Análisis de estructuras amiloides en una sección de tejido mediante microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida

Tome una sección de tejido con agregados amiloides que representen depósitos de proteínas anormales.

El tejido se tiñe con el colorante fluorescente ácido heptámero-formil tiofeno acético o hFTAA, que se une específicamente a las estructuras de láminas beta de las fibrillas amiloides.

Obtener imágenes del portaobjetos utilizando un microscopio confocal equipado con una unidad de microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida, que mide la vida útil de fluorescencia de las moléculas de colorante.

Optimice la configuración del microscopio para una excitación efectiva de las moléculas de colorante.

Cuando la luz láser ilumina el tejido, el hFTAA excita y emite fluorescencia.

Una unión de colorante más fuerte en estructuras compactas da como resultado una vida útil más larga, mientras que una unión de tinte más débil en estructuras menos compactas conduce a una vida útil más corta.

Más tarde, el software genera una imagen codificada por colores del agregado.

Los colores, como el rojo y el amarillo, aparecen en la periferia, lo que indica una vida útil de fluorescencia más corta que refleja estructuras amiloides menos compactas e inestables.

Mientras que los colores como el azul y el verde en el núcleo representan una vida útil de fluorescencia más larga, reflejando estructuras amiloides más compactas y estables.

El día de la tinción, sumerja las secciones en baños consecutivos de etanol al 99%, etanol al 70%, dH_2O y PBS durante 10 minutos cada vez, luego deje que las secciones de tejido se sequen en condiciones ambientales. Mientras se seca el tejido, prepare una solución de trabajo de HFTAA diluyendo el caldo de 1 a 10,000 en PBS. Cuando el tejido esté seco, agregue gotas de la solución de trabajo HFTAA a cada sección de tejido para cubrirlo. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Enjuague la solución de tinción con 500 microlitros de PBS y luego sumerja el portaobjetos en el baño de PBS durante 10 minutos. Después de dejar que la sección se seque en condiciones ambientales, móntelo con un medio de montaje de fluorescencia. Deje que el medio de montaje se asiente durante la noche.

La detección de amiloide se puede realizar directamente después del montaje o incluso sin montaje. Sin embargo, si el objetivo del experimento es recopilar información espectral de alta calidad, se prefiere la incubación nocturna.

Cambie el microscopio al modo FLIM, ajuste el estenopeico a 20, la longitud de onda de excitación a 490 nanómetros y la intensidad del láser al 0,5%. Utilice láseres pulsados a 40 megahercios. En el software FLIM, configure el conteo de fotones de más de 550 nanómetros. En la ventana Parámetros de visualización, siga el recuento de fotones hasta que el recuento máximo sea de alrededor de 4.000 recuentos de fotones. Guarde el archivo y expórtelo como imagen SPC.