Visualización de la migración de células de la cresta neural en un embrión de pez cebra mediante imágenes de lapso de tiempo multifotónicas

Comience con un embrión de pez cebra transgénico vivo y descorionado incrustado en agarosa de bajo punto de fusión y colocado en una cámara llena de medios embrionarios.

El embrión expresa células de la cresta neural marcadas con proteína verde fluorescente mejorada (EGFP).

Coloque la cámara en la platina del microscopio. Usando iluminación de campo claro, ajuste el objetivo para enfocar y centrar el embrión en el campo de visión.

Cambie al objetivo de inmersión en agua y vuelva a centrarse en el embrión.

Ajuste los parámetros de imagen para adquirir imágenes de pila Z desde el borde lateral hasta el medial, capturando el ancho del ojo.

Apague la iluminación de campo claro, cubra el escenario e inicie imágenes de lapso de tiempo.

Vuelva a llenar la cámara con medios según sea necesario durante la obtención de imágenes.

Bajo iluminación láser, las células de la cresta neural emiten fluorescencia.

Visualice la migración de estas células desde el tubo neural hacia las regiones craneofaciales, alrededor del ojo en desarrollo para poblar el mesénquima periocular y el proceso frontonasal, y ventralmente para formar los arcos faríngeos.

Después de colocar toda la configuración en la platina del microscopio, de acuerdo con el protocolo de texto, use el objetivo de cinco veces para localizar el embrión. Luego, levante manualmente la platina a la posición más alta y use el enfoque fino para colocar el embrión en el medio del rango del microscopio.

Baje manualmente la etapa y cambie el objetivo de cinco veces al objetivo de inmersión en agua de 25 veces. Levante con cuidado la etapa para volver a enfocar el embrión. En el software, haga clic en el modo xyzt para obtener múltiples imágenes a intervalos de tiempo o t en el plano xy sobre una profundidad de z.

Utilice la vista de epifluorescencia o campo claro para encontrar la profundidad de enfoque en el área de interés, lo que demarcará la pila z. Para estos experimentos, el borde lateral del ojo es el comienzo de la pila z. Cuando se enfoque aquí en el software, haga clic en el botón Comenzar. Después de enfocar la línea media del embrión, que es el final de la pila z, haga clic en el botón Finalizar.

Un paso crítico es asegurarse de que el paso z abarque el área de interés. En nuestro caso, queremos capturar el ancho del ojo desde los bordes laterales hasta mediales.

Haga clic en el menú para ajustar el tiempo de adquisición y la frecuencia de imagen. Para una recuperación adecuada del fluoróforo y la supervivencia del embrión, permita una relación de al menos 1 a 3 entre la adquisición de la pila z cuando la energía del láser está encendida y el tiempo de recuperación cuando la energía del láser está apagada. Con el tiempo adecuado para la recuperación del embrión, establezca el tiempo entre las pilas en z y la ventana designada. A continuación, establezca el período de tiempo total para el experimento en la ventana correspondiente.

Ahora active la configuración de imagen en vivo para realizar los ajustes finales en la configuración del láser. Ajuste las barras deslizantes de transmisión, ganancia y desplazamiento del láser dentro del software para optimizar la imagen de fluorescencia. Además, ajuste la orientación del embrión según sea necesario según la duración del experimento, el crecimiento anticipado del embrión, etc. Asegúrese de que el área de interés permanezca dentro del marco durante la duración del experimento.

Durante la adquisición de lapso de tiempo, apague la fuente de luz de epifluorescencia. Cubra el escenario con la caja de seguridad láser, que es adecuada para protegerse de la luz de fondo. Luego presione Inicio.

Acceda a la cámara de baño abierta a través de las puertas correderas de la caja de seguridad láser para rellenarla con medio embrionario de lapso de tiempo cada 8 a 12 horas. Después de la adquisición de imágenes, abra los archivos en el software de procesamiento de imágenes. Resalte la serie de imágenes correcta.

En el software, elija el menú Proceso. Haga clic en Deconvolución 3D y solicite la desconvolucionación de cada pila z. Importe archivos TIFF individuales en software de procesamiento de video. Luego seleccione todos los archivos TIFF y arrástrelos al editor de video. Ajuste la duración de cada imagen dentro del video a 0.1 segundos. Finalmente, exporte el video como un archivo MOV o MP4.