Name: Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-02-03T16:25:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprende a visualizar la motilidad celular y la dinámica del citoesqueleto de actina en neuronas individuales y células de la cresta neural de embriones de pez cebra Danio rerio mediante microscopía confocal de fluorescencia en tiempo real.

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Este trabajo fue apoyado por el NIH R01 NS042228 para MCH El confocal Olympus FV1000 fue adquirido con una instrumentación NIH subvención compartida S10RR023717 al Departamento de Zoología de la Universidad de Washington (PI Bement Bill). Erica Andersen, Asuri Namrata, y Clay Mateo contribuyeron igualmente a este trabajo.

1. Montaje de diapositivas y las diapositivas de imágenes de la inyección Diapositivas de inyección: <ol><li> Prepare elastómero de silicona Sylgard de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Utilice el Sylgard de enlace de tres de vidrio para microscopio estándar portaobjetos, apilando una diapositiva en la parte superior de la intersección de las otras dos diapositivas, que están dispuestos lado a lado en los bordes largos. El carro superior crea una esquina en ángulo recto o "muro" entre la parte superior e inferior se desliza. </li><li> Vamos Sylgard toda la noche. Estas diapositivas son reutilizables. </li></ol> Imágenes de diapositivas: <ol><li> Nosotros usamos rectángulos de acero inoxidable cortado con el mismo tamaño de un portaobjetos de microscopio de vidrio estándar (75mm x 25mm x 1mm) por lo que la cámara se ajusta el soporte de diapositivas sobre la platina del microscopio. Un agujero de 1,5 cm se corta en el centro del rectángulo. </li><li> Ponga un cubreobjetos de 22 mm 2 para el rectángulo de metal con Sylgard. Use sólo lo suficiente para sellar completamente Sylgard el cubreobjetos. A la imagen en un microscopio invertido, los embriones se monta en este cubreobjetos y la imagen de abajo. </li><li> Vamos Sylgard toda la noche. Estas diapositivas son reutilizables y se limpia con etanol al 70% entre los usos. </li></ol> 2. Preparación de construcciones de ADN Para expresar un transgén en un tejido específico, el gen de interés se clona detrás de un promotor específico de las células. Usamos un elemento cis-reguladoras del gen de pez cebra neurogenin1 (-3.1ngn1) 2 o el gen SOX10 (-4.9sox10) 3 para dirigir la expresión en las neuronas sensoriales o las células de la cresta neural, respectivamente. Para visualizar la dinámica celular y la membrana, expresamos citoplasma o fluoróforos localizado a la membrana. A la imagen de la F-actina de distribución, que expresa el ADN que codifica el dominio de homología calponin de utrofina fusionado a mCherry (UtrCH-mCherry). La sonda UtrCH-mCherry biosensor permite la visualización de la F-actina, sin interferir con la dinámica de actina 1. Generamos estas construcciones de ADN utilizando la puerta de enlace Invitrogen recombinación estrategia basada en la clonación de 4 y vectores siempre en el pez cebra Tol2kit 5. <ol><li> Generar vector de expresión (s) con varios sitios-Gateway Tecnología y vectores de la Tol2kit pez cebra 5. Plásmidos contienen la columna vertebral de Tol2 pT2KXIGDin. </li><li> Purificar el ADN plásmido con QIAfilter plásmido kit de preparación Midi (QIAGEN Inc.) y eluir con agua estéril. El ADN no tiene por qué ser lineal para la inyección. </li></ol> 3. La inyección de construcciones de ADN <ol><li> Diluir el ADN a una concentración final de 10-50 mg / ml de ADN en el 0,2% de rojo fenol (para la visualización durante la inyección) en el agua. </li><li> Relleno y calibrar la aguja: Volver a llenar una aguja sacó capilar con aproximadamente 1 l solución de ADN e insertarlo en el soporte de la aguja del aparato de inyección (se utiliza un Picospritzer). Con una pinza fina, romper la punta de la aguja de modo que la apertura de la punta es de aproximadamente 10 mm de diámetro. Mida el diámetro de la gota de aceite mineral con un micrómetro ocular. Ajustar la configuración de la presión de tiempo para obtener una gota de aproximadamente un volumen de la Liga Nacional. </li><li> Recoger una de las células de embriones etapa de embrión en un medio de E3 (5 mM NaCl, KCl 0,17 mm, 0,33 mm de CaCl2, 0,33 mm MgSO 4 * 7H 2 O, pH 7,0). </li><li> Transferencia de aproximadamente 30-60 embriones a la diapositiva de la inyección y la posición de los embriones en la esquina en ángulo recto formado entre la parte superior e inferior se desliza. Eliminar la mayor parte de la E3, para que los embriones se mantienen a la diapositiva por la tensión superficial. </li><li> Use un alfiler doblado la disección de embriones para rotar por lo que la célula está contra la pared de la diapositiva de la inyección. </li><li> Use un micromanipulador para guiar la aguja a través del corion del embrión, a través de la yema de huevo y en la única célula del embrión. Se inyecta 0,5-1 solución de ADN nl en la célula. </li><li> La transferencia de los embriones en placas de Petri en el E3 y se incuba a 28,5 º C. Si es necesario, el desarrollo puede ser frenado mediante la incubación de los embriones a una temperatura más baja. </li></ol> 4. Embriones de montaje de imágenes <ol><li> Retire el corion de los embriones con unas pinzas finas de aproximadamente una hora antes de los embriones llegan a la edad deseada para la imagen (aproximadamente 14-17 horas después de la fertilización para nuestros propósitos). </li><li> Seleccionar los embriones con células marcadas con un microscopio de disección equipado con fluorescencia. Nosotros usamos un objetivo de 4X (40x) en un ámbito Nikon AZ100 debido a su combinación de larga distancia de trabajo y una gran ampliación. </li><li> Lugar a un embrión en un tubo de microcentrífuga con aproximadamente 50 l E3 que contiene 0,2% tricaína anestesia (concentración 10 veces). </li><li> Añadir 500 l 1% de agarosa de bajo punto de fusión en el E3 con 10 mM HEPES (mantenido a 42 ° C), diluyendo la tricaína a una concentración final de 0,02%. </li><li> Inmediatamente la transferencia del embrión en una caída de agarosa alcubreobjetos de la diapositiva de imagen utilizando una amplia gama de pipetas de vidrio diámetro. </li><li> Antes de la agarosa se endurece, la posición del embrión para la región con células marcadas es hacia abajo, contra el portaobjetos inferior (abajo dorsal de las células de la cresta neural y dorsolateral abajo de la columna vertebral neuronas sensoriales). </li><li> Ensamble de cámara de imagen: Cubra un lado de un anillo de plástico (2 cm de diámetro exterior, 3 mm de alto) con grasa de silicona al vacío y colocar a la diapositiva de imagen de metal. Escudo del otro lado del ring con grasa. </li><li> Llenar la cámara con el E3 que contiene HEPES 10 mM y 0,02% tricaína. Selle la parte superior la cámara mediante la colocación de 22 mm 2 cubreobjetos a la superficie superior del anillo engrasado. </li></ol> 5. Imágenes 4D del comportamiento celular en el Olimpo FV1000 confocal con IX81 microscopio Los detalles de la adquisición de la imagen dependerá de los detalles de su sistema de microscopía. A continuación se describe el proceso de adquisición de lapso de tiempo para la Olympus FV1000 microscopio confocal. Ver el protocolo anterior JoVe para la adquisición de lapso de tiempo con el Zeiss LSM 510 confocal sistema 6. <ol><li> Coloque la cámara de imágenes en el soporte de diapositivas sobre la platina del microscopio y se centran en el embrión con un objetivo 20X 10X o bajo luz transmitida. </li><li> Cambiar a un objetivo de 60x (NA de 1.2 o superior) y se centran en la celda marcada con epifluorescencia. Nosotros usamos ni una inmersión en aceite (UPLSAPO 60xO NA 1,35) o de inmersión en agua (UPLSAPO 60xW NA 1.20) de la lente. </li><li> En el software de FV (Ver 1.7c), haga clic en la repetición de XY para iniciar la digitalización láser. </li><li> Ajustar los valores de adquisición y control de adquisición de imágenes (de salida del láser, velocidad de exploración, HV, ganancia y niveles de compensación) para optimizar la señal, manteniendo la potencia del láser, como mínimo (25% o menos) para evitar daños en los tejidos y reducir photobleaching. </li><li> Para adquirir una de la serie Z, establecer los límites superior e inferior de la z-stack, junto con el tamaño de paso. Asegúrese de que el icono de profundidad se dedica a fin de que el icono de barrido XY XY y Z destacó. Iniciar la adquisición haciendo clic en el icono de Barrido XYZ. </li><li> Para adquirir una serie de lapso de tiempo, establezca el intervalo de tiempo y el número de puntos de tiempo bajo el título TimeScan en la ventana de Configuración de la adquisición. Haga clic en el icono de tiempo en la ventana de control de imagen de adquisición para que el icono de barrido XY XY (Z) y destacó T. Iniciar la adquisición, haga clic en el gráfico XY (Z) en el icono Barra T. </li><li> Por otra parte, la TimeController se puede utilizar para establecer un lapso de tiempo. Esta programación es útil cuando se generan grandes cantidades de datos, ya que no exceda la asignación de memoria. En Dispositivo, abra la ventana TimeController. Crear una tarea nueva imagen. La ventana de parámetros de imagen se abrirá. Haga clic en el botón Estado de FV para actualizar los ajustes de adquisición. Asegúrese de guardar y Eliminar se observan bajo el título Terminar. Establecer el nombre del archivo de salida y haga clic en Aceptar para guardar la configuración y cerrar la ventana. Utilice la función de bucle para establecer el intervalo de tiempo deseado y el número de puntos de tiempo. Haga clic en Listo y en Iniciar para comenzar la adquisición. La pausa y cambio de funciones-Z se puede utilizar para reorientar al mismo tiempo de imagen. </li></ol> 6. Resultados representante Las cifras y las películas muestran ejemplos de las neuronas sensoriales y las células de la cresta neural marcada con fluoróforos específicos de membrana o la sonda biosensor de actina. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1 Confocal de imágenes (z-proyecciones) de Tg (ngn1: GFP-CAAX). Embriones transgénicos inyectados con 25 pg ngn1: mCherry-CAAX ADN. Las etiquetas mCherry-CAAX una neurona roja (A) en un fondo con todas las neuronas sensoriales-Barba Rohon etiqueta verde (B). C) imagen combinada de los canales verde y rojo. Barra de escala = 50 micras. <img src="/files/ftp_upload/1726/1726fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2 confocal z-proyecciones de las neuronas en embriones inyectados con aproximadamente 20 pg ngn1:.. MCherry-UtrCH ADN A) Rohon-Barba neuronas sensoriales en el embrión HPF 16,5. F-actina de la señal es fuerte en los conos de crecimiento (puntas de flecha) y salientes a lo largo de los axones de reciente formación. B) de neuronas en embriones HPF 20 mostrando una fuerte señal de la F-actina en los conos de crecimiento de los axones ramificados periférica (puntas de flecha) y el más débil de la señal en el centro de mayor madurez axones (flechas). Barra de escala = 50 micras.

<ol><li>Burkel, B. M., von Dassow, G., Bement, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Versatile+fluorescent+probes+for+actin+filaments+based+on+the+actin-binding+domain+of+utrophin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+motility+and+the+cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Versatile fluorescent probes for actin filaments based on the actin-binding domain of utrophin.</a> Cell motility and the cytoskeleton. 64, 822-832 (2007).</li>
<li>Blader, P., Plessy, C., Strahle, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+regulatory+elements+with+spatially+and+temporally+distinct+activities+control+neurogenin1+expression+in+primary+neurons+of+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Multiple regulatory elements with spatially and temporally distinct activities control neurogenin1 expression in primary neurons of the zebrafish embryo.</a> Mech Dev. 120, 211-218 (2003).</li>
<li>Wada, N., Javidan, Y., Nelson, S., Carney, T. J., Kelsh, R. N., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+signaling+is+required+for+cranial+neural+crest+morphogenesis+and+chondrogenesis+at+the+midline+in+the+zebrafish+skull%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Hedgehog signaling is required for cranial neural crest morphogenesis and chondrogenesis at the midline in the zebrafish skull.</a> Development. 132, 3977-3988 (2005).</li>
<li>Cheo, D. L., Titus, S. A., Byrd, D. R., Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+assembly+and+cloning+of+multiple+DNA+segments+using+in+vitro+site-specific+recombination%3A+functional+analysis+of+multi-segment+expression+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Concerted assembly and cloning of multiple DNA segments using in vitro site-specific recombination: functional analysis of multi-segment expression clones.</a> Genome Res. 14, 2111-2120 (2004).</li>
<li>Kwan, K. M., Fujimoto, E., Grabher, C., Mangum, B. D., Hardy, M. E., Campbell, D. S., Parant, J. M., Yost, H. J., Kanki, J. P., Chien, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Tol2kit%3A+a+multisite+gateway-based+construction+kit+for+Tol2+transposon+transgenesis+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs.</a> Dev Dyn. 236, 3088-3099 (2007).</li>
<li>O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+axotomy+and+time-lapse+confocal+imaging+in+live+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. 24, (2009).</li>
<li>Berndt, J. D., Clay, M. R., Langenberg, T., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho-kinase+and+myosin+II+affect+dynamic+neural+crest+cell+behaviors+during+epithelial+to+mesenchymal+transition+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho-kinase and myosin II affect dynamic neural crest cell behaviors during epithelial to mesenchymal transition in vivo.</a> Dev Biol. 324, 236-244 (2008).</li>
</ol>

La concentración óptima de ADN inyectado puede variar dependiendo del tamaño y la fuerza del promotor de la construcción y debe ser determinada empíricamente. La inyección de ADN en exceso puede conducir a los embriones saludables con una extensa muerte celular, mientras que muy poco se traducirá en una proporción muy pequeña de los embriones inyectados expresar el transgén. El nivel de expresión de ADN se correlaciona con la fuerza de la señal de fluoróforo, el cual varía de célula a célula. Aunque la clasificación de ...

<table><tbody><tr><td>Tricaina (metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040-250G</td><td></td></tr><tr><td>Kit de elastómero de silicona Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Kit QIAfilter Plásmido Midi</td><td>Qiagen</td><td>12243</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa de punto de fusión baja</td><td>Invitrogen</td><td>15517-014</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer</td><td>Parker Hannifin Corporation</td><td>051-0302-900</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

Live Imaging of Cell Motility and Actin Cytoskeleton of Individual Neurons and Neural Crest Cells in Zebrafish Embryos

El pez cebra es un modelo ideal de comportamiento celular durante el desarrollo de imágenes en vivo. Embriones de pez cebra son fertilizados externamente y por lo tanto fácilmente accesible en todas las etapas de desarrollo. Además, su claridad óptica permite imágenes de alta resolución de la célula y de dinámica molecular en el medio natural del embrión intacto. Estamos utilizando un enfoque de imágenes en vivo para analizar los comportamientos celulares durante la migración neuronal células de la cresta y la consecuencia y la orientación de los axones neuronales. Imágenes en vivo es particularmente útil para comprender los mecanismos que regulan los procesos de motilidad celular. Para visualizar los detalles de la motilidad celular, tales como la actividad protrusiva y dinámica molecular, es ventajoso para etiquetar las células individuales. En el pez cebra, la inyección de ADN plásmido se obtiene un patrón de mosaico la expresión transitoria y ofrece claras ventajas sobre otros métodos de etiquetado celular. Por ejemplo, las líneas transgénicas con frecuencia etiqueta a poblaciones enteras de células y por lo tanto pueden dificultar la visualización de las protuberancias finas (o cambios en la distribución molecular) en una sola célula. Además, la inyección de ADN en el estadio de una célula es menos invasiva y más precisa que las inyecciones de colorante en las etapas posteriores. Aquí se describe un método para el etiquetado de cada desarrollo de las neuronas o las células de la cresta neural y las imágenes de su comportamiento in vivo. Se inyecta el plásmido de ADN en una célula de embriones etapa, que se traduce en la expresión del transgen mosaico. Los vectores contienen células específicas de los promotores que dirigen la expresión de un gen de interés en un subconjunto de neuronas sensoriales o las células de la cresta neural. Proporcionamos ejemplos de células marcadas con GFP membrana selectiva o con una sonda de biosensor que permite la visualización de la F-actina en las células vivas 1. Erica Andersen, Asuri Namrata, y Clay Mateo contribuyeron igualmente a este trabajo.

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

El pez cebra es un modelo ideal para la obtención de imágenes de los comportamientos celulares durante el desarrollo in vivo. Los embriones de pez cebra se fertilizan externamente y, por lo tanto, son fácilmente...

Para observar el comportamiento de células individuales in vivo, se inyecta ADN plasmídico en embriones de pez cebra que contiene un promotor específico de célula que dirige la expresión de una flor de cuatro o un biosensor. Los cambios dinámicos en el efecto y la distribución se visualizan in vivo utilizando un biosensor basado en el dominio de unión al efecto F y en la utrofina. Los embriones recién fertilizados se alinean a lo largo de la placa de inyección y se colocan en la esquina formada entre las placas superior e inferior.Se inyecta ADN que codifica fluoros cuatro o biosensores en la célula. Al día siguiente, los embriones se montan en aros.En el portaobjetos de imagen, los embriones se colocan con las células marcadas hacia abajo y la cámara se sella con un cubreobjetos. Hola, soy Erica Anderson del Laboratorio de Mary Hallin y de los departamentos de Zoología y Anatomía de la Universidad de Wisconsin Madison. Soy Nam Tauri, también del Laboratorio Hallin.Y soy Matt Clay del laboratorio de Hallin. Hoy les mostraremos un procedimiento para la obtención de imágenes en vivo de células individualmente marcadas en embriones de pez cebra. Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar la motilidad celular y la dinámica de la actina durante el crecimiento de los axones y la migración de las células de la cresta neural.Así que comencemos. Para armar las placas de inyección primero, prepare el elastómero de silicona cyl guard según las instrucciones del fabricante. Mezcle 10 partes de la base del elastómero con una parte del agente de curado.Utilice el protector cilíndrico para unir tres portaobjetos de vidrio estándar. Coloque dos portaobjetos uno al lado del otro por los bordes largos. Aplique ARD al tercer portaobjeto y colóquelo encima de los otros dos.Utilice solo la cantidad necesaria de pegamento para sellar las laminillas sin que haya exceso saliendo entre ellas. Cualquier exceso puede eliminarse al día siguiente con una cuchilla de afeitar. Deje que el protector de SIL repose durante la noche para las laminillas de imagen.Utilizamos rectángulos de acero inoxidable cortados con el mismo tamaño que una lámina estándar de microscopio de vidrio, con un orificio de 1,5 centímetros recortado en el centro. Se fija una cubreobjetos cuadrada de 22 milímetros al rectángulo de acero con sylgard. Tanto las láminas para inyección como las láminas para imágenes son reutilizables y se pueden limpiar entre usos con etanol al 70%, seguido de un enjuague con agua antes de inyectar embriones.Diluya el ADN hasta una concentración final de 10 a 50 microgramos por mililitro. ADN en 0,2 % de rojo de fenol en agua. El rojo de fenol permite la visualización durante la inyección.A continuación, llene y calibre la aguja. Rellene la aguja capilar de apol con aproximadamente microlitros de solución de ADN. Espere a que la aguja se llene y luego insértela en el portaagujas del aparato de inyección utilizando pinzas finas.Rompa la punta de la aguja de modo que la abertura de la punta tenga aproximadamente 10 micrómetros de diámetro. Mida el diámetro de la gota en aceite mineral con un micrómetro ocular. Para calcular el volumen de inyección, ajuste la configuración de duración del pico spritzer.Por lo tanto, el diámetro de la gota es de 0,12 micrómetros o aproximadamente un nanolitro en volumen. Una duración de 10 a 30 milisegundos es típica. Recolecte embriones en estadio de una célula en medio E3 para embriones y transfiera aproximadamente de 30 a 60 embriones a la portaobjeto para inyección.Coloque los embriones a lo largo del borde de la lámina superior y retire la mayor parte del E tres de modo que los embriones queden sujetos a la lámina por tensión superficial con una aguja de disección doblada. Gire los embriones para que la célula quede contra la pared de la lámina de inyección. Utilice un micromanipulador para guiar la aguja a través del corion del embrión, atravesando el vitelo y penetrando en la célula única del embrión.Inyecte de 0,5 a un nanolitro de solución de ADN en la célula. Transfiera los embriones inyectados a placas de Petri en E3 y colóquelos en un incubador a 28,5 grados Celsius. Si es necesario, el desarrollo puede ralentizarse incubando los embriones a una temperatura más baja al día siguiente de la inyección.Prepare los embriones para la obtención de imágenes aproximadamente una hora antes de que alcancen la edad deseada para el análisis. Retire las COR de los embriones con pinzas finas. Normalmente comenzamos la obtención de imágenes de los embriones aproximadamente entre 14 y 17 horas después de la fertilización.A continuación, seleccione embriones con células marcadas utilizando un microscopio estereoscópico equipado con fluorescencia; usamos un objetivo Forex en un microscopio Nikon a Z 100 debido a su combinación de larga distancia de trabajo y alta magnificación. Coloque un embrión en un tubo microfuga con aproximadamente 50 microlitros de V tres. Añada trica stock y agarosa al 1 % de punto de fusión bajo fundida para obtener una concentración final de trica al 0,02 % utilizando una pipeta de vidrio de punta ancha.Transfiera inmediatamente el embrión en una gota de agro a la laminilla del portaobjetos para imágenes antes de que el aros se endurezca; coloque el embrión de modo que la región con células marcadas quede orientada hacia abajo, en contacto con la laminilla inferior. A continuación, arme la cámara de imágenes. Aplique grasa de vacío de silicona a un lado de un anillo de plástico y fíjelo al soporte metálico para imágenes.Aplicar una capa de grasa sobre el otro lado del anillo. Llenar la cámara con E tres que contenga 10 milimolares de heaps y 0,02 % de Trica. Sellar la parte superior de la cámara fijando un cubreobjetos de 22 milímetros cuadrados sobre la superficie engrasada del anillo. El embrión ya está listo para la imagenología en cuatro dimensiones, como se mostrará en la siguiente sección.Los detalles de la adquisición de imágenes dependerán de las características específicas de su sistema de microscopio. Aquí demostramos el proceso de adquisición de lapsos de tiempo para el microscopio confocal Olympus FB 1000. Consulte el protocolo JO anterior para la adquisición de lapsos de tiempo con el sistema confocal Zeiss LSM five 10.Coloque la cámara de imagen en el portaobjetos sobre la platina del microscopio y enfoque el embrión utilizando un objetivo de 10 x o 20 x. Bajo luz transmitida, cambie a un objetivo de 60 x con una apertura numérica de 1,2 o superior, y enfoque una célula marcada con fluorescencia epiescopia en el software FV. Haga clic en repetición xy para comenzar el escaneo láser.Ajuste los parámetros de adquisición y los controles de adquisición de imágenes para optimizar la imagen y adquirir una serie Z. Establezca los límites superior e inferior del Zack junto con el tamaño del paso. Active el icono de profundidad en la ventana de controles de adquisición de imágenes e inicie la adquisición haciendo clic en el icono XY, serie Z para adquirir una serie de lapsos de tiempo.Establezca el intervalo de tiempo y el número de puntos temporales en la exploración temporal. En el encabezado de la ventana de configuración de adquisición, haga clic en el icono de tiempo en la ventana de control de adquisición de imágenes e inicie la adquisición haciendo clic en el icono de la suite XYZT. Aquí presentamos películas e imágenes representativas de células individuales marcadas.Cuando se marcan neuronas individuales, sus axones no quedan ocultos por otras células marcadas y, por lo tanto, las extensiones de OD en los axones y conos de crecimiento son claramente visibles. Esta película muestra una neurona sensorial marcada con la proteína RFP dirigida a la membrana. Esta neurona emite dos axones en direcciones opuestas que crecen hasta salir del campo de visión.Un tercer axón se extiende ortogonalmente desde el cuerpo celular y forma ramificaciones. De manera similar, la marcación de células individuales de la cresta neural permite la obtención de imágenes de los finos procesos celulares asociados con la motilidad celular. Aquí, dos células de la cresta neural están marcadas con GFP dirigido a la membrana.Ellos exhiben una actividad protrusiva extensa mientras migran en una dirección anterior. A menudo es útil marcar células individuales dentro de una línea transgénica para visualizar las interacciones entre células vecinas dentro de una población. Esta imagen muestra un embrión con expresión estable de GFP en todas las neuronas sensoriales que fue inyectado con ADN que codifica la etiqueta RFP para marcar una neurona en rojo sobre un fondo de neuronas verdes mediante la inyección de ADN que codifica.La sonda del biosensor de actina muestra un efecto más intenso en la señal en los conos de crecimiento y en las protrusiones dinámicas a lo largo de los axones recién formados en comparación con el cuerpo celular. En una etapa posterior, la señal permanece fuerte en los conos de crecimiento, mientras que los axones maduros presentan una señal significativamente más débil. Acabamos de mostrarle cómo realizar imágenes en vivo de neuronas y células de la cresta neural marcadas individualmente en embriones de pez cebra.Al realizar este procedimiento, es importante elegir embriones en los que el ADN no se exprese en niveles suficientemente altos como para causar toxicidad o muerte celular. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este vídeo, que muestran un método para analizar el cerebro de los vertebrados en desarrollo en embriones de pez cebra en vivo con una resolución única célula mediante microscopía confocal. Esto incluye el método por el cual se inyecta el embrión del pez cebra de una sola célula y, posteriormente, montar y obtener imágenes del cerebro en desarrollo.

Imágenes en vivo del cerebro del embrión de pez cebra mediante microscopía confocal

La clave para entender los procesos morfogenéticos que forma el embrión temprano es la capacidad de las células de la imagen en alta resolución. Se describe aquí una técnica para el etiquetado de las células individuales o pequeños grupos de células en embriones de pez cebra con toda la membrana dirigidos proteína verde fluorescente.

Etiquetado y las Pilas de imágenes en la parte posterior del cerebro de pez cebra

El vídeo de la actualidad muestra un método que aprovecha las ventajas de la combinación de electroporación y la microscopía confocal para realizar las imágenes en vivo en cada células progenitoras neurales en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Las células que mueren son expulsados ​​de los tejidos epiteliales por la contracción concertada de las células vecinas sin interrumpir la función de barrera. La claridad óptica del pez cebra en desarrollo ofrece un excelente sistema para visualizar la extrusión en la vida epitelios. A continuación se describen los métodos para inducir y extrusión de la imagen en la epidermis larvas de pez cebra a una resolución de celulares.

Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

Fuente: Williams, A. L., et al. Imágenes de lapso de tiempo multifotónico para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de células de cresta neural migratorias en embriones de pez cebra. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra un protocolo de imágenes de lapso de tiempo multifotónico para visualizar la migración de las células de la cresta neural en un embrión de pez cebra en tiempo real con alta resolución.

Visualización de la migración de células de la cresta neural en un embrión de pez cebra mediante imágenes de lapso de tiempo multifotónicas

Obtener imágenes del comportamiento dinámico de orgánulos y otras estructuras subcelulares in vivo puede arrojar luz sobre su función en condiciones fisiológicas y de enfermedad. Aquí, presentamos métodos para marcar genéticamente dos orgánulos, centrosomas y mitocondrias, e imágenes de su dinámica en embriones vivos de pez cebra utilizando microscopía confocal y de campo amplio.

La formación de imágenes estructuras subcelulares en el embrión vivo de pez cebra

Los protocolos descritos aquí permiten el estudio de las propiedades eléctricas de las células excitables en las condiciones fisiológicas más no invasivas mediante el empleo de embriones de pez cebra en un sistema in vivo junto con un indicador de voltaje genéticamente codificado (GEVI) basado en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) expresado selectivamente en el tipo de célula de interés.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

Se implementó una combinación de las técnicas de microscopía con largo excitación de fluorescencia de varios fotones de longitud de onda del láser ópticas avanzadas para capturar imágenes de alta resolución, tridimensionales en tiempo real de la migración de la cresta neural en Tg (sox10:EGFP) y los embriones de pez cebra de Tg (foxd3:GFP).

La proyección de imagen de lapso tiempo multi-Photon para visualizar el desarrollo en tiempo real: visualización de la migración de las células de cresta Neural en embriones de pez cebra

Demostramos un método que aprovecha la microscopía confocal de barrido rápido para realizar imágenes en vivo de las células de la microglía en el tectum óptico del pez cebra en desarrollo, lo que permite el análisis de la dinámica de estas células in vivo.

Imagen en vivo y caracterización de la dinámica de la microglía en el embrión de pez cebra

Aquí, presentamos un protocolo detallado para examinar la actividad neuronal en regiones cerebrales de pez cebra transgénico que expresan indicadores de calcio GCaMP utilizando microscopía confocal.

In vivo Imágenes de fluorescencia confocal de la actividad neuronal inducida por estimulación sensorial en larvas de pez cebra parcialmente restringidas

La unión neuromuscular de las larvas de pez cebra es un modelo atractivo para el estudio de la fisiología sináptica. Es susceptible de muchas técnicas experimentales, como la electrofisiología y las imágenes ópticas. Aquí, describimos un protocolo para la transmisión sináptica de imágenes utilizando una sonda basada en pHluorin bajo un microscopio de epifluorescencia vertical.

Imágenes en vivo del reciclaje de vesículas sinápticas en la unión neuromuscular de larvas de pez cebra disecadas

Aprende a visualizar la motilidad celular y la dinámica del citoesqueleto de actina en neuronas individuales y células de la cresta neural de embriones de pez cebra Danio rerio mediante microscopía confocal de fluorescencia en tiempo real.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra (Video) | JoVE Journal

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

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