Visualización de la actividad de la proteína quinasa A en un ratón mediante microscopía de imágenes de fluorescencia de dos fotones

Asegure un ratón anestesiado con una ventana craneal sobre su corteza motora en una cinta de correr.

El ratón expresa un reportero de proteína quinasa-A en las neuronas corticales.

Coloque la cinta de correr debajo de un objetivo FLIM de dos fotones.

Agrega una gota de agua entre el objetivo y la ventana craneal.

Permita que el mouse se despierte y se aclimate a la cinta de correr.

Usando iluminación de campo claro, ubique la región de imágenes. Cierre la carcasa del microscopio para bloquear la luz externa.

Establezca los parámetros de imagen, inicie la rotación de la cinta de correr para inducir la locomoción y comience a obtener imágenes.

La locomoción forzada activa la PKA, que fosforila al reportero, acercando sus fluoróforos donantes y aceptores.

El microscopio dirige un láser infrarrojo, excitando al donante para que transfiera energía al aceptor, reduciendo la vida útil de fluorescencia del donante.

Cuando la locomoción se detiene, PKA y el reportero vuelven a sus estados inactivos, disminuyendo la transferencia de energía y aumentando la vida útil de fluorescencia del donante.

Analice las imágenes para comparar los niveles corticales de PKA durante el reposo y la locomoción.

Al menos dos semanas después de la instalación de la ventana craneal, establezca la longitud de onda del láser de excitación de dos fotones en 960 nanómetros y confirme la falta de respuesta al pellizco del dedo del pie en el ratón experimental anestesiado. Coloque el mouse anestesiado en la cinta de correr motorizada y monte la placa de cabeza del mouse en el soporte de la placa de cabeza de la configuración de la cinta de correr. Limpie la superficie del cubreobjetos de la ventana craneal con etanol al 70% y coloque la cinta de correr motorizada debajo del objetivo 2pFLIM.

Aplique una gota de agua destilada entre el cubreobjetos de la ventana craneal en el objetivo y permita que el ratón se despierte y se aclimate al entorno de la cinta de correr y el microscopio durante al menos 10 minutos. Navegue hasta el lugar de la inyección bajo epiiluminación y documente las características fiduciales bajo campo claro para ayudar en la obtención de imágenes de la misma región de interés durante las sesiones de imágenes posteriores.

Apague la fuente de luz de epiiluminación. Incluya la carcasa del equipo de microscopio 2pFLIM. Para activar los tubos fotomultiplicadores del microscopio 2pFLIM, encienda el control de voltaje de comando de hardware. Para adquirir una imagen Z-stack 2pFLIM, establezca el tamaño de la imagen en 128 por 128 píxeles. La velocidad de escaneo es de 2 milisegundos por línea, el campo de visión de 90 a 100 micrómetros en el cuadro, con un promedio de tres cuadros.

Ajuste la configuración de imágenes en función de la preparación y la configuración del hardware. E inspeccione la imagen adquirida en la vista FLIM. Utilice un campo de visión reducido, una velocidad de escaneo reducida, una mayor potencia láser y un mayor número de fotogramas a promediar para aumentar el número de fotones integrados y reducir el error de estimación de la vida útil según sea necesario.

Asegúrese de obtener suficientes fotones por región de interés. Un recuento de fotos integrado viable para un soma positivo a la vista es de aproximadamente 1,000 a 10,000 fotones.

Cuando la imagen se haya optimizado, adquiera imágenes de pila Z repetidas de referencia a intervalos regulares durante al menos 15 minutos a velocidad 0 en la cinta de correr. Luego, configure la rotación de la cinta de correr a aproximadamente centímetros por segundo durante 15 minutos mientras adquiere imágenes de 2pFLIM, seguido de al menos 20 minutos de adquisición de imágenes después de apagar la rotación de la cinta de correr para evaluar la duración de la actividad de la proteína quinasa A después del cese de la locomoción forzada.

Para el análisis de imágenes 2pFLIM, abra las imágenes en la vista de película y haga clic en los campos de rango mínimo y máximo de recuento de fotones individuales para ingresar los valores de rango de recuento mínimo y máximo de fotones individuales apropiados. Haga clic en el campo de valor de tiempo 0 para introducir el valor de tiempo 0 y haga clic en el campo de valor de umbral mínimo de luminancia de vida útil para introducir el valor de umbral deseado entre 5 y 30 fotones.

Haga clic en el botón Nuevo grupo y asigne un nombre de grupo de experimentos para generar un grupo que combine los datos de cada imagen FLIM agregada. Haga clic en Región de interés en el módulo de controles de región de interés y dibuje una región de interés alrededor de un soma T-ACCR alfa positivo. Mueva el límite Z inferior y superior en los controles deslizantes de control de la pila Z para reducir el rango de la pila Z y minimizar la contaminación de la señal que se origina en los fotones de fondo y otras caídas Z, y haga clic en Más para agregar la imagen FLIM al grupo.

Haga clic en calc para calcular la vida media en el error de estimación de la vida útil para la región de interés y abra el siguiente archivo de la serie de imágenes 2pFLIM. Mida el mismo soma T-ACCR alfa positivo en cada imagen consecutiva a lo largo del tiempo, ajustando la región de interés alrededor del soma según sea necesario. Cuando se hayan analizado todas las imágenes, seleccione el tiempo medio de emisión de fotones delta fotoemisión media delta T0 en el módulo de controles de grupo y haga clic en el campo de número de línea base para ingresar el índice de las imágenes de interés para definir las imágenes utilizadas para calcular la vida útil de la línea de base.

Luego, haga clic en el gráfico para generar un gráfico que contenga la respuesta de FLIM a la actividad T-ACCR alfa positiva durante el experimento en las regiones de interés definidas para permitir una comparación de la actividad de la proteína quinasa A durante la locomoción de la quinasa en diferentes regiones de interés.