Desarrollo de un modelo 3D de tejido neural polarizado basado en seda y colágeno

Coloque andamios de seda porosa en forma de rosquilla, recubiertos de poli-D-lisina en una placa de pocillos múltiples.

Agregue medios de cultivo para hidratar los andamios, facilitando la unión celular.

Aspirar el exceso de medios. Siembre los andamios con una suspensión de células neuronales e incube.

La superficie recubierta y los poros del andamio proporcionan una gran superficie para la fijación celular de alta densidad y facilitan la difusión eficiente de nutrientes y desechos.

Retire las células no adheridas y agregue colágeno, una proteína de la matriz extracelular.

Incubar para la polimerización del colágeno. Este proceso incrusta las células dentro de una matriz 3D similar a un gel en el andamio poroso.

Añadir medios. Cultive y reemplace regularmente la mitad de los medios de cultivo para reponer los nutrientes sin alterar las células.

Dentro del cultivo, los cuerpos celulares neuronales permanecen anclados al andamio de seda mientras que los axones crecen a través de la matriz de colágeno, formando redes axonales 3D.

Este cuerpo celular compartimentado y la localización axonal dan como resultado la formación de un modelo de tejido neuronal polarizado similar al cerebro en 3D.

Dentro de una campana de cultivo celular, coloque un par de pinzas esterilizadas, medios de cultivo celular y los andamios esterilizados en autoclave. Retire una placa de 96 pocillos de su envoltura y colóquela dentro. Para sembrar los andamios, primero, coloque un andamio estéril por pocillo en la placa de 96 pocillos. Agregue medio de cultivo celular para sumergir los andamios e incube a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos para equilibrarlos durante al menos 30 minutos.

Después de la incubación, aspire el exceso de medio de los andamios. Luego, agregue 2 veces 10 a las 6 células neuronales corticales de rata en 100 microlitros de medio neurobasal por andamio. Regrese la placa a la incubadora y déjela toda la noche para permitir que las células se adhieran al andamio. A la mañana siguiente, aspire cuidadosamente las células no adheridas y reemplácelas con 200 microlitros de medio de cultivo celular fresco. Incubar a 37 grados centígrados durante un breve período.

A continuación, aspira el medio de los pocillos. Con pinzas estériles, transfiera los andamios que contienen células a pocillos vacíos de la placa de 96 pocillos. Luego, a cada andamio, agregue 100 microlitros de solución de colágeno de cola de rata helada recién diluida de 3 miligramos por mililitro.

Regrese las células a la incubadora de 37 grados Celsius para permitir la polimerización del colágeno durante 30 minutos. Retire la placa de la incubadora y agregue 100 microlitros de medio de cultivo celular precalentado por pocillo. Regrese la placa a la incubadora durante el período deseado de crecimiento celular, reemplazando la mitad del medio de cada pocillo con medio fresco todos los días hasta por una semana.