Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

Para obtener imágenes del comportamiento de células individuales in vivo, se inyecta ADN plasmático que contiene un promotor específico de la célula que impulsa la expresión de un biosensor o flora, cuatro o biosensores. Los cambios dinámicos en el efecto en la distribución se visualizan in vivo utilizando un biosensor basado en el efecto F y el dominio de unión de la utrofina. Los embriones recién fertilizados se alinean a lo largo del portaobjetos de inyección y se colocan en la esquina formada entre los portaobjetos superior e inferior.

El ADN que codifica fluoro cuatro o biosensores se inyecta en la célula. Al día siguiente. Los embriones se montan en aros.

En el portaobjetos de imagen, los embriones se colocan con las células marcadas hacia abajo y la cámara se sella con un cubreobjetos. Hola, soy Erica Anderson del Laboratorio de Mary Hallin y de los departamentos de Zoología y Anatomía de la Universidad de Wisconsin Madison. Soy Nam Tauri, también del Laboratorio Hallin.

Y yo soy Matt Clay del Hallin Lab. Hoy le mostraremos un procedimiento para obtener imágenes en vivo de células marcadas individualmente en embriones de pez cebra. Utilizamos este procedimiento en un laboratorio para estudiar la motilidad celular y la dinámica de la actina durante el crecimiento de los axones y la migración de las células de la cresta neurológica.

Así que comencemos. Para ensamblar primero los portaobjetos de inyección, prepare el elastómero de silicona cyl guard de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Mezcle 10 partes de la base de elastómero con una parte de agente de curado.

Utilice el protector de cilindro para unir tres portaobjetos de microscopio de vidrio estándar. Coloque dos diapositivas una al lado de la otra en los bordes largos. Aplique ARD a la tercera diapositiva y colóquela encima de las otras dos diapositivas.

Use solo el cigarro suficiente para sellar los portaobjetos sin que el exceso rezuma entre los portaobjetos. Cualquier exceso se puede eliminar al día siguiente con una cuchilla de afeitar. Deje que el protector SIL se ajuste durante la noche para obtener imágenes de portaobjetos.

Utilizamos rectángulos de acero inoxidable cortados al mismo tamaño que un portaobjetos de microscopio de vidrio estándar con un orificio de 1,5 centímetros cortado en el centro. Un cubreobjetos cuadrado de 22 milímetros se fija al rectángulo de acero con protector syl. Tanto los portaobjetos de inyección como los portaobjetos de imagen son reutilizables y pueden limpiarse entre usos con etanol al 70%, seguido de un enjuague con agua antes de inyectar embriones.

Diluye el ADN hasta una concentración final de 10 a 50 microgramos por mililitro. ADN en rojo fenilo al 0,2% en agua. El rojo fenilo permite la visualización durante la inyección.

A continuación, llene y calibre la aguja. Rellene la aguja capilar apol con aproximadamente microlitros de solución de ADN. Espere a que la aguja se llene y luego insértela en el soporte de la aguja del aparato de inyección con pinzas finas.

Rompa la punta de la aguja de modo que la abertura de la punta tenga aproximadamente 10 micrómetros de diámetro. Mida el diámetro de la gota en aceite mineral con un micrómetro ocular. Para calcular el volumen de inyección, ajuste la configuración de la duración del pico spritzer.

Por lo tanto, el diámetro de la gota es de 0,12 micrómetros o aproximadamente un nanolitro de volumen. Lo habitual es una duración de 10 a 30 milisegundos. Recoja embriones de una etapa celular en un medio E de tres embriones y transfiera aproximadamente de 30 a 60 embriones al portaobjetos de inyección.

Coloque los embriones a lo largo del borde del portaobjetos superior y retire la mayor parte de los tres E para que los embriones se sujeten al portaobjetos mediante la tensión superficial con un alfiler de disección doblado. Rotar los embriones de modo que la célula quede contra la pared del portaobjetos de inyección. Utilice un micromanipulador para guiar la aguja a través del corion del embrión, a través de la yema y hacia la célula individual del embrión.

Inyecte de 0,5 a un nanolitros de solución de ADN en la célula. Transfiera los embriones inyectados a placas de Petri en E tres y colóquelos en una incubadora a 28,5 grados centígrados. Si es necesario, el desarrollo se puede ralentizar incubando los embriones a una temperatura más baja el día después de la inyección.

Prepare los embriones para la obtención de imágenes aproximadamente una hora antes de que los embriones alcancen la edad deseada para la obtención de imágenes. Retire los COR de los embriones con pinzas finas. Por lo general, comenzamos a obtener imágenes de los embriones aproximadamente 14 a 17 horas después de la fertilización.

A continuación, seleccionamos embriones con células marcadas utilizando un microscopio de disección equipado con fluorescencia, utilizamos un objetivo Forex en un visor Nikon a Z 100 debido a su combinación de larga distancia de trabajo y alto aumento. Coloque un embrión en un tubo de micro fuga con aproximadamente 50 microlitros de V tres. Agregue caldo de trica y agros fundidos al 1% de bajo punto de fusión para obtener una concentración final de 0,02% de trica utilizando una pipeta de vidrio borg ancha.

Transfiera inmediatamente el embrión en una gota agropecuaria a la cubierta del portaobjetos de imágenes antes de que el aros se endurezca, posicione el embrión de modo que la región con las células marcadas quede hacia abajo contra el portaobjetos inferior. A continuación, ensamble la cámara de imágenes. Cubra un lado de un anillo de plástico con grasa de silicona para aspiradoras y péguelo a la imagen de metal.

Desliza la capa del otro lado del anillo con grasa. Llene la cámara con E tres que contenga 10 pilas milimolares y 0.02%Trica selló la parte superior de la cámara fijando un cubreobjetos cuadrado de 22 milímetros a la superficie superior engrasada del anillo. El embrión ya está listo para cuatro imágenes D, como se mostrará en la siguiente sección.

Los detalles de la adquisición de imágenes dependerán de las características específicas de su sistema de microscopio. Aquí demostramos el proceso de adquisición de lapso de tiempo para el microscopio confocal Olympus FB 1000. Consulte el protocolo JO anterior para la adquisición de lapso de tiempo con el sistema confocal Zeiss LSM five 10.

Coloque la cámara de imagen en el soporte de portaobjetos en la platina del microscopio y enfoque el embrión con un objetivo de 10 x o 20 x. Bajo luz transmitida, cambie a una apertura numérica objetivo de 60x de 1.2 o superior, y concéntrese en una celda marcada con epifluorescencia en el software FV. Haga clic en xy repeat para comenzar el escaneo láser.

Ajuste la configuración de adquisición y los controles de adquisición de imágenes para optimizar la imagen y adquirir una serie Z. Establezca los límites superior e inferior del Zack junto con el tamaño del paso. Active el icono de profundidad en la ventana de control de adquisición de imágenes e inicie la adquisición haciendo clic en el icono de la suite XY, Z para adquirir una serie de lapso de tiempo.

Establezca el intervalo de tiempo y el número de puntos de tiempo en el escaneo de tiempo. Encabezado en la ventana de configuración de adquisición, haga clic en el icono de tiempo en la ventana de control de adquisición de imágenes e inicie la adquisición haciendo clic en el icono de la suite XYZT. Presentamos aquí películas representativas e imágenes de células individuales marcadas.

Cuando las neuronas individuales están marcadas, sus axones no son oscurecidos por otras células marcadas y, por lo tanto, las extensiones OD en los axones y los conos de crecimiento son claramente visibles. Esta película muestra una neurona sensorial marcada con una etiqueta RFP dirigida a la membrana. Extiende dos axones en direcciones opuestas que crecen fuera del campo de visión.

Un tercer axón se extiende ortogonalmente desde el cuerpo celular y forma ramas. De manera similar, el etiquetado de las células individuales de la cresta neural permite obtener imágenes de los procesos celulares finos asociados con la motilidad celular. Aquí, dos células de la cresta neural están marcadas con GFP dirigida a la membrana.

Exhiben una extensa actividad protrusiva mientras migran en dirección anterior. A menudo es útil etiquetar células individuales dentro de una línea transgénica para visualizar las interacciones entre células vecinas dentro de una población. Esta imagen muestra un embrión con expresión estable de GFP en todas las neuronas sensoriales al que se le inyectó una etiqueta de codificación de ADN RFP para etiquetar una neurona en rojo en el fondo de la inyección de neuronas verdes de codificación de ADN.

La sonda del biosensor de actina muestra un efecto más fuerte en la señal en los conos de crecimiento y protuberancias dinámicas a lo largo de los axones recién formados en comparación con el cuerpo celular. En una etapa posterior, la señal permanece fuerte en los conos de crecimiento, mientras que los axones maduros tienen una señal significativamente más débil. Acabamos de mostrarle cómo realizar imágenes en vivo de neuronas marcadas individualmente y células de la cresta neural en embriones de pez cebra.

Al realizar este procedimiento, es importante elegir embriones en los que el ADN no se exprese a niveles lo suficientemente altos como para causar toxicidad o muerte celular. Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.