Visualización de los patrones de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila

Comience con un tubo que contenga embriones de Drosophila en etapa tardía 16 en un medio de montaje.

Las neuronas motoras de Drosophila están inmunomarcadas.

Transfiera un embrión a un portaobjetos de vidrio y retírelo del medio de montaje.

Luego, coloque el embrión con el lado ventral hacia arriba y diseccionarlo.

Oriente la sección anterior que contiene las neuronas motoras con el lado dorsal hacia arriba.

Con una aguja de tungsteno, corte a lo largo de la línea media dorsal y extienda la pared del cuerpo. Mueva el embrión al medio de montaje. Luego, retire los órganos internos para exponer las

neuronas

Transfiera el embrión a un nuevo portaobjetos, luego móntelo y séllelo.

Observe bajo un microscopio de contraste de interferencia diferencial cómo la luz pasa a través del embrión, generando una imagen de alta resolución.

Las neuronas etiquetadas con patrones de proyección axonal aparecen de color marrón oscuro sobre un fondo claro.

Las neuronas motoras se ramifican en dos nervios principales: los nervios intersegmentarios y segmentarios, y una rama menor, el nervio transverso, que inerva los músculos.

Para filetear los embriones, colóquelos en un portaobjetos de vidrio

Primero, muévalos en una gota de glicerol con el lado ventral hacia arriba. Luego, bajo un microscopio de disección, corte la parte anterior a 1 cuarto de la longitud del cuerpo. Y eliminar la región más posterior, que está libre de axones motores.

Ahora, con una sonda de aguja, saque la preparación del glicerol, orientada dorsal hacia arriba, y colóquela horizontalmente en el campo de visión. El siguiente paso requiere una aguja fina de tungsteno que se ha insertado en la región hueca de una sonda de aguja y luego se ha doblado en el extremo. Con la aguja de tungsteno, haga un pequeño corte en el extremo posterior del embrión y continúe cortando la línea media dorsal.

Asegúrese de que la punta de la aguja de tungsteno no toque la superficie del portaobjetos de vidrio durante la disección, ya que la aguja se doblará fácilmente contra el vidrio.

Luego, con la sonda, regrese la preparación a la gota de glicerol y colóquela con la parte dorsal hacia arriba. Allí, separe el intestino de la pared del cuerpo desplegando cada pared del cuerpo en dirección lateral ventral. Las dos paredes del cuerpo deben separarse. Ahora, usando la sonda, mueva con cuidado las solapas de la pared del cuerpo sobre un portaobjetos de vidrio. En el portaobjetos, use una aguja de tungsteno para extraer los órganos internos empujándolos lateralmente.

Para estabilizar la aguja de tungsteno y evitar que se dañe, mantenga las sondas de aguja hueca que sostienen la aguja de tungsteno apoyadas contra la superficie del portaobjetos de vidrio mientras manipula la aguja de tungsteno.

Ahora monte las preparaciones y 8 microlitros de solución de montaje en un nuevo portaobjetos de vidrio. Coloque un cubreobjetos y selle los bordes con esmalte de uñas normal. Luego, capture imágenes en alta resolución utilizando la óptica DIC.