de voltaje o la administración dirigida de estímulos mecánicos a diferentes neuronas, con el fin de caracterizar la respuesta mecánica de los nociceptores.

Además, debido a que los animales pueden recuperarse siguiendo este procedimiento, la técnica podría usarse para detectar mutantes defectuosos en su respuesta a estímulos mecánicos. No olvide que trabajar con gases comprimidos y productos químicos puede ser extremadamente peligroso. Tome precauciones, como usar prendas de protección personal y trabajar en campanas extractoras cuando sea necesario para evitar esos peligros.