Name: Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-11T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 8 s
Description: Aprende a visualizar el sistema nervioso embrionario en Drosophila mediante inmunofluorescencia. Este protocolo detalla la recolección, fijación y tinción de embriones para estudiar la organización neuronal durante el desarrollo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SG es apoyado por fondos de la Universidad Estatal de Nueva York en Buffalo y de John R. Oishei Fundación.

1. Preparación de los reactivos <ol><li> Prepare el tampón PEMFA utilizando canalizaciones con 100 mM, EGTA 2 mM y 1 mM MgSO 4. Ajustar el pH de la solución a 7,0. El buffer PEMFA es esterilizado por filtración y se almacenan a 4 ° C. </li><li> Prepare PBT mediante la adición de 1 ml de Triton X-100 a 100 ml 1x PBS (tampón fosfato salino) (pH 7,0). Almacenar a 4 ° C. </li><li> Preparar 5% de BSA (albúmina de suero bovino) con un 0,01% NaAcide en 1X PBS (pH 7,0). </li><li> Prepare la solución salina con 0,7% NaCl y 0,03% Triton X-100 en agua destilada. </li><li> Preparar el fijador mediante la combinación de 4 partes de búfer PEMFA con formaldehído parte un 37%. </li></ol> 2. Recolección de embriones <ol><li> Prepare una caja para la cepa de Drosophila de interés mediante la colocación de&gt; 100 moscas en una botella de plástico que contiene un adaptador de alimentación con placa de agar. </li><li> Salir de la jaula de las moscas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 72 horas, cambio de placas cada 8-12 horas, de modo que las moscas se acostumbren a la jaula y no tienen sus huevos. </li><li> Para el experimento se recogen los embriones durante 12 horas. Retire la placa de Petri del contenedor y reemplazarlo. Tome la placa de Petri quitar y lavar los embriones de la cápsula, utilizando la solución salina y una brocha limpia. </li><li> Recoger los embriones en un colador fino. Enjuagar con solución salina para eliminar cualquier exceso de levadura. </li><li> Usando una espátula suavemente recoger los embriones y colocarlos en un frasco de vidrio con una tapa. Añadir alrededor de 1 ml de solución salina. </li></ol> 3. La eliminación de las membranas Chorion y vitelina y fijación <ol><li> Después de la recolección de embriones, preparar la solución de heptano-Fix mediante la combinación de 50% de heptano y 50% de fijador. La solución será en capas con heptano en la parte superior y el fijador en la parte inferior. </li><li> En el frasco de vidrio lavado de los embriones, mediante su incubación en la solución salina durante 5 minutos. Retire el exceso de solución salina con una pipeta Pasteur. </li><li> Enjuague los embriones con agua destilada. </li><li> Dechorionate los embriones, mediante su incubación en el 50% de lejía durante 3 minutos. </li><li> Enjuague los embriones a fondo con agua destilada. </li><li> Fijar los embriones, mediante su incubación durante 30 minutos en la solución de heptano-Fix con agitación suave. </li><li> Con una pipeta Pasteur reemplazar el fijador (capa inferior) con metanol dejando el heptano en el tubo. Agitar enérgicamente para eliminar la membrana vitelina. Los embriones devitellinized se hunden hasta el fondo del tubo. </li><li> Recoger los embriones en un frasco de vidrio nuevo con una pipeta Pasteur. Enjuague los embriones cinco veces con metanol, cada vez que los embriones se incuban durante 5 minutos. </li></ol> 4. La tinción de anticuerpos, de montaje y visualización <ol><li> Rehidratar a los embriones en una mezcla de 50% de la solución PBT y 50% de metanol durante 5 minutos. Luego rehidratar en un 100% la solución PBT durante 5 minutos. </li><li> Bloquear los embriones, mediante su incubación en 5% de BSA con una solución de NaAcide 0,01% durante 1 hora a 4 ° C. </li><li> Los embriones están listos para la tinción de anticuerpos. Prepare el anticuerpo primario mediante la dilución a la concentración adecuada con 5% de BSA con una solución de NaAcide 0,01%. Nosotros usamos un anticuerpo contra la proteína de cadena de cisteína (CSP), una proteína sináptica vesicular y un anticuerpo anti-HRP rábano o caballo peroxidasa, que reconoce neuronal específica en hidratos de carbono fracción presente en las glicoproteínas de superficie y las etiquetas de todas las neuronas. </li><li> Incubar los embriones durante la noche a 4 ° C en la solución de anticuerpo primario. </li><li> Al día siguiente, lave los embriones 10 veces con PBT en el transcurso de una hora. </li><li> Prepare la solución secundaria de anticuerpos mediante la dilución de la concentración adecuada. Utilizamos anticuerpos Alexa secundaria a una concentración de 1:200. </li><li> Incubar los embriones durante dos horas en 4 ° C en la solución de anticuerpo secundario. </li><li> Lavado de los embriones 10 veces con PBT en el transcurso de una hora. </li><li> Incubar los embriones durante la noche en medio Vectashield montaje. </li><li> Monte de los embriones en un portaobjetos de vidrio y sellar la hoja de la cubierta con esmalte de uñas. Visualizar embriones utilizando un microscopio de fluorescencia. </li></ol> 5. Resultados representante <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1a.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1b.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> HRP-FITC <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig1c.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Se fusionó Figura 1: Una imagen representativa que muestra el sistema nervioso central embrionarias en la etapa 16-17, el uso de anticuerpos contra la CSP (rojo) y HRP (verde). Tenga en cuenta la coloración distinta de la comisura. <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2a.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> CSP <img src="/files/ftp_upload/2150/2150fig2b.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> HRP-FITC "/&gt; Se fusionó Figura 2: Un representante de las imágenes que muestra el PNS embrionarias en la etapa 16-17 usando anticuerpos contra la CSP (rojo) y HRP (verde). Tenga en cuenta los patrones repetidos de las neuronas periféricas.

<ol><li>Bodmer, R., Barbel, S., Sheperd, S., Jack, J. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+sensory+organs+by+mutations+of+the+cut+locus+of+D.+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Transformation of sensory organs by mutations of the cut locus of D. melanogaster.</a> Cell. 51, 293-307 (1987).</li>
<li>Bodmer, R., Carretto, R., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+of+the+peripheral+nervous+system+in+Drosophila+embryos%3A+DNA+replication+patterns+and+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis of the peripheral nervous system in Drosophila embryos: DNA replication patterns and cell lineages.</a> Neuron. 3, 21-32 (1989).</li>
<li>Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCampos-Ortega%2C+JA+%22The+Embryonic+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Embryonic Development of Drosophila melanogaster</a>. , Springer-Verlag. New York. (1985).</li>
<li>Carroll, S. B., Scott, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+fushi+tarazu+protein+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Localization of the fushi tarazu protein during Drosophila embryogenesis.</a> Cell. 43, 47-57 (1985).</li>
<li>Dambly-Chaudière, C., Ghysen, A., Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+connections+between+imaginal+discs+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle connections between imaginal discs in Drosophila.</a> Developmental Biology. 113, 288-294 (1986).</li>
</ol>

El embrión de Drosophila es un potente sistema para la investigación de los cambios celulares y moleculares durante el desarrollo neuronal. En este protocolo se ha demostrado la forma de preparar todo el montaje embriones para inmunohistoquímica. Nos hemos adaptado a partir de este protocolo el protocolo descrito en Carroll y Scott, 1985. Este protocolo también se puede adaptar a otra prueba de anticuerpos neuronales, pero la optimización de los anticuerpos se debe hacer. Además, los defectos del desarrollo emb...

<table><tbody><tr><td>formaldehído al 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-25</td><td></td></tr><tr><td>CSP</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HRP-FITC</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>323-095-021</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 de cabra anti-IgG de ratón</td><td>Invitrogen</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje Vectashield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

visualización del sistema nervioso embrionario en todo el montaje drosophila los embriones

Visualization of the Embryonic Nervous System in Whole-mount Drosophila Embryos

El embrión de Drosophila es un sistema modelo atractivo para la investigación de las bases celulares y moleculares del desarrollo neuronal. A continuación se describe el procedimiento para la visualización de Drosophila sistema nervioso embrionario utilizando anticuerpos contra las proteínas neuronales. Ya que toda la embrionaria sistemas nervioso periférico nervioso central y están bien caracterizados a nivel de células individuales (Dambly-Chaudière et al, 1986;.. Bodmer et al, 1987;. Bodmer et al, 1989), cualquier aberración que estos sistemas pueden identificar fácilmente el uso de anticuerpos a diferentes proteínas neuronales. Los embriones en desarrollo se reúnen en ciertos momentos para asegurarse de que los embriones se encuentran en las etapas de desarrollo adecuado para la visualización. Después de la recolección, las capas externas del embrión, el corion y la membrana de la envoltura vitelina que rodea el embrión, se retiran antes de la fijación. Los embriones se incuban con anticuerpos neuronales y se visualizan con fluorescencia utilizando anticuerpos secundarios marcados. Los embriones en etapas 12-17 se visualizan para acceder al sistema nervioso embrionario. En la 12 ª etapa de la banda germen del SNC se inicia el acortamiento y la etapa 15 el patrón definitivo de la comisura se ha logrado. Por la etapa 17 de los contratos del SNC y SNP está completamente desarrollado (Campos-Ortega et al. 1985). Así, los cambios en el patrón del SNP y SNC pueden ser fácilmente observados durante estas etapas de desarrollo.

Se describe el procedimiento para preparar etapas<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriones para la visualización del sistema nervioso embrionario durante la embriogénesis.

Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

El embrión de Drosophila es un sistema modelo atractivo para investigar la base celular y molecular del desarrollo neuronal. En este documento describimos el...

El objetivo general de este procedimiento es preparar embriones de oph y melanogaster para la visualización en montaje completo del sistema nervioso. Esto se logra primero recolectando embriones de la cepa de moscas de interés. El segundo paso del procedimiento consiste en eliminar el corion con lejía.El tercer paso del procedimiento consiste en aplicar heptano y metanol para eliminar la membrana vilina. El paso final del procedimiento es aplicar anticuerpos a los embriones. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la estructura del sistema nervioso del embrión de Drosophila mediante microscopía de inmunofluorescencia.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como qué papel pueden desempeñar las mutaciones en el sistema nervioso en desarrollo. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque podrían aspirar accidentalmente embriones fuera del vial. Comience este protocolo preparando los reactivos necesarios, incluyendo P-E-M-F-A, tampón PBC con solución salina de azida sódica al 0,01% y albúmina sérica bovina al 5%, y fijador de formaldehído.Prepare una jaula para la cepa de Drosophila de interés inmovilizando a las moscas con dióxido de carbono y luego transfiriendo al menos 100 moscas a una botella de plástico que contenga un adaptador con una placa de agar de jugo de manzana para alimentación. Coloque la jaula con las moscas en la oscuridad a temperatura ambiente durante 72 horas. Cambie las placas de agar de jugo de manzana cada ocho a doce horas para que las moscas se aclimaten a la jaula y no retengan sus huevos para el experimento.Después del período de aclimatación de 72 horas, recolecte los embriones 12 horas después del último cambio en la placa de agar con jugo de manzana. Retire la placa de agar con jugo de manzana de la jaula de puesta y sustitúyala utilizando solución salina. Enjuague la placa de agar con jugo de manzana.Recolecte los embriones en un tamiz fino. Utilice un pincel limpio para desprender cualquier embrión que permanezca adherido a la placa. Enjuague los embriones en el tamiz con solución salina para eliminar cualquier exceso de levadura utilizando una espátula, levante suavemente los embriones y colóquelos en un pequeño vial de vidrio.Agregue aproximadamente un mililitro de solución salina. Luego, tape el vial e incube durante cinco minutos para lavar los embriones. Después de la recolección de embriones.Prepare la solución fijadora con heptano combinando 50% de heptano y 50% de fijador. La solución se estratificará con heptano en la parte superior y el fijador en la parte inferior. Después de cinco minutos, use una pipeta de pasta para eliminar la salina en exceso del vial de vidrio que contiene los embriones.Lave los embriones con agua desionizada aplicando aproximadamente un mililitro de agua desionizada al vial de vidrio que contiene los embriones. Deje reposar los embriones durante un minuto antes de eliminar el agua con una solución de lejía al 50%. Agite el vial varias veces manualmente y luego incube durante tres minutos para recubrir los embriones.Los embriones tratados se hundirán en el fondo del vial. Las COR embrionarias flotarán. Retire la lejía y las COR después de la incubación de tres minutos.Después de la decoración, enjuague los embriones completamente con agua desionizada, aplicando aproximadamente un mililitro de agua desionizada al vial de vidrio que contiene los embriones. Deje reposar los embriones durante un minuto antes de eliminar el agua; los COR restantes flotarán y deben retirarse. Añada la solución de fijación con heptano a los embriones e incúbelos durante 30 minutos con agitación suave para fijarlos tras la fijación.Utilice una pipeta de pasta para eliminar el fijador, que es la capa inferior, dejando el heptano en el tubo. A continuación, agregue metanol nuevamente en la parte inferior del tubo en lugar del fijador y tape el tubo; agítelo vigorosamente a mano para eliminar la membrana vitelina. Tras este paso, los embriones fijados se hundirán al fondo del tubo.Utilizando una pipeta de pasta, retire el metanol y los hets del vial, dejando atrás los embriones desionizados. Luego, enjuague los embriones cinco veces con metanol, eliminando el metanol con una pipeta de pasta entre cada enjuague. Para cada enjuague, incube los embriones durante cinco minutos.Coloque los embriones en una mezcla de solución al 50 % PBT y metanol al 50 % durante cinco minutos para rehidratarlos. A continuación, continúe el proceso de rehidratación transfiriéndolos a solución PBT al 100 % durante cinco minutos. Luego, bloquee los embriones incubándolos en una solución de BSA al 5 % con azida sódica al 0,01 % durante una hora a cuatro grados Celsius.A continuación, prepare el anticuerpo primario para la tinción de embriones diluyéndolo a la concentración adecuada utilizando una solución de BSA al 5 % con azida sódica al 0,01 %. Los anticuerpos utilizados aquí están dirigidos contra la proteína vesicular de cadena de cisteína y el anticuerpo anti-HRP. El anti-HRP reconoce una porción de carbohidrato neural específica presente en las glicoproteínas de superficie, que marca todas las neuronas.Incube los embriones durante toda la noche a cuatro grados Celsius en la solución de anticuerpo primario. Lave los embriones 10 veces con PBT durante el transcurso de una hora. Aplicando aproximadamente un mililitro de PBT al vial de vidrio que contiene los embriones, permita que los embriones reposen durante seis minutos antes de eliminar el PBT.Repita este proceso de aplicación de PBT, incubación y eliminación de PBT diez veces. Prepare la solución de anticuerpo secundario en la oscuridad porque es sensible a la luz, diluyéndola a la concentración adecuada. Utilizamos anticuerpos secundarios Alexa a una concentración de uno a 200.Incubar los embriones durante dos horas a cuatro grados Celsius en la solución de anticuerpo secundario. Envolver el vial de vidrio que contiene los embriones y la solución de anticuerpo secundario con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz. Lavar los embriones 10 veces con PBT durante el transcurso de una hora.Añada medio de montaje con escudo vectorial a los embriones e incúbelos durante la noche a cuatro grados Celsius para su montaje. Utilice una pipeta pastel para aspirar los embriones junto con algo del medio de montaje. Aplique los embriones y el medio sobre un portaobjetos de vidrio.Coloque un cubreobjetos sobre los embriones y selle el cubreobjetos con esmalte de uñas. Visualice los embriones utilizando un microscopio de fluorescencia aquí. El SNC embrionario se muestra en la etapa 16 a 17.La proteína de cadena de cistina se muestra en rojo. Las neuronas de HRP se muestran en verde. Observe la tinción distinta del comisura en esta imagen representativa.El SNP embrionario se muestra en las etapas 16 a 17. Nuevamente, la proteína de cadena de cistina se muestra en rojo, y las neuronas se muestran en verde. Observe los patrones repetidos de neuronas periféricas.Al intentar este procedimiento, es importante tener cuidado con los embriones para no retirarlos accidentalmente del vial. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar embriones oph fla para la visualización en montaje completo del sistema nervioso.

visualization-embryonic-nervous-system-whole-mount-drosophila

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Drosophila melanogaster larvas de disponer de un sistema modelo ideal para investigar los mecanismos de transporte axonal en larvas de los nervios segmentarios. El uso de este procedimiento, 3 de larvas portadoras de mutaciones diferentes pueden ser comparados a las larvas de tipo salvaje.

La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

Aquí se presenta un protocolo de montaje para...

Imagen de la posición vertical Drosophila Los embriones

Fuente: Jeong, S. Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la visualización de proyecciones axonales en embriones de Drosophila. El inmunomarcaje de las neuronas motoras, la disección precisa para exponer las estructuras neuronales y la microscopía de contraste de interferencia diferencial revelan colectivamente una arquitectura neuronal detallada, enfatizando los patrones de proyección axonal.

Visualización de los patrones de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila

La inmunotinción es una técnica eficaz para visualizar tipos específicos de células y proteínas dentro de los tejidos. Al utilizar la sonicación, el protocolo descrito aquí alivia la necesidad de diseccionar tejidos de Drosophila melanogaster de embriones y larvas en fase avanzada antes de la inmunotinción. Proporcionamos una metodología eficiente para la inmunotinción de larvas enteras fijadas en formaldehído.

La sonicación-facilitado Inmunofluorescencia tinción de etapa tardía embrionario y larval<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejidos<em&gt; In Situ</em

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Se describe un protocolo para la disección, la fijación y la inmunotinción de órganos androgénica en Drosophila larvas y adultos hembras para estudiar la biosíntesis de hormonas esteroideas y su mecanismo de regulación. Además de los órganos androgénica, visualizamos la inervación de los órganos androgénica, así como células diana androgénica, tales como las células madre de línea germinal.

Protocolos para la visualización androgénica, órganos y sus órganos interactivos con inmunotinción en la mosca de la fruta<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Este trabajo detalla un método de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de los embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. La preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la búsqueda de axones motores y el reconocimiento de dianas durante el desarrollo neural.

Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

Este protocolo describe la disección y el immunostaining del adulto de Drosophila melanogaster los tejidos del cerebro. Específicamente, este protocolo destaca el uso de setas neuronas cuerpo y fotorreceptor Drosophila como subconjuntos neuronal de ejemplo que pueden utilizarse con precisión para descubrir principios generales subyacentes a muchos aspectos del desarrollo neuronal.

Disección y tinción inmunofluorescente de seta del cuerpo y las neuronas fotorreceptoras en cerebros de adultos de Drosophila melanogaster

Aquí, presentamos una serie estandarizada de protocolos para observar el surco ocular superior, una estructura recientemente identificadas, conservadas evolutivamente en el ojo vertebrado. Con larvas de pez cebra, demostramos técnicas necesarias para identificar los factores que contribuyen a la formación y cierre del surco ocular superior.

Visualización del surco Ocular Superior durante la embriogénesis de Danio rerio

Describimos un método para el rastreo retrógrado de las neuronas motoras embrionarias Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos.

Seguimiento retrógrado de las neuronas motoras embrionarias de Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos

Este protocolo describe tres pasos para preparar los lóbulos ópticos de larvas y adultos de Drosophila para la obtención de imágenes: 1) disecciones cerebrales, 2) inmunohistoquímica y 3) montaje. Se hace hincapié en el paso 3, ya que se requieren distintas orientaciones de montaje para visualizar estructuras específicas de lóbulos ópticos.

Disección, inmunohistoquímica y montaje de cerebros de larvas y adultos de Drosophila para la visualización del lóbulo óptico

Aprende a visualizar el sistema nervioso embrionario en Drosophila mediante inmunofluorescencia. Este protocolo detalla la recolección, fijación y tinción de embriones para estudiar la organización neuronal durante el desarrollo.

Visualización del sistema nervioso embrionario en Todo el montaje Drosophila Los embriones

Explorar más videos