Name: Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-09-13T12:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprende mapeo óptico multiparamétrico para estudiar electrofisiología cardíaca, conducción y manejo de calcio en corazones de conejo Langendorff perfundidos. Esta técnica avanzada permite registrar potenciales de acción y transitorios de calcio simultáneamente con alta resolución espacial.

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NIH concede R01 HL085369, HL067322, HL082729, EB008999

1. Preparación <ol><li> Prepare una solución fresca Tyrodes hecho "(en mM, NaCl 128,2, 1,3 CaCl 2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 20,0 NaHCO3, y la glucosa 11.1). Para acelerar la preparación diaria de soluciones, preparar dos soluciones madre de antelación y almacenarlas a 4 ° C refrigerador: (1) archivo I (en g/2L, 374.6 NaCl, CaCl2 9,56, 17,52 KCl, 8,21 NaH 2 PO 4 , 10,67 MgCl 2) y (2) Foto II (en g/2L, 84,01 NaHCO 3). Para hacer 2 litros de solución suficiente para un experimento de tomar Tyrodes '1840mL de agua destilada y mezclar en ella 80 ml de archivo I, 80 ml de archivo II, y 4 g de glucosa. </li><li> Preparar soluciones madre de colorantes y desacopladores de: (1) de excitación-contracción blebbistatin desacoplador solución madre (Tocris Bioscience solución, 2mg/ml en DMSO), (2) sensibles al voltaje tinte di-4-ANEPPS solución (Invitrogen, 1mg/ml solución en DMSO), (3) sensibles al voltaje tinte RH 237 de la solución madre (Invitrogen, solución 1.25mg/ml en DMSO), (4) Indicador de calcio Rhod-2AM solución (Invitrogen, la solución de 1mg/ml en DMSO). Un experimento de conejo solo requiere de aproximadamente 30 l de la solución di-4-ANEPPS, 30 l de la solución madre RH237, y 200 l de la Rhod-2AM solución madre. Para evitar la congelación y descongelación repetida, almacenamos alícuotas de 100 l de di-4-ANEPPS a -20 ° C. Otros colorantes también se almacenan a -20 ° C. Guarde el blebbistatin disuelto en +4 º C refrigerador. </li><li> Antes de la cosecha del corazón, la solución de Tyrodes transferencia "en la botella de 2 litros y colocarlo en un baño de agua (Fisher Scientific) que mantiene la temperatura de la solución a 37 ° C. La solución es oxigenada con un 95% O 2 - 5% de CO 2. El pH se mantiene en 7,35 ± 0,05 ajustando el nivel de oxigenación. La solución se distribuye en el sistema de perfusión Langendorff y se filtra por un filtro de red de nylon (de tamaño de poro: 11μm, Millipore) colocado en la línea de perfusión antes de la cánula. </li><li> Preparar el equipo de supervisión antes de la cosecha del corazón. Un transductor de presión (IPM) se utiliza para controlar la presión aórtica durante el experimento. Línea de base del transductor de presión se ajusta a cero mmHg cuando el corazón no está conectado al sistema de perfusión. Pseudo-ECG se colocan electrodos en la cámara para dirigir aproximada I, II y III de la ECG Einthoven triángulo. </li></ol> 2. La cosecha y la perfusión de los corazones de conejo <ol><li> Fijar el conejo en la inmovilización de conejo. Sacrificar al conejo por una inyección intravenosa de pentobarbital sódico (50 mg / kg), con 2.000 U de heparina. Cuando el conejo está totalmente liquidado, el cual está determinado por la falta de reflejo de dolor, de la cavidad torácica se abrió rápidamente y el corazón y los pulmones extirpados se. </li><li> Haga un corte en el extremo superior de la aorta ascendente antes de todas las ramas del cayado aórtico. Expulsar el aire de la aorta ascendente y luego rápidamente canular el corazón de una cánula de calibre 16, que previamente ha sido conectado a un cazador de burbujas que es muy importante para mantener el aire fuera de las coronarias. Una vez que el corazón es retrógrada perfusión en un sistema de perfusión no recirculante Langendorff, hacer un corte para abrir el pericardio rápidamente. </li><li> Extirpar el pulmón, la tráquea, la grasa y los tejidos conectivos, mientras que la sangre se limpia por la perfusión. </li><li> ¡Muy importante! Un tubo de silicona (~ 3 cm de largo y 2 mm de diámetro) se inserta a través de una vena pulmonar y la válvula mitral hacia el ventrículo izquierdo (LV) y se mantiene durante todo el experimento. Este tubo se libera la solución que se encuentra atrapado en el VI. Sin circulación durante horas durante el experimento Langedorff-perfusión en un corazón mecánico inmovilizado, que puede causar isquemia severa en la cavidad del ventrículo izquierdo y producir arritmia. </li><li> Mover el corazón de la cánula a la recirculación de Langendorff sistema de perfusión con el aparato de mapeo óptico. </li></ol> 3. La realización de experimentos con el sistema de mapeo óptico panorámico <ol><li> Coloque el corazón en una cámara de hexágono a medida y conectar la cánula para el sistema de perfusión. Mantener la presión aórtica a 60 ± 5 mmHg, ajustando el caudal de la bomba de perfusión. Monitor de la derivación I pseudo-ECG. Mantener el pH a alrededor de 7,35 ± 0,05. </li><li> Apagar la luz de la habitación, porque es blebbistatin photoinactivated finales UV y baja (450 a 490 nm) 17 de la parte visible del espectro. Inyecte lentamente la solución madre blebbistatin a través del puerto de inyección en el cazador de burbujas de aire situado por encima de la cánula. Inyecte lentamente 0,1 ml por cada blebbistatin inyección en bolo. Espere a que la presión se estabilice antes de la próxima inyección. </li><li> Coloque con cuidado el electrodo de estimulación en el lugar específico de su diseño experimental. </li><li> Enfoque la imagen del corazón en el vidrio esmerilado situada en el plano de la imagen de cada matriz de fotodiodos (PDA) de tresespaciados uniformemente los ángulos que rodea el corazón. Ajustar la posición de la cánula y las distancias entre cada PDA y el corazón para que se ajuste el corazón en el campo de visión de los tres PDAs. Tome una fotografía de cada imagen que se enfoca en el cristal esmerilado. </li><li> Inyecte lentamente 10 ~ 20μL di-4-ANEPPS solución de reserva a través del puerto de inyección en la trampa de la burbuja de aire en la solución de perfusión. Espere 1 a 3 minutos antes de las grabaciones ópticas. </li><li> Para la primera grabación, a su vez la luz LED verde (sin filtro de excitación, INUNDACIONES LED, Lumileds), coge las grabaciones ópticas simultáneamente tres PDAs conectados con el sistema de adquisición de datos a medida, 5 y apagar la luz del LED. Comprobar la calidad de las señales de píxeles diferentes de los tres PDAs. Añadir 0,1 ~ 0,2 ml de solución madre blebbistatin si los artefactos de movimiento en el potencial de acción óptico se notan. Añadir otros 5 l di-4-ANEPPS solución de reserva si la señal-a-ruido es baja. </li><li> Finalizar el protocolo diseñado experimental para el estudio funcional. Re-mancha el corazón con una solución de almacenamiento adicional 5μL di-4-ANEPPS si la señal se deteriora durante los experimentos, debido a photobleaching o lavado. </li><li> Encienda la luz de la habitación después de la finalización del estudio funcional. Tomar imágenes del corazón de 36 ángulos iguales de tiempo. Esto se logra mediante la rotación del corazón a un paso de 10 ° con una cámara digital fija en el lugar de un PDA. </li><li> Quitaré el corazón de la cámara. Drenaje de todas las soluciones. Lave el sistema de perfusión en la secuencia de DI de agua, alcohol al 70% del reactivo, y de nuevo con agua DI. </li><li> El análisis de datos incluye la reconstrucción de la geometría del corazón de las 36 fotografías digitales, el registro de la señal óptica en la superficie de la geometría reconstruido, y la cuantificación de la duración del potencial de acción (APD), la velocidad de conducción (CV), fase, etc 6 </li></ol> 4. La realización de experimentos con el sistema de mapeo de doble <ol><li> (Continúa después de la parte 2) Coloque el corazón canulado en una cámara de vidrio (Radnoti) y conectar la cánula para el sistema de perfusión. Precisar el corazón de la parte inferior de silicio de la cámara en la punta del ventrículo y la aurícula. </li><li> Apagar la luz de la habitación. Inyecte lentamente la solución madre blebbistatin (15 ~ 20 minutos para llegar a 10μM) a través del puerto de inyección antes de la cánula de perfusión para inmovilizar el corazón. </li><li> Poner una placa Petri de plástico, o de las demás ventanas de vidrio, por encima de la superficie epicárdica para reducir el movimiento de la superficie de la solución. </li><li> Centra en dos cámaras CMOS en el sistema de mapeo dual (Ultima-L, SciMedia) en el mismo campo de visión. Fluorescencia emitida es separada por un espejo dicroico (635 de corte, Omega óptico), y filtrada por un filtro de 700 nm de paso largo (Thorlabs) para señales de tensión y por un 590/30 nm de paso de banda del filtro (Omega Optical) para las señales de calcio. </li><li> El objetivo de la guía a la luz de dos lámparas halógenas (Newport Oriel Instruments, Stratford, CT; SciMedia, Costa Mesa, CA) hacia el campo de la cartografía de vista para lograr una iluminación uniforme. Filtros de excitación (531/40 nm, SemRock) se utilizan. </li><li> Mancha el corazón con la solución de tinte sensible a la tensión de valores RH 237 (10 ~ 30 l) a través del puerto de inyección. </li><li> Mezclar la Rhod-2AM (0,2 ml) de solución madre con Pluronic F-127 (Invitrogen, una mezcla 1:1). Sonicar durante 1 minuto en un baño de ultrasonidos en baño María. Se inyecta la mezcla a través del puerto del trampero burbuja. Espere unos 20 minutos para permitir que el de-esterificación de los Rhod-02 a.m. antes de que comience la cartografía. </li><li> Para una grabación, apagar la bomba de superfusión para evitar el movimiento en la superficie de la solución, a su vez de la fuente de luz de excitación (las lámparas halógenas); tener grabaciones óptica utilizando dos cámaras conectadas al sistema de adquisición de datos (Ultima-L, SciMedia) , apague la luz de excitación, y encender la bomba de superfusión. Comprobar la calidad de las señales ópticas. Re-mancha el tejido si es necesario. </li><li> Terminar el resto del protocolo experimental diseñado para un estudio. </li><li> Encienda la luz de la habitación y tomar una fotografía del corazón que contiene el campo de visión. Quitaré el corazón de la cámara. Drenaje de todas las soluciones. Lave el sistema de perfusión en la secuencia de DI de agua, 70% de alcohol reactivo (Fisher Scientific), y el agua DI. </li><li> El análisis de datos contiene las medidas de APD, CV, la duración de calcio transitorios (CATD), la demora entre AP y el aumento del movimiento hacia arriba CAT, el tiempo de subida del calcio transitorio, y la constante de tiempo de un ajuste monoexponencial de la decadencia del gato. </li></ol> Los resultados representativos: <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig1.jpg" alt="Figura 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 1"> Figura 1. Los resultados representativos de un experimento de conejo Langendorff perfundidos mediante el sistema de cartografía óptica panorámica. (A) La opinión anterior del corazón de conejo y de la geometría del corazón de conejo reconstruido en la forma de una malla tridimensional de la red de superficie. (B) Tdesenvolvió superficie epicárdica con código de color de la fase (que se obtiene a partir del análisis del plano fase 18) indica el frente de onda en rojo durante un episodio de taquiarritmia. (C) Las grabaciones de la acción óptica potencial de cinco lugares alrededor de la singularidad de fase marcada por 1-5 en el panel B. (D) Ocho fotografías de frente de onda de activación (color rojo) durante un ciclo de propagación de una arritmia reentrante estable. Los círculos de frente de onda de las agujas del reloj alrededor de una singularidad de fase, que es visible en la superficie anterior del corazón. El color de la repolarización (azul) está dispuesto a ser parcialmente transparente para que el frente de onda posterior es visible (por ejemplo, a 80 ms, 100 ms, y 120 ms). Una película de esta arritmia reentrante se presenta en el video complementario 1. Los métodos para la reconstrucción de la geometría, el registro de la señal, el cálculo del mapa de fase, y se desenvuelve la superficie se describen en detalle en otra parte 6. <img src="/files/ftp_upload/3160/3160fig2.jpg" alt="Figura 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Figura 2"> Figura 2. Los resultados representativos de un experimento de conejo Langendorff perfundidos corazón mediante el sistema de mapeo dual (mapeo simultáneo de potencial de acción y el calcio transitorio). (A) La superficie anterior del corazón con el campo de la cartografía de vista cubiertos por los puntos negro. (B) Un primer plano de las grabaciones de un sitio. (C) muestra las huellas del potencial de acción (azul) y el calcio transitorio (rojo) de una serie de puntos espaciados uniformemente marcada por los puntos negro en el panel de A. Nótese que no todas las grabaciones de píxeles se muestran y la resolución espacial es de 200μm.

<ol><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of the heart.</a> Circ Res. 95, 21-33 (2004).</li>
<li>Panfilov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+heart+size+a+factor+in+ventricular+fibrillation%3F+Or+how+close+are+rabbit+and+human+hearts%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Is heart size a factor in ventricular fibrillation? Or how close are rabbit and human hearts?</a> Heart Rhythm. 3, 862-864 (2006).</li>
<li>Maier, L. S., Bers, D. M., Pieske, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+Ca%282%2B%29-handling+and+sarcoplasmic+reticulum+Ca%282%2B%29-content+in+isolated+rat+and+rabbit+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Differences in Ca(2+)-handling and sarcoplasmic reticulum Ca(2+)-content in isolated rat and rabbit myocardium.</a> J Mol Cell Cardiol. 32, 2249-2258 (2000).</li>
<li>Bray, M. A., Lin, S. F., Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+surface+reconstruction+and+fluorescent+visualization+of+cardiac+activation%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional surface reconstruction and fluorescent visualization of cardiac activation.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 47, 1382-1391 (2000).</li>
<li>Qu, F., Ripplinger, C. M., Nikolski, V. P., Grimm, C., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+panoramic+imaging+of+cardiac+arrhythmias+in+rabbit+heart%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Opt%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional panoramic imaging of cardiac arrhythmias in rabbit heart.</a> J Biomed Opt. 12, 044019-044019 (2007).</li>
<li>Lou, Q., Ripplinger, C. M., Bayly, P. V., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+panoramic+imaging+of+epicardial+electrical+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Quantitative panoramic imaging of epicardial electrical activity.</a> Ann Biomed Eng. 36, 1649-1658 (2008).</li>
<li>Kay, M. W., Amison, P. M., Rogers, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+surface+reconstruction+and+panoramic+optical+mapping+of+large+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional surface reconstruction and panoramic optical mapping of large hearts.</a> IEEE Trans Biomed Eng. 51, 1219-1229 (2004).</li>
<li>Li, W., Ripplinger, C. M., Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+monophasic+shocks+improve+electrotherapy+of+ventricular+tachycardia+in+a+rabbit+model+of+chronic+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Multiple monophasic shocks improve electrotherapy of ventricular tachycardia in a rabbit model of chronic infarction.</a> Heart Rhythm. 6, 1020-1027 (2009).</li>
<li>Ripplinger, C. M., Lou, Q., Li, W., Hadley, J., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Panoramic+imaging+reveals+basic+mechanisms+of+induction+and+termination+of+ventricular+tachycardia+in+rabbit+heart+with+chronic+infarction%3A+implications+for+low-voltage+cardioversion%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Panoramic imaging reveals basic mechanisms of induction and termination of ventricular tachycardia in rabbit heart with chronic infarction: implications for low-voltage cardioversion.</a> Heart Rhythm. 6, 87-97 (2009).</li>
<li>Efimov, I. R., Rendt, J. M., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+maps+of+intracellular+%5BCa2%2B%5Di+transients+and+action-potentials+from+the+surface+of+perfused+guinea-pig+hearts+%28abstract%29%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Optical maps of intracellular [Ca2+]i transients and action-potentials from the surface of perfused guinea-pig hearts (abstract).</a> Circulation. 90, 632-632 (1994).</li>
<li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts%3A+mechanisms+underlying+concordant+alternans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> J Physiol. 529, 171-188 (2000).</li>
<li>Fast, V. G., Ideker, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+optical+mapping+of+transmembrane+potential+and+intracellular+calcium+in+myocyte+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cardiovasc+Electrophysiol%22%5BJournal%5D)">Simultaneous optical mapping of transmembrane potential and intracellular calcium in myocyte cultures.</a> J Cardiovasc Electrophysiol. 11, 547-556 (2000).</li>
<li>Laurita, K. R., Singal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+action+potentials+and+calcium+transients+simultaneously+from+the+intact+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mapping action potentials and calcium transients simultaneously from the intact heart.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, 2053-2060 (2001).</li>
<li>Choi, B. R., Burton, F., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+Ca2%2B+triggers+early+afterdepolarizations+and+Torsade+de+Pointes+in+rabbit+hearts+with+type+2+long+QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic Ca2+ triggers early afterdepolarizations and Torsade de Pointes in rabbit hearts with type 2 long QT syndrome.</a> J Physiol. 543, 615-631 (2002).</li>
<li>Hwang, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+calcium+and+vulnerability+to+fibrillation+and+defibrillation+in+Langendorff-perfused+rabbit+ventricles%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Intracellular calcium and vulnerability to fibrillation and defibrillation in Langendorff-perfused rabbit ventricles.</a> Circulation. 114, 2595-2603 (2006).</li>
<li>Lou, Q., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+susceptibility+to+alternans+in+a+rabbit+model+of+chronic+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Conf+Proc+IEEE+Eng+Med+Biol+Soc%22%5BJournal%5D)">Enhanced susceptibility to alternans in a rabbit model of chronic myocardial infarction.</a> Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc. , 4527-4530 (2009).</li>
<li>Kolega, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototoxicity+and+photoinactivation+of+blebbistatin+in+UV+and+visible+light%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light.</a> Biochem Biophys Res Commun. 320, 1020-1025 (2004).</li>
<li>Bray, M. A., Wikswo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Considerations+in+phase+plane+analysis+for+nonstationary+reentrant+cardiac+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+E+Stat+Nonlin+Soft+Matter+Phys%22%5BJournal%5D)">Considerations in phase plane analysis for nonstationary reentrant cardiac behavior.</a> Phys Rev E Stat Nonlin Soft Matter Phys. 65, 051902-05 (2002).</li>
<li>Fast, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recording+action+potentials+using+voltage-sensitive+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Practical+methods+in+cardiovascular+research%22%5BJournal%5D)">Recording action potentials using voltage-sensitive dyes.</a> Practical methods in cardiovascular research. , 233-255 (2005).</li>
<li>Knisley, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmembrane+voltage+changes+during+unipolar+stimulation+of+rabbit+ventricle%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Transmembrane voltage changes during unipolar stimulation of rabbit ventricle.</a> Circ Res. 77, 1229-1239 (1995).</li>
<li>Bishop, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+photon+scattering+in+optical+signal+distortion+during+arrhythmia+and+defibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The role of photon scattering in optical signal distortion during arrhythmia and defibrillation.</a> Biophys J. 93, 3714-3726 (2007).</li>
<li>Efimov, I. R., Fedorov, V. V., Joung, B., Lin, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+cardiac+pacemaker+circuits%3A+methodological+puzzles+of+the+sinoatrial+node+optical+mapping%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping cardiac pacemaker circuits: methodological puzzles of the sinoatrial node optical mapping.</a> Circ Res. 106, 255-271 (2010).</li>
<li>Fedorov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart Rhythm. 4, 619-626 (2007).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Basándonos en nuestra experiencia, las claves para el éxito de Langendorff perfundidos experimento corazón de conejo son una solución bien preparada Tyrodes, cosecha rápida del corazón, en buen estado la presión de perfusión, y el pH adecuado de la solución oxigenada en el sistema de perfusión. Con el fin de registrar la señal con más alto posible relación señal-ruido, debemos tener en cuenta factores como la fuente de luz, filtros de luz, enfocando la óptica, fotodetectores, etc 19. Los detalles de estos aspectos se discuten en otro lugar 19. Los conejos jóvenes (edad: 4-5 meses; peso: 9.7 libras) podría ser utilizado para evitar la grasa epicárdica, lo que disminuye la relación señal-ruido de las señales ópticas. La señal registrada por cada píxel es una integración ponderada de la luz emitida por un volumen de tejido. La profundidad de este volumen de tejido depende de las longitudes de onda de excitación y emisión de los colorantes utilizados. Por di-4-ANEPPS, como ejemplo, la profundidad de penetración estimada es de 300μm en el corazón de conejo 20. Por lo tanto, la interpretación de la señal óptica se debe hacer con precaución cuando la heterogeneidad local de la función eléctrica están presentes en el nodo sinusal, nódulo auriculoventricular, y durante la arritmia ventricular 1,21,22. Una de las limitaciones de la técnica de mapeo óptico en comparación con la grabación de electrodos es que la fase de repolarización del potencial de acción es a menudo óptica distored por los artefactos de movimiento causado por la contracción cardíaca. Restricción mecánica se podría utilizar para reducir el artefacto, pero no lo elimina completamente. En comparación, farmacológicos excitación-contracción desacopladores son eficaces para eliminar los artefactos de movimiento. Sin embargo, estos desacopladores (por ejemplo, 2,3-butanodiona monoxima) podría tener importantes efectos secundarios electrofisiológicos. Blebbistatin se ha demostrado no tener efectos adversos sobre la electrofisiología cardíaca en el corazón normal 23, y por lo tanto un desacoplador prometedoras para el mapeo óptico. Cabe señalar que la aceleración de edema debido a la abolición de la contracción podría afectar también a la electrofisiología.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S271-1 </td></tr><tr><td> CaCl2 (2H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> C79-500 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S217-500 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (6H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> M33-500 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 (H 2 O) </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S369-500 </td></tr><tr><td> NaHCO3 </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> S233-3 </td></tr><tr><td> D-glucosa </td><td> Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ </td><td> D16-1 </td></tr><tr><td> Blebbistatin </td><td> Bioscience Tocris, Ellisville, MO </td><td> 1760 </td></tr><tr><td> Di-4-ANEPPS </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> D1199 </td></tr><tr><td> RH237 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> S1109 </td></tr><tr><td> Rhod-2AM </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> R1244 </td></tr><tr><td> Pluronic F127 </td><td> Invitrogen, Carlsbad, CA </td><td> P3000MP </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido (DMSO) </td><td> Sigma, St. Louis, MO </td><td> D2650 </td></tr></tbody></table>

multiparamétrico óptico cartografía del corazón de conejo langendorff perfundidos

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Imágenes ópticas y sondas fluorescentes metodología de investigación avanzado significativamente en el campo de la electrofisiología cardiaca de manera que no podría haber sido logrado por otros enfoques 1. Con el uso de los tintes de calcio y sensibles al voltaje, mapeo óptico permite la medición de potenciales de acción transmembrana y transitorios de calcio con una alta resolución espacial sin el contacto físico con el tejido. Esto hace que las mediciones de la actividad eléctrica cardíaca posible bajo muchas condiciones donde el uso de electrodos es inconveniente o imposible 1. Por ejemplo, las grabaciones ópticas proporcionan precisión los cambios morfológicos del potencial de membrana durante e inmediatamente después de la estimulación y desfibrilación, mientras que las técnicas convencionales de electrodos sufren de estímulo inducido por los artefactos durante y después de los estímulos debido a la polarización del electrodo 1. El corazón de conejo Langendorff perfundidos es uno de los modelos más estudiados de la fisiología del corazón humano y la fisiopatología. Existen muchos tipos de arritmias observadas clínicamente podría ser recapitulado en el modelo de corazón de conejo. Se ha demostrado que los patrones de ondas en el corazón de conejo en las arritmias ventriculares, según el número de efectivos del corazón y de la longitud de onda de la reentrada, son muy similares a la de los dos corazón humano. También se demostró que los aspectos críticos de excitación-contracción (CE) de acoplamiento en el miocardio de conejo, como la contribución relativa de retículo sarcoplásmico (SR), es muy similar a la humana acoplamiento CE 3. Aquí se presentan los procedimientos básicos de los experimentos de mapeo óptico en el corazón de conejo Langendorff perfundidos, incluyendo la configuración del sistema Langendorff perfusión, la configuración de los sistemas de mapeo óptico, el aislamiento y la canalización del corazón, la perfusión y el colorante mancha del corazón, de excitación-contracción desacoplamiento y la recolección de señales ópticas. Estos métodos podrían aplicarse también en el corazón de otras especies de conejo, con los ajustes a las tasas de flujo, la óptica, soluciones, etc Dos sistemas de mapeo óptico se describen. El sistema de cartografía panorámica se utiliza para asignar el epicardio todo del corazón de conejo 4-7. Este sistema proporciona una visión global de la evolución de los circuitos de reentrada durante arritmogénesis y la desfibrilación, y se ha utilizado para estudiar los mecanismos de las arritmias y la terapia antiarrítmica 8,9. El sistema de mapeo dual se utiliza para asignar el potencial de acción (AP) y el calcio transitorio (CAT) de forma simultánea desde el mismo campo de visión 10/13. Este enfoque ha mejorado nuestra comprensión de la importancia del calcio en la alternancia eléctrica y la inducción de arritmias 14-16.

En este artículo se describen los procedimientos básicos para la realización de experimentos ópticos de asignación en el corazón de conejo Langendorff perfundidos con el sistema de imágenes panorámicas, y el doble (voltaje y calcio) modalidad de imagen.

Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos

La imagen óptica y las sondas fluorescentes han avanzado significativamente la metodología de investigación en el campo de la electrofisiología cardíaca de maneras que no podrían...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar las propiedades electrofisiológicas cardíacas, como la conducción, la repolarización, la arritmogénesis y el manejo del calcio, mediante el uso de técnicas de mapeo óptico en el corazón de conejo perfundido en Langendorff. Esto se logra primero mediante el aislamiento y la perfusión retrógrada de un corazón de conejo intacto a través de la aorta. El siguiente paso del procedimiento consiste en exponer la superficie del corazón, abolir las contracciones cardíacas utilizando un agente de acoplamiento excitación-contracción como el Coler BLEs statin, y teñir adecuadamente el miocardio con indicadores fluorescentes sensibles al voltaje y al calcio.Luego se realizan grabaciones de potenciales de acción ópticos de gran parte del epicardio ventricular utilizando el sistema de mapeo óptico panorámico. Las señales ópticas se proyectan entonces sobre una geometría 3D reconstruida de la superficie epicárdica del corazón. Durante este paso, el potencial de acción óptico y la transiente de calcio pueden registrarse simultáneamente utilizando el sistema de imagen dual no panorámico.Este procedimiento proporciona datos cuantitativos del miocardio espacial y temporal, excitación y repolarización, así como características congruentes del manejo del calcio, que pueden analizarse durante el ritmo regular, así como durante arritmias auriculares y ventriculares. Hola, mi nombre es Dra. Iger Eov. Soy profesora de ingeniería biomédica en la Universidad de Washington en St. Louis.La técnica óptica que presentamos hoy es una tecnología única que ofrece varias ventajas frente a los micro y microelectrogramas tradicionales, ya que es capaz de registrar simultáneamente decenas, incluso decenas de miles de potenciales de acción y transitorios de calcio. Además, esta tecnología es inmune a los artefactos provocados por la estimulación eléctrica y la desfibrilación, los cuales distorsionan fuertemente los potenciales de acción registrados mediante cualquier electrograma. Asimismo, los transitorios de calcio solo pueden registrarse mediante esta técnica.No existe ninguna alternativa. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo de la electrofisiología cardíaca, como los mecanismos de inducción, mantenimiento y terminación de arritmias auriculares y ventriculares potencialmente mortales, así como la modelización funcional de la conducción, la excitación y el acoplamiento excitación-contracción en enfermedades como la cardiopatía congénita, las enfermedades metabólicas y la insuficiencia cardíaca. Una vez preparado para la cirugía, se sacrifica a un conejo con una mezcla de pentobarbital sódico y heparina.En cuanto el conejo deje de responder a un reflejo de dolor, abra su tórax y extirpe el corazón y los pulmones. Realice un corte en el extremo superior de la aorta ascendente antes de que todos los ramos del arco aórtico se conecten a la bomba para iniciar el flujo de la solución Tyro en el sistema de perfusión LRF no recirculante. Coloque rápidamente el corazón en la cánula de aorta de calibre 16 conectada al sistema de perfusión LOR.Extraiga el aire de la aorta y cierre la cánula de la aorta una vez que esté completamente perfundida. No pierda tiempo al abrir el pericardio. Luego, retire la grasa del pulmón, tráquea y tejidos conectivos que rodean el corazón.Es muy importante prevenir la acumulación de líquido en el ventrículo izquierdo, lo que provocaría isquemia. Por lo tanto, inserte un tubo de drenaje de silicona a través de una vena pulmonar y la válvula mitral y hasta el ventrículo izquierdo. Ahora mueva el corazón con la cánula hacia el sistema de perfusión Langendorff recirculante equipado con sistema de mapeo óptico.Coloque el corazón en una cámara hexagonal hecha a medida y conecte la cánula al sistema de perfusión. Monitoree la presión aórtica utilizando un transductor de presión y manténgala alrededor de 60 más o menos cinco milímetros de mercurio ajustando el caudal de la bomba de perfusión. Mantenga el pH alrededor de 7,35 más o menos 0,05.Apague la luz de la habitación e inyecte lentamente la solución stock de estatina BLE sensible a la luz a través del puerto de inyección en el atrapador de burbujas de aire ubicado por encima de la cánula. Para alcanzar una concentración de 10 micromolar de estatina BLE, inyecte lentamente 0,1 mililitros de estatina BLE. Después de cada inyección en bolo, espere a que la presión se estabilice antes de realizar la siguiente inyección.Coloque las matrices de fotodiodos o PDAs en tres ángulos equidistantes alrededor del corazón. Luego, en cada PDA, enfoque la imagen del corazón sobre el vidrio esmerilado del plano de la imagen. Ajuste la posición de la cánula en la cámara hexagonal y de cada PDA hasta que el corazón quede dentro del campo de visión de los tres PDAs.Luego, tome una imagen de cada campo enfocado sobre el vidrio esmerilado. Inyecte lentamente de 10 a 20 microlitros de la solución stock de D cuatro Anep en la solución de perfusión a través del puerto de inyección en el trampa de burbujas de aire. Y espere tres minutos.A continuación, coloque suavemente el electrodo de estimulación en la ubicación deseada. Aquí se coloca en el centro de la vista anterior del corazón. Comience a realizar grabaciones ópticas simultáneas desde los PDAs.Asegúrese de que no haya artefactos de movimiento en la señal óptica y de que la relación señal-ruido sea suficiente para el análisis posterior de los datos. Cuando termine, encienda las luces de la habitación y realice un registro fotográfico del corazón tomando una fotografía por cada 10 grados de rotación desde una cámara colocada en la posición de uno de los PDAs. A continuación, proceda a limpiar el sistema de perfusión.Coloque el corazón canulado en una cámara de vidrio rad naughty y conecte la cánula al sistema de perfusión. Fije el corazón al fondo de silicona de la cámara en el ápice ventricular y las aurículas. Para inmovilizar el corazón, apague la luz del cuarto e inyecte lentamente BLEs statin a través del puerto de inyección para reducir el movimiento de la superficie de la solución.Coloque una cubierta de vidrio sobre la superficie epicárdica. Esta parte del procedimiento normalmente se realiza en la oscuridad, pero en este caso se está realizando a la luz. Para mejorar la imagen del video, mueva el sistema de imagen dual encima del corazón.Ahora enfoque las dos cámaras CMO en el mismo campo de visión. A continuación, coloque los guías de luz para dos lámparas halógenas con filtro de excitación. Tiña el corazón agregando de 10 a 20 microlitros del colorante sensible al voltaje RH 2 37 a través del puerto de inyección.Luego, agregue 200 microlitros de road 2:00 AM con onic F1 27 en una mezcla uno a uno a través del puerto de las trampas de burbujas. Espere aproximadamente 20 minutos para permitir la DS ificación de la road 2:00 AM antes de comenzar la cartografía. Ahora realice una grabación de prueba.Apague la bomba de superfusión para evitar movimientos en la superficie de la solución. Encienda las lámparas de halógeno y realice una grabación óptica desde ambas cámaras. Luego apague la luz de excitación.Encienda la bomba de superfusión y verifique la calidad de las señales ópticas. Si la señal es débil, vuelva a teñir el corazón con RH 2 37 adicional y road 2:00 AM. Si hay artefactos de movimiento, agregue estatina BLE adicional de inmediato para eliminar el movimiento, asegurándose de que todo esté en orden. Continúe con el experimento planeado y limpie el sistema.Una vez finalizado, se utilizó el sistema de mapeo óptico panorámico para mostrar esta vista anterior de un corazón de conejo Lang Endorf perfundido. Por comparación, una reconstrucción de la geometría del corazón muestra la misma vista anterior. La superficie epicárdica desenrollada que se muestra aquí está codificada por colores según la fase.El corazón estaba experimentando un episodio de arritmia táquica desde cinco ubicaciones alrededor del rotor. Se presentaron potenciales de acción ópticos. Aquí, en rojo, se observa un frente de activación que se propaga durante un ciclo de arritmia reentrante estable.El frente de onda gira en sentido horario alrededor de una singularidad de fase en la superficie anterior del corazón. La repolarización se muestra en azul transparente para permitir la visualización de los frentes de onda en la superficie posterior. El corazón se analizó mediante el sistema de mapeo dual para mostrar el mapeo simultáneo de potenciales de acción y transitorios de calcio.Una vista de cerca de las grabaciones de un sitio muestra que los potenciales de acción están en azul y el transitorio de calcio en rojo. Se muestran una serie de trazas de ejemplo procedentes de una matriz de sitios equidistantes, como se representa mediante los puntos en esta vista anterior. Estos datos se recopilaron con una resolución óptica de 200 micrómetros por 200 micrómetros por píxel.Las implicaciones de la terapia amplían la terapia de desfibrilación para arritmias auriculares y ventriculares de 10 K, ya que podemos visualizar directamente el efecto de los estímulos eléctricos intensos durante la electroterapia. Ningún método alternativo es capaz de hacerlo. Mediante este método, desarrollamos y validamos una nueva terapia de desfibrilación indolora de bajo voltaje para la fibrilación auricular y la taquicardia ventricular.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este artículo se describe una técnica de alta resolución temporal y espacial de la imagen ópticamente movimiento de acción potencial en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos con un tinte potenciométrica (di-8-ANEPPS).

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Este informe proporciona una descripción detallada de la metodología y los resultados del mapeo simultáneo óptico endocárdico y epicárdico de excitación eléctrica de la aurícula izquierda intacta de un corazón de oveja Langendorff perfundidos durante el estiramiento inducido por fibrilación auricular.

Cartografía de alta resolución óptica endocárdicos y epicárdicos en un modelo de ovejas inducidas por el estiramiento de la fibrilación auricular

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Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

En este video, realizamos la perfusión retrógrada de Langendorff de un corazón de ratón aislado. Durante el procedimiento, la actividad cardíaca del corazón se mantiene perfundiéndolo retrógradamente con una solución de perfusión a través de las arterias coronarias mediante una cánula insertada en la aorta ascendente. El modelo se utiliza para estudiar la fisiopatología cardíaca del corazón.

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En este artículo se describe el protocolo detallado y equipos necesarios para el mapeo óptico dual de potencial transmembrana (V m) y libre retículo intra-sarcoplásmico (SR) Ca 2+ en el corazón de conejo perfundidos Langendorff. Este método permite la observación directa y la cuantificación de V m y SR Ca 2+ dinámica en el corazón intacto.

Mapeo óptico de Intra-retículo sarcoplásmico Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Y potencial transmembrana en el corazón de conejo perfundidos Langendorff

A continuación, se presenta un protocolo para el mapeo óptico de la actividad eléctrica de la aurícula derecha del ratón y, especialmente, el nodo sinoauricular, con una resolución espacial y temporal alta.

-Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón

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