Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias Drosophila

El objetivo general de este experimento es analizar los patrones de proyección de las neuronas motoras en embriones de Drosophila melanogaster en etapas tardías. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo neuronal, como la guía de los axones motores y la formación de subcus neuronales. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una visualización precisa del axón motor en embriones en desarrollo, lo que permite un análisis fiable de la búsqueda de rutas axonales y se dirige al defecto de la enfermedad.

Un día después de la instalación de los platos de recolección de huevos, reemplace los platos por otros nuevos que contengan un poco de pasta de levadura recién hecha. Después de tres horas en los platos frescos, transfiera las moscas a nuevas botellas de comida. E incubar las placas de huevo durante la noche a 25 grados centígrados.

Por la mañana, agregue 1,8 mililitros de solución de PBT a los platos. Y use un hisopo de algodón para desalojar los embriones. Luego, usando una pipeta de 1 mililitro, transfiera los embriones y la solución a un tubo de microcentrífuga.

Una vez que los embriones se asienten en el fondo, aspire la mayor cantidad de solución posible. A continuación, enjuague los embriones dos veces con un mililitro de PBT por enjuague. Para decorar los embriones, reemplace el último enjuague con un mililitro de lejía al 50% y meca el tubo durante tres minutos a temperatura ambiente.

Para eliminar la lejía, enjuague los embriones tres veces con PBT. Luego, reemplace el último enjuague con medio mililitro de 100% heptano y medio mililitro de 4% de paraformaldehído. Ahora, incuba los embriones durante 15 minutos con un suave balanceo.

Después de la incubación, retire la capa de solución subyacente y vuelva a agregar 500 microlitros de metanol al 100%. Ahora, durante 30 segundos, agite el tubo vigorosamente para desvellinizar los embriones. A continuación, retire la solución suprayacente, vuelva a añadir 500 microlitros de metanol al 100% y agite el tubo durante otros 10 segundos.

Después de agitar el tubo, golpéelo para ayudar a que los embriones se asienten y elimine la mayor cantidad de solución posible. A continuación, enjuague brevemente los embriones con metanol al 100%. Luego, enjuague inmediatamente los embriones con PBT tres veces.

Ahora, vuelva a suspender los embriones en un mililitro de PBT fresco. E incubar los embriones a 37 grados centígrados durante 15 minutos para prepararlos para la tinción de LacZ. Mientras los embriones incuban, prepare una alícuota de un mililitro de solución de tinción X-gal.

Calienta la alícuota en un baño de agua a 65 grados centígrados hasta que se enturbie. Luego transfiéralo a un bloque de calor de 37 grados centígrados. Después de que los embriones se hayan calentado durante 15 minutos, retire la solución de PBT y reemplácela con la alícuota de un mililitro de solución de tinción.

A continuación, añade 20 microlitros de sustrato X-gal. Durante unas dos a cuatro horas, incube el tubo a 37 grados centígrados con un suave balanceo hasta que se forme un precipitado azul. Luego, retire la solución de tinción y enjuague los embriones tres veces con PBT a temperatura ambiente.

Después de los enjuagues, use una sonda de aguja o fórceps para clasificar a mano los embriones bajo un microscopio de disección. Recoja los embriones teñidos de interés en un tubo de microcentrífuga de medio milímetro con una pipeta de un mililitro. A continuación, lavar los embriones seleccionados con 0,4 mililitros de PBT.

A continuación, sustituye el PBT por 0,3 mililitros de solución bloqueante y deja que los embriones se incuben con una suave agitación durante 15 minutos. Después de 15 minutos, agregue 75 microlitros del anticuerpo primario y continúe la incubación durante la noche. A la mañana siguiente, lavar los embriones con PBT durante unas dos horas, cambiando la solución de lavado aproximadamente cada 30 minutos.

Después del lavado, agregue 0,3 mililitros de solución bloqueante que contenga el anticuerpo secundario e incube el tubo con un balanceo suave a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, lavar los embriones con PBT durante unas tres horas. Cambie el PBT al menos cinco veces durante el período de lavado.

Después del lavado, vuelva a suspender los embriones en 0,3 mililitros de solución de dab y agregue dos microlitros de peróxido de hidrógeno al 3%. Luego, incubarlos en la oscuridad con un balanceo suave a temperatura ambiente hasta que se produzca suficiente precipitado. Esto generalmente toma de 30 a 60 minutos.

A continuación, enjuague los embriones con PBT cuatro veces y vuelva a suspenderlos en 0,2 mililitros de solución de montaje. Ahora, permita que los embriones se equilibren en la oscuridad a 4 grados centígrados. Para filetear los embriones, colóquelos en un portaobjetos de vidrio.

Primero muévalos a una gota de glicerol con el lado ventral hacia arriba. A continuación, bajo un microscopio de disección, corte la parte anterior y 1/4 de la longitud del cuerpo y extirpe la región más posterior, que está libre de axones motores. Ahora, con una sonda de aguja, saque la preparación del glicerol, orientada hacia arriba con el lado dorsal y colóquela horizontalmente en el campo de visión.

El siguiente paso requiere una aguja fina de tungsteno que se ha insertado en la región hueca de una sonda de aguja y luego se dobla en el extremo. Con la aguja de tungsteno, haga un pequeño corte en el extremo posterior del embrión y continúe cortando la línea media dorsal. Asegúrese de que la punta de la aguja de tungsteno no toque la superficie del portaobjetos de vidrio durante la disección, ya que la aguja se doblará fácilmente contra el vidrio.

Luego, con la sonda, regrese la preparación a la gota de glicerol y colóquela con el lado dorsal hacia arriba. Allí, separa el intestino de la pared del cuerpo desplegando cada pared del cuerpo en dirección ventral-lateral. Las dos paredes del cuerpo deben separarse.

Ahora, usando la sonda, mueva con cuidado las solapas de la pared del cuerpo sobre un portaobjetos de vidrio. En el portaobjetos, use una aguja de tungsteno para extraer los órganos internos empujándolos lateralmente. Para estabilizar la aguja de tungsteno y evitar que se dañe, mantenga la aguja hueca sondeada y sostenga la aguja de tungsteno apoyada contra la superficie del portaobjetos de vidrio mientras manipula la aguja de tungsteno.

Ahora, monte las preparaciones en ocho microlitros de solución de montaje en una nueva corredera de vidrio. Coloca un cubreobjetos y sella los bordes con esmalte de uñas normal. A continuación, capture imágenes a alta resolución con la óptica DIC.

Utilizando el método descrito, los embriones en estadio 16 se tiñeron con el anticuerpo Fas2 y se prepararon para la visualización de las neuronas motoras y los hemisegmentos abdominales A3 y A4. Normalmente, al menos siete neuronas motoras se extienden y fasciculan sus axones para formar una rama nerviosa ISNb. Muchos haces de nervios circundantes también fueron identificables en esta preparación. Cuando el haz de nervios intersegmentarios alcanza el punto de elección en los músculos 6 y 7, dos axones desfasciculan y enervan selectivamente los músculos 6 y 7.

Lo mismo ocurre en otros puntos de elección a medida que el haz se extiende dorsalmente. Luego, en el último punto de elección, dos axones enervan el músculo 12. Por el contrario, en los embriones mutantes de Sema-1a, los mismos axones no logran desfascicular en sus puntos de elección.

Esto no es inesperado, ya que se sabe que el producto Sema-1 aegean ayuda a formar conexiones entre los axones motores y los músculos objetivo durante el desarrollo neuronal. Por lo tanto, el método descrito se puede utilizar para analizar los fenotipos mutantes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo clasificar los embriones mutantes deseados, cómo inmunoteñir los patrones de proyección axonal de las neuronas motoras y cómo diseccionar embriones fijos para una preparación plana.