Análisis microscópico de sinapsis en cortes de hipocampo de ratón mediante inmunofluorescencia

Coloque una rebanada de hipocampo de un cerebro de ratón en un pozo que contenga un búfer. El corte contiene una red de neuronas que se comunican a través de sinapsis.

Los terminales de las neuronas presinápticas contienen vesículas llenas de neurotransmisores con transportadores transmembrana característicos, mientras que los terminales postsinápticos presentan proteínas de andamio características que regulan los receptores de neurotransmisores. Ambos sirven como marcadores clave para las estructuras sinápticas.

Reemplace el tampón con una solución bloqueadora de la permeabilización e incube con agitación para permeabilizar las membranas celulares y bloquear los sitios de unión no específicos.

Agregue anticuerpos primarios dirigidos a los marcadores presinápticos y postsinápticos e incube con agitación para permitir la unión.

Lave la rebanada, agregue anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforos específicos para los anticuerpos primarios e incube con agitación en la oscuridad.

Lava la rebanada y luego móntala en una diapositiva.

Con un microscopio confocal, identifique la región de interés y amplíe para visualizar las sinapsis.

Capture imágenes para identificar los marcadores presinápticos y postsinápticos marcados con fluorescencia y evaluar su colocalización en las sinapsis.

Para comenzar la tinción de inmunofluorescencia, reemplace el PBS en los pocillos de corte con tampón de bloqueo y permeabilización, e incube a temperatura ambiente durante 4 a 6 horas en el agitador. Hacia el final del paso de bloqueo, diluya el anticuerpo a VGLUT1 1 a 2000 en tampón de bloqueo y permeabilización. Tenga en cuenta que esta dilución puede diferir según la compañía y la cantidad de anticuerpos utilizados. Incube las rodajas en la solución de anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados centígrados. Use una plataforma vibratoria con movimientos vigorosos.

La distribución uniforme de los anticuerpos primarios y secundarios es importante para una tinción óptima. En nuestra experiencia, la agitación vigorosa permite la mejor penetración de anticuerpos.

Después de la incubación en el anticuerpo primario, lave las rodajas tres veces en PBS durante 10 minutos cada vez como antes. Durante el último lavado, diluya los anticuerpos secundarios apropiados de 1 a 500 en tampón de bloqueo. Luego incube las rodajas en esta solución durante 2 a 3 horas a temperatura ambiente. Asegúrese de que las rodajas estén protegidas de la luz, ya que los anticuerpos secundarios son sensibles a la luz.

Después de lavar las rodajas como antes, use un cepillo para retirar con cuidado las rodajas de la placa de 24 pocillos y colóquelas uniformemente en portaobjetos de vidrio preetiquetados. Agregue una gota de medio de montaje encima de cada rebanada. Y luego coloque suavemente un cubreobjetos de vidrio encima de las rodajas, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas de aire.

Protéjalo de la luz y deje que los portaobjetos se sequen durante un mínimo de tres a cuatro días a temperatura ambiente. Guarde los portaobjetos a 4 grados centígrados a corto plazo. Pero para el almacenamiento a largo plazo, manténgalos a menos 20 grados centígrados. Comience usando un objetivo de 10x o 20x para identificar la región del hipocampo que se va a visualizar, en este caso, las sinapsis entre las neuronas piramidales CA1 y los axones colaterales de Schaffer.

Cambie a un objetivo de inmersión en aceite de 40x o 63x y asegúrese de que la anatomía del corte esté intacta identificando neuritas continuas y una estructura organizada. Utilice un marcador neuronal, como MAP2, como referencia. Ajuste la configuración de cada canal para obtener una señal y un contraste óptimos con una resolución de 1024 por 1024 píxeles. Establezca la intensidad de cada láser para evitar la saturación de los píxeles.

Evalúe la profundidad donde la tinción es uniforme y luego configure el software para adquirir pilas de imágenes de al menos ocho planos equidistantes de 250 nanómetros. A continuación, tome tres pilas de imágenes representativas adyacentes de la misma área de interés por rebanada. Repetir la adquisición en al menos tres cortes por condición y de seis a ocho animales por grupo de tratamiento.