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Comience colocando los componentes del molinillo de tejidos en hielo. Este dispositivo incluye un mortero y dos morteros de diferentes diámetros.
Vierta un tampón de sal fría en el mortero y luego agregue tejido cerebral de ratón.
El tampón mantiene el equilibrio osmótico, preservando la estructura y función celular.
Muela el tejido con múltiples movimientos suaves utilizando el mortero de menor diámetro, que corta mecánicamente el tejido en trozos más pequeños.
A continuación, acariciar con el mortero de mayor diámetro, facilitando una mayor descomposición del tejido en las células que lo componen.
Transfiera la mezcla a un tubo y centrifuge.
Retire el sobrenadante.
Agregue un tampón de sal fría y un vórtice para romper los grumos celulares y la mielina.
A continuación, agregue un medio de gradiente de densidad y centrifuge.
Debido a las diferencias en la forma y la masa, las células se asentarán en la capa inferior, mientras que los desechos y la mielina se acumularán en la capa superior.
Deseche el sobrenadante.
Agregue una solución adecuada para obtener una suspensión de múltiples celdas para su uso posterior.
Para la homogeneización de tejidos, agregue 3 mililitros de HBSS preenfriado al mortero de vidrio preenfriado de un molinillo de tejidos Dounce y transfiera la mitad de uno de los cerebros cosechados al mortero. Macerar suavemente el tejido con 10 golpes de mortero A, seguidos de 10 golpes de mortero B, y transferir la mezcla homogeneizada a un nuevo tubo cónico de 15 mililitros.
Llene el tubo hasta un volumen final de 10 mililitros con HBSS preenfriado para centrifugación y vuelva a suspender el gránulo en 7 mililitros de HBSS fresco con vórtice antes de mantener la muestra en hielo. Para la eliminación de residuos, agregue 3 mililitros de solución isotónica preenfriada a cada muestra digerida u homogeneizada, y agite suavemente las muestras para asegurarse de que se mezclen homogéneamente.
A continuación, centrifuga las muestras y retira con cuidado el disco blanquecino de restos y mielina que flotan en la superficie de la solución. Cuando se hayan desechado los desechos, recoja todos menos los últimos 100 microlitros del sobrenadante de cada tubo sin alterar los gránulos. Vuelva a suspender cada gránulo en 1 mililitro de solución FACS / BL para transferirlo a tubos individuales de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Después de la centrifugación con la solución de partículas, es importante eliminar el disco de residuos y el sobrenadante con mucho cuidado, sin desalojar el sedimento celular, para evitar la pérdida de muestra.
Después de la centrifugación, aspire cuidadosamente el sobrenadante de cada tubo y vuelva a suspender los gránulos en 350 microlitros de FACS/BL fresco por tubo.