Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias

El objetivo general de este experimento es analizar los patrones de proyección de las neuronas motoras en embriones de Drosophila melanogaster en etapas tardías. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo neural, como la guía de los axones motores y la formación de subunidades neuronales. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona una visualización precisa de los axones motores en embriones en desarrollo, lo que permite un análisis confiable del rastreo axonal y de los defectos en la condición del objetivo.

Un día después de colocar las placas para la recolección de huevos, reemplace las placas por otras nuevas que contengan una pequeña cantidad de pasta de levadura recién preparada. Tras tres horas en las placas frescas, transfiera las moscas a nuevos frascos con alimento. Incube las placas de huevos durante la noche a 25 grados Celsius.

Por la mañana, agregue 1.8 mililitros de solución PBT a las placas. Y use un hisopo de algodón para despegar los embriones. Luego, utilizando una pipeta de 1 mililitro, transfiera los embriones y la solución a un tubo de microcentrífuga.

Una vez que los embriones se depositen en el fondo, aspire la mayor cantidad posible de solución. Luego, lave los embriones dos veces utilizando un mililitro de PBT por cada lavado. Para decoronar los embriones, sustituya el último lavado por un mililitro de lejía al 50 % y agite el tubo durante tres minutos a temperatura ambiente.

Para eliminar el blanqueador, lave los embriones tres veces con PBT. Luego, sustituya el último lavado por medio mililitro de heptano al 100% y medio mililitro de paraformaldehído al 4%. A continuación, incube los embriones durante 15 minutos con agitación suave.

Tras la incubación, retire la capa de solución inferior y agregue nuevamente 500 microlitros de metanol al 100 %. Ahora, agite el tubo vigorosamente durante 30 segundos para desvitelinar los embriones. Luego, retire la solución sobrenadante, agregue nuevamente 500 microlitros de metanol al 100 % y agite el tubo durante otros 10 segundos.

Después de agitar el tubo, golpéelo suavemente para ayudar a que los embriones se asienten y elimine la mayor cantidad posible de solución. A continuación, enjuague brevemente los embriones con metanol al 100 %. Luego, enjuague inmediatamente los embriones tres veces con PBT.

Ahora, resuspenda los embriones en un mililitro de PBT fresco. Incube los embriones a 37 grados Celsius durante 15 minutos para prepararlos para la tinción con LacZ. Mientras los embriones se incuban, prepare un alícuota de un mililitro de solución de tinción con X-gal.

Caliente la alícuota en un baño de agua a 65 grados Celsius hasta que se enturbie. Luego, transfiera la muestra a un bloque térmico a 37 grados Celsius. Después de que los embriones hayan sido calentados durante 15 minutos, retire la solución PBT y sustitúyala por la alícuota de un mililitro de la solución de tinción.

Luego, agregue 20 microlitros de sustrato X-gal. Incube el tubo a 37 grados Celsius con agitación suave durante aproximadamente dos a cuatro horas, hasta que se forme un precipitado azul. A continuación, elimine la solución de tinción y lave los embriones tres veces con PBT a temperatura ambiente.

Después de los lavados, utilice una sonda de aguja o pinzas para clasificar manualmente los embriones bajo un microscopio de disección. Recolecte los embriones teñidos de interés en un tubo microcentrífugo de medio milímetro usando una pipeta de un mililitro. A continuación, lave los embriones seleccionados con 0,4 mililitros de PBT.

A continuación, sustituya el PBT por 0,3 mililitros de solución bloqueante y deje que los embriones se incuben con agitación suave durante 15 minutos. Después de 15 minutos, agregue 75 microlitros del anticuerpo primario y continúe la incubación durante la noche. A la mañana siguiente, lave los embriones con PBT durante aproximadamente dos horas, cambiando la solución de lavado cada 30 minutos aproximadamente.

Después del lavado, añada 0,3 mililitros de solución de bloqueo que contenga el anticuerpo secundario e incube el tubo con agitación suave a temperatura ambiente durante la noche. A la mañana siguiente, lave los embriones con PBT durante aproximadamente tres horas. Cambie el PBT al menos cinco veces durante el período de lavado.

Después del lavado, re suspenda los embriones en 0,3 mililitros de solución dab y agregue dos microlitros de peróxido de hidrógeno al 3%. Luego, incúbelos en la oscuridad con agitación suave a temperatura ambiente hasta que se produzca suficiente precipitado. Esto generalmente toma entre 30 y 60 minutos.

Luego, enjuague los embriones con PBT cuatro veces y resuspenda los embriones en 0,2 mililitros de solución de montaje. A continuación, permita que los embriones se equilibren en la oscuridad a 4 grados Celsius. Para filetear los embriones, colóquelos sobre un portaobjetos de vidrio.

Primero, colóquelos en una gota de glicerol con el lado ventral hacia arriba. A continuación, bajo un microscopio de disección, corte la parte anterior y un cuarto de la longitud del cuerpo y retire la región más posterior, que carece de axones motores. Ahora, utilizando una sonda de aguja, mueva el preparado fuera del glicerol, orientado con el lado dorsal hacia arriba, y colóquelo horizontalmente en el campo de visión.

El siguiente paso requiere una aguja fina de tungsteno que se ha insertado en la región hueca de una sonda de aguja y luego se ha doblado en el extremo. Utilizando la aguja de tungsteno, haga un pequeño corte en el extremo posterior del embrión y continúe cortando a lo largo de la línea media dorsal. Asegúrese de que la punta de la aguja de tungsteno no toque la superficie del portaobjetos de vidrio durante la disección, porque la aguja se doblará fácilmente al contacto con el vidrio.

Luego, con la sonda de regreso, prepare nuevamente la gota de glicerol y colóquela con el lado dorsal hacia arriba. Allí, separe el intestino de la pared corporal desdoblándola en dirección ventro-lateral. Las dos paredes corporales deben separarse.

Ahora, utilizando la sonda, mueva cuidadosamente las aletas de la pared corporal hacia un portaobjetos de vidrio. Sobre el portaobjetos, use una aguja de tungsteno para retirar los órganos internos empujándolos lateralmente. Para estabilizar la aguja de tungsteno y evitar que se dañe, mantenga la aguja hueca en posición y sostenga la aguja de tungsteno apoyada contra la superficie del portaobjetos mientras la manipula.

Ahora, monte las preparaciones en ocho microlitros de solución de montaje sobre un portaobjetos nuevo. Coloque un cubreobjetos y selle los bordes con esmalte de uñas común. Luego, capture imágenes con alta resolución utilizando óptica DIC.

Mediante el método descrito, se tiñeron embriones en la etapa 16 con anticuerpo Fas2 y se prepararon para la visualización de las neuronas motoras y los hemisegmentos abdominales A3 y A4. Normalmente, al menos siete neuronas motoras extienden y fasciculan sus axones para formar una rama nerviosa ISNb. Muchos haces nerviosos circundantes también fueron identificables en esta preparación. Cuando el haz nervioso intersegmentario llega al punto de elección en los músculos 6 y 7, dos axones se desfasciculan selectivamente e inervan los músculos 6 y 7.

Lo mismo ocurre en otros puntos de decisión a medida que el haz se extiende dorsalmente. Luego, en el último punto de decisión, dos axones inervan el músculo 12. En contraste, en embriones mutantes de Sema-1a, los mismos axones no logran desfascicularizarse en sus puntos de decisión.

Esto no es inesperado, ya que se sabe que el producto Sema-1 aegean ayuda a formar conexiones entre los axones motores y los músculos diana durante el desarrollo neural. Por lo tanto, el método descrito puede utilizarse para analizar fenotipos mutantes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo clasificar los embriones mutantes deseados, cómo inmunotincionar los patrones de proyección axonal de las neuronas motoras y cómo diseccionar embriones fijados para su preparación plana.