Medición de la actividad neuronal en un trozo de cerebro de ratón después de una incubación prolongada

Asegure un corte de cerebro de ratón en una cámara de registro, perfundido con aCSF oxigenado después de una incubación prolongada.

Las células de la rebanada están cargadas con un indicador de calcio, lo que facilita las mediciones de calcio intracelular.

Tome una pipeta de registro que comprende un electrodo en una solución de electrolitos.

Identificar una neurona objetivo. Coloque la pipeta de registro con presión positiva sobre la membrana celular, creando un hoyuelo.

Aplique presión negativa para crear un sello hermético.

Además, aplique pulsos de presión negativa, rompiendo la membrana y estableciendo una configuración de toda la celda.

Perfundir aCSF con una alta concentración de potasio, que despolariza la membrana de la neurona.

La despolarización abre los canales de sodio, desencadenando un potencial de acción, que a su vez activa los canales de calcio dependientes de voltaje y permite la entrada de calcio.

Los iones de calcio se unen al indicador, mejorando la fluorescencia, que se puede visualizar bajo una iluminación adecuada.

El aumento de la fluorescencia intracelular, causado por la entrada de calcio después de la aplicación de potasio, indica viabilidad neuronal después de una incubación prolongada.

Para el registro, coloque el tejido en una cámara de registro sumergida bajo un microscopio y perfundirlo con aCSF oxigenado a una velocidad de flujo de 4 a 5 mililitros por minuto. Sostén el pañuelo usando un arpa hecha a medida. A continuación, prepare unas pipetas de registro con un extractor de micropipetas para conseguir una resistencia final de 5 a 6 mega ohmios.

Llene la pipeta con 3 a 4 microlitros de solución interna y luego coloque la solución en hielo. Luego, visualice las celdas usando una cámara CCD bajo IR-DIC. Coloque la pipeta en la membrana celular con un micromanipulador. Mantenga la presión positiva a través de un puerto de succión en el soporte de la pipeta. Una vez que la pipeta esté en la célula, aplique una suave presión negativa a la pipeta para lograr un sello de gigaohmio.

Luego, rompa la membrana celular con una breve presión negativa. Posteriormente, inicie el registro de la pinza de corriente o voltaje de toda la celda. Para una sola longitud de onda de excitación de flujo 4, filtre la luz de excitación a través de un filtro de paso de banda de 460 a 490 nanómetros y emita luz a través de un filtro de paso de banda de 515 a 550 nanómetros.