Visualización y mapeo de vías neuronales en un corte de cerebro de amígdala

En el cerebro del ratón, la amígdala contiene neuronas que forman conexiones sinápticas con la corteza prefrontal medial, o neuronas mPFC.

Tomemos un corte de cerebro de la amígdala en el que las neuronas mPFC expresan un canal sensible a la luz rodopsina fusionado con una proteína fluorescente.

Coloque el corte en una cámara de registro y visualícelo bajo un microscopio de fluorescencia para localizar las neuronas mPFC.

Cambie a una vista de campo claro e introduzca una pipeta de parche que contenga una solución interna.

Aplique presión positiva para hacer avanzar la pipeta hacia una neurona de la amígdala.

Tras el contacto neuronal, se forma un hoyuelo.

Aplique succión para formar un sello hermético.

Continúe la succión para romper la membrana, estableciendo contacto con el interior de la célula.

Ilumine el corte para activar la rodopsina del canal neuronal mPFC, desencadenando la afluencia de iones positivos, la generación de potencial de acción y la liberación de neurotransmisores.

Los neurotransmisores se unen a los receptores de neuronas de la amígdala postsináptica, causando la afluencia de iones y la generación de corriente.

Registre la corriente neuronal postsináptica para analizar la conectividad mPFC-amígdala.

Para preparar el microscopio de parche para la activación optogenética de fibras y células, centre el diodo emisor de luz montado, o LED, en la vía de suministro de luz. Utilice un medidor de potencia para medir la intensidad de la luz LED en el plano focal posterior y en la salida de cada objetivo a una longitud de onda de 470 nanómetros. Use una hoja de cálculo para calcular la intensidad de la luz en milivatios por milímetro cuadrado y cree una curva de calibración para cada objetivo.

A continuación, recupere un corte agudo de amígdala de la cámara de interfaz y colóquelo en la cámara de corte montada en el microscopio. Coloque la rebanada de modo que la superficie de la rebanada hacia arriba en la cámara de interfaz también esté hacia arriba en la cámara de grabación. Perfunda la rebanada con ACSF fresco y oxigenado a una velocidad de 1 a 2 mililitros por minuto. La temperatura debe ser de aproximadamente 31 grados centígrados. Encienda la lámpara fluorescente y seleccione los conjuntos de filtros apropiados para la proteína fluorescente específica expresada. Utilice el objetivo 5x para obtener una visión general.

A continuación, abra o restrinja la abertura en la vía de luz del microscopio, según sea necesario para el experimento. Para obtener una grabación de parche, llene una pipeta de parche con solución interna y móntela en el soporte del electrodo. Aplique presión positiva a la pipeta de parche y bájela lentamente en la solución de baño. Luego, bajo control visual, use el micromanipulador para bajar la pipeta de parche en la rebanada. Acérquese a la neurona de interés con la pipeta de parche desde el lateral y la parte superior.

Libere la presión positiva cuando la pipeta llegue a la superficie de la célula, como lo indica un hoyuelo visible en la superficie de la célula. Aplique presión negativa para obtener un gigaseal. Aplique más succión para romper el parche de membrana y obtener el registro de toda la célula. A continuación, estimule las fibras marcadas con el LED conectado activando la canalrodopsina con luz de longitud de onda de 470 nanómetros mientras registra las respuestas eléctricas de la célula.

Para la estimulación sináptica, utilice las salidas digitales del software de adquisición de datos para activar el LED. Ajuste la intensidad de estimulación del LED manualmente. Repetir la estimulación con una abertura abierta o restringida según sea necesario para la siguiente célula registrada, o en presencia de sustancias problema específicas.