Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

El objetivo general de este procedimiento es preparar embriones oph y melanogaster para la visualización de todo el cuerpo del sistema nervioso. Esto se logra recolectando primero embriones de la cepa de mosca de interés. El segundo paso del procedimiento es eliminar el corium con lejía.

El tercer paso del procedimiento es aplicar heptano y metanol para eliminar la membrana de vilin. El paso final del procedimiento es aplicar anticuerpos a los embriones. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la estructura del sistema nervioso del embrión de Drosophila mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como el papel que pueden desempeñar las mutaciones en el desarrollo del sistema nervioso. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque pueden extraer embriones del vial de forma accidental. Comience este protocolo preparando los reactivos que se necesitarán, incluyendo P-E-M-F-A, tampón PBC 5%BSA con solución salina de azida de sodio al 0,01% y fijador de formaldehído.

Prepare una jaula para la cepa de drosophila de interés noqueando a las moscas con dióxido de carbono y luego transfiriendo al menos 100 moscas a una botella de plástico que contenga un adaptador con una placa de alimentación de agar jugo de manzana. Coloque la jaula de moscas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 72 horas. Cambie las placas de alimentación de agar jugo de manzana cada ocho a 12 horas para que las moscas se aclimaten a la jaula y no guarden sus huevos para el experimento.

Después del período de aclimatación de 72 horas, recoja los embriones 12 horas después del último cambio en la placa de alimentación de agar jugo de manzana. Retire la placa de alimentación de agar jugo de manzana de la jaula de puesta y reemplácela con solución salina. Enjuague el plato de alimentación de agar jugo de manzana.

Recoger los embriones en un tamiz fino. Use un pincel limpio para desalojar cualquier embrión que permanezca pegado a la placa. Enjuague los embriones en el tamiz con solución salina para eliminar el exceso de levadura con una espátula, recoja suavemente los embriones y colóquelos en un pequeño frasco de vidrio.

Agregue aproximadamente un mililitro de solución salina. A continuación, tapar el vial e incubar durante cinco minutos para lavar los embriones. Siguiendo la recolección de embriones.

Prepare la solución fija de heptano combinando 50% de heptano y 50% de fijador. La solución se superpondrá con heptano en la parte superior y el fijador en la parte inferior. Una vez transcurridos cinco minutos, utilice una pipeta de pasta para eliminar el exceso de solución salina del vial de vidrio de los embriones.

Enjuague los embriones con agua desionizada aplicando aproximadamente un mililitro de agua desionizada en el frasco de vidrio que contiene los embriones. Deje reposar los embriones durante un minuto antes de retirar el agua en una solución de lejía al 50%. Agitar el vial unas cuantas veces con la mano y luego incubar durante tres minutos para recubrir los embriones.

Los embriones se hundirán hasta el fondo del vial. Las COR embrionarias flotarán. Retire la lejía y los COR después de los tres minutos de incubación.

Después de la decoración, enjuague bien los embriones con agua desionizada aplicando aproximadamente un mililitro de agua desionizada en el frasco de vidrio que contiene los embriones. Deje que los embriones se asienten durante un minuto antes de eliminar el agua, los COR sobrantes flotarán y deben extraerse. Añadir la solución de heptano a los embriones e incubarlos durante 30 minutos agitándolos suavemente para fijarlos después de la fijación.

Utilice una pipeta de pasta para eliminar el fijador, que es la capa inferior, dejando el heptano en el tubo. A continuación, vuelva a añadir metanol al fondo del tubo en lugar del fijador y tape el tubo, agite vigorosamente con la mano para eliminar la membrana vitelina. Después de este paso, los embriones se hundirán hasta el fondo del tubo.

Con una pipeta para pasta, retire el metanol y los hets del vial dejando los embriones desionizados. A continuación, enjuague los embriones cinco veces con metanol, eliminando el metanol con una pipeta de pasta entre cada enjuague. Para cada enjuague, incubar los embriones durante cinco minutos.

Coloque los embriones en una mezcla de solución de 50% de PBT y 50% de metanol durante cinco minutos para rehidratarlos. Luego continúe el proceso de rehidratación transfiriéndolos a una solución 100% PBT durante cinco minutos. A continuación, bloquee los embriones incubándolos en BSA al 5% con una solución de azida de sodio al 0,01% durante una hora a cuatro grados centígrados.

A continuación, prepare el anticuerpo primario para la tinción del embrión diluyéndolo a la concentración adecuada utilizando una solución de 5 % de BSA con 0,01 % de azida de sodio. Los anticuerpos utilizados aquí están dirigidos contra la proteína de cadena de cisteína vesicular y el anticuerpo anti HRP. Anti HRP reconoce una fracción de carbohidrato neuronal específica presente en las glicoproteínas de la superficie, que marca todas las neuronas.

Incubar los embriones durante la noche a cuatro grados centígrados en la solución primaria de anticuerpos. Lave los embriones 10 veces con PBT en el transcurso de una hora. Al aplicar aproximadamente un mililitro de PBT al frasco de vidrio que contiene los embriones, deje que los embriones se asienten durante seis minutos antes de extraer el PBT.

Repita este proceso de aplicación de PBT, incubando y eliminando PBT 10 veces. Prepare la solución de anticuerpos secundarios en la oscuridad porque es sensible a la luz diluyéndola a la concentración adecuada. Utilizamos anticuerpos secundarios de Alexa en una concentración de uno a 200.

Incubar los embriones durante dos horas a cuatro grados centígrados en la solución secundaria de anticuerpos. Envuelva el frasco de vidrio de embriones y la solución de anticuerpos secundarios en papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Lave los embriones 10 veces con PBT en el transcurso de una hora.

Agregue medio de montaje de escudo vectorial a los embriones e incube durante la noche a cuatro grados centígrados para montar. Utilice una pipeta de colores pastel para succionar los embriones junto con parte del medio de montaje. Aplique los embriones y el medio en un portaobjetos de vidrio.

Aplique un cubreobjetos sobre los embriones y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Visualice los embriones usando un microscopio de fluorescencia aquí. El SNC embrionario se muestra en los estadios 16 y 17.

La proteína de la cadena de cistina se muestra en rojo. Las neuronas HRP se muestran en verde. Obsérvese la mancha distintiva de la comisura en esta imagen representativa.

El SNP embrionario se muestra en los estadios 16 y 17. Una vez más, la proteína de la cadena de cistina se muestra en rojo y las neuronas se muestran en verde. Obsérvese los patrones repetidos de las neuronas periféricas.

Al intentar este procedimiento, es importante tener en cuenta los embriones para no extraerlos accidentalmente del vial. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar embriones oph fla para la visualización de todo el cuerpo del sistema nervioso.