Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

El objetivo general de este procedimiento es preparar embriones de oph y melanogaster para la visualización en montaje completo del sistema nervioso. Esto se logra primero recolectando embriones de la cepa de moscas de interés. El segundo paso del procedimiento consiste en eliminar el corion con lejía.

El tercer paso del procedimiento consiste en aplicar heptano y metanol para eliminar la membrana vilina. El paso final del procedimiento es aplicar anticuerpos a los embriones. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la estructura del sistema nervioso del embrión de Drosophila mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como qué papel pueden desempeñar las mutaciones en el sistema nervioso en desarrollo. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque podrían aspirar accidentalmente embriones desde el vial. Comience este protocolo preparando los reactivos que serán necesarios, incluyendo P-E-M-F-A, tampón PBC con solución salina al 5 % de BSA y 0,01 % de azida sódica, y fijador de formaldehído.

Prepare una jaula para la cepa de drosófila de interés inmovilizando a las moscas con dióxido de carbono y luego transfiriendo al menos 100 moscas a una botella de plástico que contenga un adaptador con una placa de agar de jugo de manzana para alimentación. Coloque la jaula con las moscas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 72 horas. Cambie las placas de agar de jugo de manzana cada ocho a doce horas para que las moscas se aclimaten a la jaula y no retengan sus huevos para el experimento.

Después del período de aclimatación de 72 horas, recolecte los embriones 12 horas después del último cambio en la placa de agar con jugo de manzana. Retire la placa de agar con jugo de manzana de la jaula de puesta y reemplácela utilizando solución salina. Enjuague la placa de agar con jugo de manzana.

Recolecte los embriones en un tamiz fino. Utilice un pincel limpio para desprender cualquier embrión que permanezca adherido a la placa. Enjuague los embriones en el tamiz con solución salina para eliminar cualquier exceso de levadura utilizando una espátula, levante suavemente los embriones y colóquelos en un pequeño vial de vidrio.

Agregue aproximadamente un mililitro de solución salina. Luego, tape el vial e incube durante cinco minutos para lavar los embriones. Después de la recolección de embriones.

Prepare la solución fijadora con heptano combinando 50 % de heptano y 50 % de fijador. La solución se estratificará con heptano en la parte superior y el fijador en la parte inferior. Después de cinco minutos, use una pipeta de pasta para eliminar la salina en exceso del vial de vidrio que contiene los embriones.

Lave los embriones con agua desionizada aplicando aproximadamente un mililitro de agua desionizada al vial de vidrio que contiene los embriones. Deje reposar los embriones durante un minuto antes de eliminar el agua con una solución de lejía al 50%. Agite el vial varias veces manualmente y luego incube durante tres minutos para recubrir los embriones.

Los embriones tratados se hundirán hasta el fondo del vial. Las COR embrionarias flotarán. Retire la lejía y las COR después de la incubación de tres minutos.

Después de la decoración, enjuague los embriones completamente con agua desionizada, aplicando aproximadamente un mililitro de agua desionizada al vial de vidrio que contiene los embriones. Deje reposar los embriones durante un minuto antes de eliminar el agua; los COR restantes flotarán y deben retirarse. Añada la solución fijadora de heptano a los embriones e incúbelos durante 30 minutos con agitación suave para fijarlos tras la fijación.

Utilice una pipeta de pasta para eliminar el fijador, que es la capa inferior, dejando el heptano en el tubo. A continuación, agregue metanol nuevamente en la parte inferior del tubo en lugar del fijador y tape el tubo; agite vigorosamente a mano para eliminar la membrana vitelina. Tras este paso, los embriones fijados se hundirán al fondo del tubo.

Mediante una pipeta de pasta, retire el metanol y los hets del vial, dejando atrás los embriones desionizados. Luego, lave los embriones cinco veces con metanol, eliminando el metanol con una pipeta de pasta entre cada lavado. Para cada lavado, incube los embriones durante cinco minutos.

Coloque los embriones en una mezcla de solución al 50 % de PBT y metanol al 50 % durante cinco minutos para rehidratarlos. A continuación, continúe el proceso de rehidratación transfiriéndolos a una solución de PBT al 100 % durante cinco minutos. Luego, bloquee los embriones incubándolos en una solución de BSA al 5 % con azida sódica al 0,01 % durante una hora a cuatro grados Celsius.

A continuación, prepare el anticuerpo primario para la tinción de embriones diluyéndolo a la concentración adecuada utilizando una solución de BSA al 5 % con azida sódica al 0,01 %. Los anticuerpos utilizados aquí están dirigidos contra la proteína vesicular de cadena de cisteína y el anticuerpo anti HRP. El anti HRP reconoce una porción de carbohidrato específico neural presente en las glicoproteínas de superficie, que marca todas las neuronas.

Incube los embriones durante toda la noche a cuatro grados Celsius en la solución de anticuerpo primario. Lave los embriones 10 veces con PBT durante el transcurso de una hora. Aplicando aproximadamente un mililitro de PBT al vial de vidrio que contiene los embriones, permita que los embriones reposen durante seis minutos antes de eliminar el PBT.

Repita este proceso de aplicación de PBT, incubación y eliminación de PBT diez veces. Prepare la solución de anticuerpo secundario en la oscuridad porque es sensible a la luz, diluyéndola a la concentración adecuada. Utilizamos anticuerpos secundarios Alexa a una concentración de uno a 200.

Incubar los embriones durante dos horas a cuatro grados Celsius en la solución de anticuerpo secundario. Envolver el vial de vidrio que contiene los embriones y la solución de anticuerpo secundario con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Lavar los embriones 10 veces con PBT durante el transcurso de una hora.

Añada medio de montaje con escudo vectorial a los embriones e incúbelos durante la noche a cuatro grados Celsius para su montaje. Utilice una pipeta Pasteur para aspirar los embriones junto con algo del medio de montaje. Aplique los embriones y el medio sobre un portaobjetos de vidrio.

Coloque un cubreobjetos sobre los embriones y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Visualice los embriones utilizando un microscopio de fluorescencia aquí. El SNC embrionario se muestra en la etapa 16 a 17.

La proteína de cadena de cistina se muestra en rojo. Las neuronas de HRP se muestran en verde. Observe la tinción distinta del comisura en esta imagen representativa.

El SNP embrionario se muestra en las etapas 16 a 17. Nuevamente, la proteína de cadena de cistina aparece en rojo y las neuronas en verde. Obsérvense los patrones repetidos de neuronas periféricas.

Al intentar este procedimiento, es importante tener cuidado con los embriones para no retirarlos accidentalmente del vial. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar embriones oph fla para la visualización en montaje completo del sistema nervioso.