Name: Modificación de un Colliculo-tálamo-cortical del ratón Cerebro Loncha, incorporación de la impresión 3-D de la Cámara Componentes e Imagen óptica multi-escala (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 5 s
Description: Aprende a preparar rebanadas colículo-tálamo-corticales en cerebro de ratón para estudiar procesamiento auditivo mediante corte doble angular e imagen de flavoproteínas. Esta técnica preserva proyecciones intactas de cuatro estructuras auditivas principales.

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Este trabajo fue parcialmente apoyado por los premios del Instituto Nacional de la Sordera y Otros Trastornos de la Comunicación R03-DC-012125 a D. A. Llano y F31-DC-013501 a B. J. Slater, así como a la Fundación Carver.
Los autores desean agradecer a Jason MacLean y Matthew Banks por su asesoramiento técnico sobre las imágenes de calcio.

Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Illinois. Todos los animales fueron alojados en las instalaciones de cuidado de los animales aprobados por la Asociación Americana para la Acreditación del Laboratorio Animal Care. Cada intento se hizo para reducir al mínimo el número de animales utilizados y reducir el sufrimiento en todas las etapas del estudio. 1. Preparación y Extracción de cerebro de ratón para rebanar <ol><li> Prepárese para la perfusión y la incubación rebanada. <ol><li> Aproximadamente 30 minutos antes de cortar, preparar alta solución de corte sacarosa y baja LCRa calcio para la incubación de la rebanada antes de la grabación o imágenes. </li><li> Coloque todas las herramientas necesarias (grandes tijeras romas finales, pequeñas tijeras de primavera, pinzas anatómicas, grandes tijeras o guillotina, iris tijeras, joyeros fórceps, 10 jeringas ml con aguja 27G x 1/2 pulgadas, pequeña pieza de 1 cm x 2 cm de filtro papel, y una punta de pipeta de Pasteur roto por sltransferencia de hielo) para la perfusión y corte en rodajas, y preparar la bandeja de perfusión. </li><li> Configurar la incubación de cámara con oxigenada LCRa en un baño de agua C ​​32 o y una placa de cultivo lleno de solución de corte. </li></ol></li><li> Preparar corte escenario para rebanar. <ol><li> Corte un pedazo pequeño de 3% de agar de aproximadamente 1 cm 3 para usar como respaldo para el cerebro y 1,5 cm x 1,5 mm x 3 mm para un bulto que se utilizará para apuntalar la IC. </li><li> Pegue el tope en el escenario con el adhesivo de cianoacrilato, así como la protuberancia en el lado derecho del tope de tal manera que forman un ángulo de 80 °. </li></ol></li><li> Retire el cerebro. <ol><li> Profundamente anestesiar a-p20 p12 (idealmente p14-18) ratón con ketamina 100 mg / kg y xylaxine 3 mg / kg (o comité de ética comparables procedimiento aprobado). Nota: Confirme el nivel de anestesia adecuado a través de la falta de respuesta a la pizca dedo del pie. Como el animal está bajo anestesia brevemente, pomada oftálmica es innecesaria. </li><li> Usando romoterminar tijeras, exponer la caja torácica de la apófisis xifoides hasta el cuello. <ol><li> Encuentra el proceso xifoides, y hacer un corte horizontal de aproximadamente 1,5 cm. </li><li> Hacer dos cortes verticales de los extremos del corte horizontal anterior a los hombros, aproximadamente 1,5 cm cada uno. </li></ol></li><li> Cortar a través del diafragma y las uniones costocondrales para exponer el corazón. </li><li> Con pequeñas tijeras de primavera, hacer un pequeño, 2-5 cortar en la aurícula derecha mm, desde el ventral a dorsal lado del corazón. </li><li> Usando una jeringa de 10 ml con una aguja 27G x 1/2 pulgadas, inyectar el ventrículo izquierdo y perfundir rápidamente el animal con alta solución de corte sacarosa. </li><li> Una vez que la sangre salga clara, utilizar tijeras grandes para quitar de la cabeza. Nota: No hemos evaluado sistemáticamente la utilidad de la perfusión. Sin embargo, en nuestra experiencia, la perfusión transcardíaca en ratones jóvenes esta se puede hacer con casi el 100% de éxito, y no tienen el beneficio de eliminar bl rojaood células, que pueden emitir fluorescencia e interferir con las imágenes. </li><li> Cortar la piel hacia abajo de la línea media para exponer el cráneo. </li><li> Usando iris dobladas tijeras, cortar el cráneo entre los ojos, y luego a partir de la corte entre los ojos, cuidadosamente cortado de anterior a posterior a lo largo de la línea media de la sutura con cuidado de no dañar el cerebro debajo. Nota: La dura por lo general, se corre con el cráneo. Si es necesario, retire la duramadre antes de retirar cuidadosamente el cerebro. </li><li> Usando joyeros fórceps, palanca abrir el cráneo y retire con cuidado el cerebro, a continuación, coloque el cerebro en una solución de corte. Tenga cuidado de no dañar las cortezas. </li></ol></li></ol> 2. Preparación del cerebro para rebanar <ol><li> Preparación del cerebro para el montaje en vibratome etapa. <ol><li> Usando una diapositiva marcado con dos líneas a 90 o y una línea diagonal a los 17 o desde la parte superior izquierda a la inferior derecha, intersección donde las dos líneas se encuentran, coloque la cara dorsal del cerebro hasta, utilizandouna hoja de afeitar, retire 2-4 mm del cerebro extremo rostral la creación de una superficie plana. </li><li> Coloque el lado caudal del cerebro en la superficie plana de nueva creación, y alinear la superficie dorsal del cerebro con la horizontal y la línea media del cerebro con la línea vertical. </li><li> Alinear la cuchilla de afeitar con la línea 17 o, incline la navaja en un ángulo de 30 ° y quite aproximadamente 3 mm de la corteza justo en un corte diagonal doble (17 o desde el plano horizontal y 60 ° de la corona). </li></ol></li><li> Montaje cerebro en vibratome etapa. <ol><li> Coloque un pequeño trozo de papel de filtro de 1 cm x 2 cm en la parte ventral del cerebro para que la dimensión larga es perpendicular a la línea media. </li><li> Con cuidado aplique una pequeña cantidad de adhesivo de cianoacrilato a la zona delante del antirretorno (y a la izquierda de la protuberancia). </li><li> Coloque el cerebro en diagonal de corte doble en el pegamento de manera que la parte caudal del cerebro y el rombencéfalo son prel op a la protuberancia y el lado derecho del cerebro está en contra del tope trasero. </li><li> Delicadamente presione hacia abajo en el cerebro, lo que garantiza que toda la superficie está en contacto con la cámara de corte. </li></ol></li></ol> 3. La obtención de la Colliculo-tálamo-cortical Slice <ol><li> Tomar rápidamente la etapa de corte y el lugar en el vibratome, llenar el escenario con una solución de corte. </li><li> Alinear la cuchilla con la parte superior (lado ventral) del cerebro. </li><li> Retire 1-1.5 mm de la parte superior del cerebro, retire 300-500 micras rodajas y evaluar a fondo después de la eliminación. Nota: Cuando la IC, el MGB, y el núcleo geniculado lateral (LGN) son visibles, y el giro dentado forma una forma de &#39;C&#39; tomar de una a dos 600 micras rodajas. Véase la Figura 3A. </li><li> Coloque las rebanadas en caliente (32 ° C) que sostiene la cámara. </li></ol> 4. Obtención de imágenes de la rebanada <ol><li> Preparación para la formación de imágenes autofluorescencia flavoproteína. <ol> &lt;li&gt; Prepare LCRa para la perfusión de la rebanada en una cámara estándar de registro electrofisiológico, LCRa burbuja con 95% de O2 / 5% de CO 2. </li><li> Tire electrodo de vidrio para la estimulación. Tenga en cuenta que varios diferentes electrodos estimulantes y configuraciones (vidrio, tungsteno, fibra de carbono, monopolar, bipolar) todo el trabajo muy bien en conjunto con imágenes autofluorescencia flavoproteína. </li><li> Encienda el ordenador, cámara, micromanipulador, fuente de luz, el software de estimulación, el software de captura de imágenes. </li><li> Perfundir la cámara de grabación con oxigenada LCRa, coloque el puente personalizado (diseño disponible en Materiales Suplementarios) para elevar la rebanada en la cámara. Nota: tasa de perfusión puede variar con cualquier individuo establecido; 5-15 ml / min se utiliza aquí. </li><li> Coloque la rebanada en la cámara, bajar el nivel de líquido en la cámara para evitar el corte de la elevación del puente mientras se coloca arpa especialmente construido sobre rebanada, teniendo cuidado de evitar la colocación de cuerdas del arpa sobre vías de interest (Figura 1A). Aumentar el nivel de líquido de aproximadamente 1-2 mm por encima de la rebanada para mantener el flujo LCRa encima y debajo de la rebanada. Nota: Si el reposicionamiento es necesario, utilice el final pipeta Pasteur roto o permita que el nivel LCRa a subir y utilizar fórceps con extremo cuidado. </li><li> Inserte electrodo de cloruro de plata en el electrodo de vidrio lleno de LCRa, inserte el electrodo de vidrio en micromanipulador y conectarse a los estímulos del aislador, y coloque cuidadosamente electrodo de vidrio en IC / sustancia blanca que lleva a tálamo (ver Figura 1). </li></ol></li><li> Flavoproteína adquisición de imágenes de autofluorescencia. <ol><li> Recoge imágenes a 4 Hz (utilizando un 2X macro objetivo infinito corregido (NA 0.13)) y una cámara de 105 seg, mientras que la estimulación eléctrica (cada estimulación consiste en 1 seg de 40 Hz 2 ms pulsos tejido en 0,05 Hz cinco veces), mientras que ilumina el tejido con azul claro desde 470 hasta 490 nm y por encima de la captura de 515 nm. Asegúrese de que la imagen no es ni dever o oscuro, ni apagada Figura 3 dejó la columna de referencia. Nota: El tiempo de recolección, la frecuencia de recogida, y la frecuencia de estimulación se pueden cambiar para adaptarse a la experiencia, el programa personalizado incluido en materiales complementarios se pueden modificar como tal. </li><li> Exportar imágenes a Matlab, y utilizando el programa escrito de encargo disponible en materiales complementarios para analizar la energía espectral de las imágenes a 0,05 Hz. La imagen resultante mostrará las vías conectados. Nota: El programa personalizado utiliza una transformada rápida de Fourier de los valores de los píxeles de la serie temporal para producir la imagen. </li></ol></li><li> Preparación para la imagen de calcio. <ol><li> Preparar pequeña cámara de incubación utilizando una placa de cultivo de 3 cm y la membrana cultura elevada para permitir LCRa para alcanzar la parte superior e inferior de la rebanada, y colóquelo sobre una almohadilla térmica para mantener la temperatura a aproximadamente 32 ° C </li><li> Rellene pequeña cámara de incubación con LCRa cálido y poco a poco la burbuja con un 95% de O2/5% de CO 2. </li><li> Mezclar 2 l de Pluronic F-127 ácido y 50 g de Fura-2AM disuelto en 48 l de DMSO. </li><li> Lugar rebanada en la pequeña cámara de incubación de la membrana elevada y con cuidado utilizando una micropipeta añadir mezcla de tinción directamente encima del MGB (u otra estructura de interés). </li><li> Cubra las rebanadas para prevenir la decoloración antes de la proyección de imagen, y que permiten rebanadas incubar durante 45 min - 1 hora. </li><li> Retire rebanadas a cámara de retención calentado durante 10-15 minutos para lavar el exceso de material. </li><li> Siga los pasos 4.1.1 al 4.1.6 para la preparación de estimular y la imagen de la rebanada-colliculo tálamo-cortical. </li></ol></li><li> Adquisición de imágenes de calcio. <ol><li> Recoge imágenes a 10 Hz (con un objetivo de inmersión 20X agua) durante 25 segundos, mientras que la estimulación eléctrica (cada estimulación consiste en un impulso de 2 ms) tejido en 0,2 Hz cinco veces mientras que ilumina el tejido con 365 nm de luz y la captura de fluorescencia por encima de 510 nm. </li&gt; <li> Exportar imágenes a Matlab y utilizando el programa escrito de encargo disponible en materiales complementarios para analizar la energía espectral de las imágenes a 0,2 Hz. La imagen resultante mostrará células activas. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Llano, D. A., Slater, B. J., Lesicko, A. M., Stebbings, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+auditory+colliculothalamocortical+brain+slice+preparation+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">An auditory colliculothalamocortical brain slice preparation in mouse.</a> J. Neurosci. 111, 197-207 (2014).</li>
<li>Agmon, A., Connors, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thalamocortical+responses+of+mouse+somatosensory+%28barrel%29+cortex+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro%22%5BJournal%5D)">Thalamocortical responses of mouse somatosensory (barrel) cortex in vitro.</a> Neuro. 41, 365-379 (1991).</li>
<li>Cruikshank, S. J., Rose, H. J., Metherate, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Auditory+Thalamocortical+Synaptic+Transmission+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Auditory Thalamocortical Synaptic Transmission In Vitro.</a> J Neurophysiol. 87, 361-384 (2002).</li>
<li>Lee, C. C., Sherman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topography+and+physiology+of+ascending+streams+in+the+auditory+tectothalamic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22PNAS%22%5BJournal%5D)">Topography and physiology of ascending streams in the auditory tectothalamic pathway.</a> PNAS. 107, 372-377 (2010).</li>
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<li>Crabtree, J. W., Isaac, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+intrathalamic+pathways+allowing+modality-related+and+cross-modality+switching+in+the+dorsal+thalamus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">New intrathalamic pathways allowing modality-related and cross-modality switching in the dorsal thalamus.</a> J. Neurosci. 22, 8754-8761 (2002).</li>
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<li>Zikopoulos, B., Barbas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prefrontal+Projections+to+the+Thalamic+Reticular+Nucleus+form+a+Unique+Circuit+for+Attentional+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Prefrontal Projections to the Thalamic Reticular Nucleus form a Unique Circuit for Attentional Mechanisms.</a> J. Neurosci. 26, 7348-7361 (2006).</li>
<li>Kalatsky, V. A., Stryker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+Paradigm+for+Optical+Imaging%3A+Temporally+Encoded+Maps+of+Intrinsic+Signal%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">New Paradigm for Optical Imaging: Temporally Encoded Maps of Intrinsic Signal.</a> Neuron. 38, 529-545 (2003).</li>
<li>Llano, D. A., Turner, J., Caspary, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diminished+cortical+inhibition+in+an+aging+mouse+model+of+chronic+tinnitus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Diminished cortical inhibition in an aging mouse model of chronic tinnitus.</a> J. Neurosci. 32, 16141-16148 (2012).</li>
<li>Ehret, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioural+studies+on+auditory+development+in+mammals+in+relation+to+higher+nervous+system+functioning%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Behavioural studies on auditory development in mammals in relation to higher nervous system functioning.</a> Acta otolaryngol. 99, 31-40 (1985).</li>
<li>Mikaelian, D., Ruben, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+hearing+in+the+normal+CBA-J+mouse%3A+correlation+of+physiological+observations+with+behavioral+responses+and+with+cochlear+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta%22%5BJournal%5D)">Development of hearing in the normal CBA-J mouse: correlation of physiological observations with behavioral responses and with cochlear anatomy.</a> Acta. 59, 451-461 (1965).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe mejoras en un corte cerebral colículo-talamocortical previamente descrito en ratón p12-20 para estudiar el flujo de información en el sistema auditivo1. Este método tiene una serie de ventajas sobre otras preparaciones de cortes cerebrales similares al retener las conexiones entre más áreas del cerebro en un solo corte, lo que brinda a los investigadores nuevas herramientas para comprender la interacción entre los núcleos auditivos en el cerebro anterior. Ha habido algunas modificacione...

En el sistema auditivo, aunque hay una transformación sustancial de información entre la periferia sensorial y el colículo inferior, hay una considerable procesamiento adicional antes de que alcance la corteza auditiva. Sabemos muy poco acerca de cómo ese proceso se hace y por lo tanto poco acerca de cómo esa transformación permite que el cerebro interpreta la información sensorial entrante. Con la excepción del olfato, cada uno de los sentidos tiene una organización muy similar con señales periféricas inicialmente siendo retransmitido con alta fidelidad que disminuye a medida que la señal asciende a la corteza. La corteza envía proyecciones a las estructuras inferiores para modular aún más la información entrante. Este complejo sistema ha sido estudiado en una variedad de maneras in vivo, así como en un número de preparaciones in vitro. En el primero, todas las conexiones están intactas, lo que permite al investigador para investigar cualquier conjunto de conexiones, mientras que el control de la entrada sensorial y la medición desalida en un área determinada. Con este enfoque, hay poco o ningún control de la gran variedad de otros insumos, incluyendo otros estímulos sensoriales, la excitación y la atención, dando lugar a una salida intensamente compleja. In vitro, rodajas de cerebro han sido cortadas para capturar ya sea un único conjunto de las proyecciones, o dos áreas cerebrales conectados, que permiten a los investigadores para estimular y evaluar los aferentes o áreas cerebrales diferentes. Estos son a menudo ya sea rebanadas thalamocortical o tectothalamic donde ya sea la entrada al tálamo o el tálamo y su salida a la corteza se conservan 2-5. Estas preparaciones permiten una amplia variedad de manipulaciones farmacológicas, eléctricas y optogenética. Sin embargo, con sólo dos regiones del cerebro, que evalúan principalmente la transferencia de información y carecen de la capacidad de evaluar la transformación de la información a medida que pasa a través del tálamo. También la proyección retículo-talámico, que puede desempeñar un papel en la modulación de la atención 6-9 es prESENT en este segmento. Aquí se demuestra mejoras sobre nuestra preparación previa 1, que permite el control investigador de varias entradas al tálamo para dar una perspectiva única de cómo las puertas tálamo y filtros de información. Nos pareja esta nueva preparación rebanada con imágenes de autofluorescencia flavoproteína para evaluar la conectividad rebanada y el análisis de activación a gran escala, imágenes de calcio en el tálamo para el análisis de la población neuronal, y la grabación de una sola célula para medir el impacto de las diversas entradas en un solo nivel celular. Para ayudar en el mantenimiento de estas conexiones generalizadas también hemos desarrollado una serie de modificaciones del ancla rebanada normal (también conocido como &quot;arpa&quot;) para la celebración de la corte de cerebro en su lugar y un puente para elevar la rebanada para mejorar la perfusión. El arpa está diseñado en forma de herradura modificada para rodear el corte y permitir puntos de fijación personalizables para las cuerdas del arpa. Tres cadenas sonadjunta de tal manera que i) se tiende horizontalmente a lo largo del borde medial de la rebanada, ii) Se extiende desde el extremo caudal del IC hasta el extremo caudal de la AC y iii) un extiende diagonalmente desde el borde medial de la rebanada a un área rostral a la AC (ver Figura 1 A). Muescas pequeñas en el marco de pegar (con pegamento de cianoacrilato) del arpa cadenas permiten una disminución en la cantidad de presión sobre el sector para ayudar a mantener la integridad de la rebanada (véase la Figura 1B). Mediante el uso de la impresión tridimensional, somos capaces de arpas de diseño personalizado a nuestras especificaciones únicas, así como los puentes que permiten el flujo ideal de líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa) encima y debajo del tejido. Esto también mantiene grandes áreas de luz para penetrar en el tejido de la electrofisiología de pinzamiento zonal.

<table><tbody><tr>Solución <td></td><td></td><td>de corte con alto contenido de sacarosa</td><td>en mM: 206 sacarosa, 10,0 MgCl2, 11,0 glucosa, 1,25 NaH2PO<>4, 26 NaHCO3, 0,5 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7,4</td></tr><tr><td>ACSF</td><td></td><td></td> bajo en calcio en <td>mM: 126 NaCl, 3,0 MgCl2, 10,0 glucosa, 1,25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 1,0 CaCl2, 2,5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>aCSF</td><td></td><td></td><td>en mM: 126 NaCl, 2.0 MgCl2, 10.0 glucosa, 1.25 NaH2PO4, 26 NaHCO3, 2.0 CaCl2, 2.5 KCl, pH 7.4</td></tr><tr><td>Aislador de estímulos</td><td>World Precision Instruments</td><td>A360</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Lote: 1572C502</td></tr><tr><td>Fura-2AM</td><td>Life Technologies</td><td>F1201</td><td>Lote: 144912</td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Life Technologies</td><td>P3000MP</td><td>Lote: 1499369</td></tr><tr><td>Plato de cultivo grande</td><td>Fisherbrand</td><td>08-757-13 Plato de cultivo de</td><td>100 x 15 mm Plato</td>de</tr><tr><td>cultivo pequeño</td><td>Falcon</td><td>353001</td><td>35 x10 mm Plato</td>de cultivo</tr><tr><td>Millicell Membrana de cultivo elevada</td><td>Millicell</td><td>PICMORG50</td><td>Se utiliza para mantener la perfusión de líquido oxigenado en ambos lados de la loncha.</td></tr><tr><td>cubo de fluorescencia para imágenes de flavoproteínas</td><td>Olympus</td><td>UMNIB</td><td>470&ndash; Excitación de 490 nm, dicroico de 505 nm, paso largo de emisión de 515 nm. Hemos descubierto que prácticamente cualquier cubo de filtro de proteína de fluorescencia verde funcionará aquí.</td></tr><tr><td>Cubo de fluorescencia de imagen de calcio</td><td>Omega Optical</td><td>BX-18</td><td>XF1005 365 nm de salida, XF2001 400 nm dicroico, XF3080 510 nm</td></tr><tr><td>de emisión Agar para bloquear el cerebro</td><td></td><td></td><td>3% en peso en agua</td></tr><tr><td>Viper si Aparato de litografía estereoscópica Sistemas</td><td>3D</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

modificación de un colliculo-tálamo-cortical del ratón cerebro loncha, incorporación de la impresión 3-d de la cámara componentes e imagen óptica multi-escala

Modification of a Colliculo-thalamocortical Mouse Brain Slice, Incorporating 3-D printing of Chamber Components and Multi-scale Optical Imaging

La capacidad del cerebro para procesar información sensorial depende de conjuntos de proyecciones ascendentes y descendentes. Hasta hace poco, la única forma de estudiar estos dos sistemas y cómo interactúan ha sido con el uso de preparaciones in vivo. Se han realizado grandes avances con cortes cerebrales agudos que contienen las vías talamocortical y cortico-talámica en los sistemas somatosensorial, visual y auditivo. Con refinamientos clave en nuestra reciente modificación dela corte 1 del talamocortical auditivo, podemos capturar de manera más confiable las proyecciones entre la mayoría de las principales estructuras auditivas del mesencéfalo y el prosencéfalo: el colículo inferior (IC), el cuerpo geniculado medial (MGB), el núcleo reticular talámico (TRN) y la corteza auditiva (AC). Con partes de todas estas conexiones retenidas, somos capaces de responder preguntas detalladas que complementan las preguntas que se pueden responder con preparaciones in vivo. El uso de imágenes de autofluorescencia de flavoproteínas nos permite evaluar rápidamente la conectividad en cualquier corte dado y guiar el experimento posterior. Usando este corte junto con técnicas de grabación e imagen, ahora estamos mejor equipados para comprender cómo se produce el procesamiento de la información en cada punto del prosencéfalo auditivo a medida que la información asciende a la corteza, y el impacto de la modulación cortical descendente. La impresión 3D para construir componentes de la cámara de rebanada permite la perfusión a doble cara y un amplio acceso a las redes dentro de la rebanada, y mantiene las conexiones generalizadas clave para utilizar plenamente esta preparación.

Un ejemplo de cortes de cerebro de ratón colliculo talamocortical obtenido en P15 ratón se muestra en la figura 2. El corte ideal deberá contener los cuatro grandes estructuras auditivas del cerebro medio y cerebro anterior IC, MGB, TRN, y CA, los cuales están activados cuando el IC es estimulada (Figura 2A). Utilizando el análisis de Fourier, la potencia espectral se mide en la frecuencia de estimulación eléctrica, con las regiones del cerebro que muestran conectados a...

El uso de múltiples ángulos para cortar el cerebro pup ratón, mejoramos sobre una rebanada cerebral agudo descrito previamente-que captura las conexiones entre la mayoría de las principales estructuras del mesencéfalo y el prosencéfalo auditivas.

Modificación de un Colliculo-tálamo-cortical del ratón Cerebro Loncha, incorporación de la impresión 3-D de la Cámara Componentes e Imagen óptica multi-escala

The ability of the brain to process sensory information relies on both ascending and descending sets of projections. Until recently, the only way to study ...

El objetivo general de este procedimiento es preparar un corte cortical del tálamo de Calot que incluya cuatro estructuras auditivas principales: el colículo inferior, el tálamo auditivo, la porción auditiva del núcleo reticular talámico y la corteza auditiva. Esto se logra primero extrayendo el cerebro del ratón. El segundo paso consiste en bloquear el cerebro para prepararlo para el corte.A continuación, corte el cerebro para obtener secciones que contengan la conexión tálamo-cortical de Calot. El paso final consiste en utilizar la imagen de flavoproteínas para evaluar la conectividad. En última instancia, la sección de cerebro que contiene la conexión carotal cortical puede utilizarse para una variedad de experimentos destinados a comprender mejor el procesamiento de la información en las regiones auditivas del cerebro medio y del cerebro anterior. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos para bloquear el cerebro antes del corte son difíciles de aprender porque requieren un corte doble angular complejo, clave para obtener proyecciones intactas.La técnica será demostrada por BJ Slater, un estudiante de posgrado en mi laboratorio. Para preparar la eta

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En este artículo presentamos una técnica sencilla y práctica para la fundición cerebrovascular que es fácil de realizar y pueden ser utilizados para obtener imágenes del árbol vascular del cerebro del ratón adulto.

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Preparación de cortes colínculo-talamocorticales a partir del cerebro de un cachorro de ratón

Este video muestra el registro de la actividad neuronal del cerebro a través de una ventana óptica en ratones transgénicos. Los ratones expresan una proteína fluorescente que permite la detección de actividades neuronales. Se extrae cuidadosamente una pequeña porción del cráneo para instalar una ventana óptica, y luego se cubre el cráneo con cemento negro para bloquear la luz antes de la obtención de imágenes.

Instalación de ventanas ópticas en el cerebro de ratones transgénicos para visualizar actividades neuronales

En este artículo se describe el procedimiento experimental completo para reconstruir, con alta resolución, la anatomía del cerebro multa de cerebros de ratón marcados con fluorescencia. El protocolo descrito incluye la preparación de muestras y el desmonte, la muestra de montaje para imágenes, datos post-procesamiento y visualización multi-escala.

Micron escala Resolución óptica tomografía de cerebro de ratón enteras con Hoja confocal Microscopía de Luz

Utilizando resonancias magnéticas (humanas), software de imágenes 3D y análisis inmunohistológicos, documentamos los cambios en los ventrículos laterales del cerebro. El mapeo longitudinal en 3D de los cambios en el volumen del ventrículo lateral y la caracterización de los cambios celulares periventriculares que ocurren en el cerebro humano debido al envejecimiento o la enfermedad se modelan en ratones.

Modelado 3D del lateral Ventrículos y histológico Caracterización de Tejidos periventricular en los seres humanos y de ratón

Aquí, presentamos un procedimiento para la realización de gran escala Ca 2 + imágenes con resolución celular a través de múltiples capas corticales en los ratones que se mueven libremente. Cientos de células activas se pueden observar simultáneamente usando un microscopio en miniatura montado en la cabeza acoplado con una sonda de prisma implantada.

Ca Cortical Multi-capa<sup&gt; 2+</sup&gt; Imágenes en ratones con movimientos libres con sondas de prisma y microscopía de fluorescencia miniaturizada

Aquí describimos un procedimiento para tejido claro etiquetado fluorescente y a gran escala imagen de tejido de cerebro de ratón que, por lo tanto, permite la visualización de la organización tridimensional de tipos celulares en el neocortex.

Proyección de imagen tridimensional a gran escala de la organización celular en el Neocortex de ratón

Se describe un método innovador para construir matrices cerebrales expansibles que corten cortes coronales o sagitales para su aplicación en lechones neonatales. Este enfoque económico utiliza placas acrílicas talladas con plantillas de moldura cerebral en gel de agarosa, se aplica a múltiples especies y permite la expansión para acomodar el crecimiento cerebral.

Fabricación de una matriz cerebral expansible personalizable a través de las etapas de desarrollo

Aprende a preparar rebanadas colículo-tálamo-corticales en cerebro de ratón para estudiar procesamiento auditivo mediante corte doble angular e imagen de flavoproteínas. Esta técnica preserva proyecciones intactas de cuatro estructuras auditivas principales.

Modificación de un Colliculo-tálamo-cortical del ratón Cerebro Loncha, incorporación de la impresión 3-D de la Cámara Componentes e Imagen óptica multi-escala (Video) | JoVE Journal

Modificación de un Colliculo-tálamo-cortical del ratón Cerebro Loncha, incorporación de la impresión 3-D de la Cámara Componentes e Imagen óptica multi-escala

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