Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos
13 de septiembre de 2011
En este artículo se describen los procedimientos básicos para la realización de experimentos ópticos de asignación en el corazón de conejo Langendorff perfundidos con el sistema de imágenes panorámicas, y el doble (voltaje y calcio) modalidad de imagen.
El objetivo general de este procedimiento es estudiar las propiedades electrofisiológicas cardíacas, como la conducción, la repolarización, la arritmogénesis y el manejo del calcio, mediante el uso de técnicas de mapeo óptico en el corazón de conejo perfundido en Langendorff. Esto se logra primero mediante el aislamiento y la perfusión retrógrada de un corazón de conejo intacto a través de la aorta. El siguiente paso del procedimiento consiste en exponer la superficie del corazón, abolir las contracciones cardíacas utilizando un agente de acoplamiento excitación-contracción como el Coler BLEs statin, y teñir adecuadamente el miocardio con indicadores fluorescentes sensibles al voltaje y al calcio.
Luego se realizan grabaciones de potenciales de acción ópticos de gran parte del epicardio ventricular utilizando el sistema de mapeo óptico panorámico. Las señales ópticas se proyectan entonces sobre una geometría 3D reconstruida de la superficie epicárdica del corazón. Durante este paso, el potencial de acción óptico y la transiente de calcio pueden registrarse simultáneamente utilizando el sistema de imagen dual no panorámico.
Este procedimiento proporciona datos cuantitativos del miocardio espacial y temporal, excitación y repolarización, así como características congruentes del manejo del calcio, que pueden analizarse durante el ritmo regular, así como durante arritmias auriculares y ventriculares. Hola, mi nombre es Dra. Iger Eov. Soy profesora de ingeniería biomédica en la Universidad de Washington en St. Louis.
La técnica óptica que presentamos hoy es una tecnología única que ofrece varias ventajas frente a los micro y microelectrogramas tradicionales, ya que es capaz de registrar simultáneamente decenas, incluso decenas de miles de potenciales de acción y transitorios de calcio. Además, esta tecnología es inmune a los artefactos provocados por la estimulación eléctrica y la desfibrilación, los cuales distorsionan fuertemente los potenciales de acción registrados mediante cualquier electrograma. Asimismo, los transitorios de calcio solo pueden registrarse mediante esta técnica.
No existe ninguna alternativa. Este método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo de la electrofisiología cardíaca, como los mecanismos de inducción, mantenimiento y terminación de arritmias auriculares y ventriculares potencialmente mortales, así como la modelización funcional de la conducción, la excitación y el acoplamiento excitación-contracción en enfermedades como la cardiopatía congénita, las enfermedades metabólicas y la insuficiencia cardíaca. Una vez preparado para la cirugía, se sacrifica a un conejo con una mezcla de pentobarbital sódico y heparina.
En cuanto el conejo deje de responder a un reflejo de dolor, abra su tórax y extirpe el corazón y los pulmones. Realice un corte en el extremo superior de la aorta ascendente antes de que todos los ramos del arco aórtico se conecten a la bomba para iniciar el flujo de la solución Tyro en el sistema de perfusión LRF no recirculante. Coloque rápidamente el corazón en la cánula de aorta de calibre 16 conectada al sistema de perfusión LOR.
Extraiga el aire de la aorta y cierre la cánula de la aorta una vez que esté completamente perfundida. No pierda tiempo al abrir el pericardio. Luego, retire la grasa del pulmón, tráquea y tejidos conectivos que rodean el corazón.
Es muy importante prevenir la acumulación de líquido en el ventrículo izquierdo, lo que provocaría isquemia. Por lo tanto, inserte un tubo de drenaje de silicona a través de una vena pulmonar y la válvula mitral y hasta el ventrículo izquierdo. Ahora mueva el corazón con la cánula hacia el sistema de perfusión Langendorff recirculante equipado con sistema de mapeo óptico.
Coloque el corazón en una cámara hexagonal hecha a medida y conecte la cánula al sistema de perfusión. Monitoree la presión aórtica utilizando un transductor de presión y manténgala alrededor de 60 más o menos cinco milímetros de mercurio ajustando el caudal de la bomba de perfusión. Mantenga el pH alrededor de 7,35 más o menos 0,05.
Apague la luz de la habitación e inyecte lentamente la solución stock de estatina BLE sensible a la luz a través del puerto de inyección en el atrapador de burbujas de aire ubicado por encima de la cánula. Para alcanzar una concentración de 10 micromolar de estatina BLE, inyecte lentamente 0,1 mililitros de estatina BLE. Después de cada inyección en bolo, espere a que la presión se estabilice antes de realizar la siguiente inyección.
Coloque las matrices de fotodiodos o PDAs en tres ángulos equidistantes alrededor del corazón. Luego, en cada PDA, enfoque la imagen del corazón sobre el vidrio esmerilado del plano de la imagen. Ajuste la posición de la cánula en la cámara hexagonal y de cada PDA hasta que el corazón quede dentro del campo de visión de los tres PDAs.
Luego, tome una imagen de cada campo enfocado sobre el vidrio esmerilado. Inyecte lentamente de 10 a 20 microlitros de la solución stock de D cuatro Anep en la solución de perfusión a través del puerto de inyección en el trampa de burbujas de aire. Y espere tres minutos.
A continuación, coloque suavemente el electrodo de estimulación en la ubicación deseada. Aquí se coloca en el centro de la vista anterior del corazón. Comience a realizar grabaciones ópticas simultáneas desde los PDAs.
Asegúrese de que no haya artefactos de movimiento en la señal óptica y de que la relación señal-ruido sea suficiente para el análisis posterior de los datos. Cuando termine, encienda las luces de la habitación y realice un registro fotográfico del corazón tomando una fotografía por cada 10 grados de rotación desde una cámara colocada en la posición de uno de los PDAs. A continuación, proceda a limpiar el sistema de perfusión.
Coloque el corazón canulado en una cámara de vidrio rad naughty y conecte la cánula al sistema de perfusión. Fije el corazón al fondo de silicona de la cámara en el ápice ventricular y las aurículas. Para inmovilizar el corazón, apague la luz del cuarto e inyecte lentamente BLEs statin a través del puerto de inyección para reducir el movimiento de la superficie de la solución.
Coloque una cubierta de vidrio sobre la superficie epicárdica. Esta parte del procedimiento normalmente se realiza en la oscuridad, pero en este caso se está realizando a la luz. Para mejorar la imagen del video, mueva el sistema de imagen dual encima del corazón.
Ahora enfoque las dos cámaras CMO en el mismo campo de visión. A continuación, coloque los guías de luz para dos lámparas halógenas con filtro de excitación. Tiña el corazón agregando de 10 a 20 microlitros del colorante sensible al voltaje RH 2 37 a través del puerto de inyección.
Luego, agregue 200 microlitros de road 2:00 AM con onic F1 27 en una mezcla uno a uno a través del puerto de las trampas de burbujas. Espere aproximadamente 20 minutos para permitir la DS ificación de la road 2:00 AM antes de comenzar la cartografía. Ahora realice una grabación de prueba.
Apague la bomba de superfusión para evitar movimientos en la superficie de la solución. Encienda las lámparas de halógeno y realice una grabación óptica desde ambas cámaras. Luego apague la luz de excitación.
Encienda la bomba de superfusión y verifique la calidad de las señales ópticas. Si la señal es débil, vuelva a teñir el corazón con RH 2 37 adicional y road 2:00 AM. Si hay artefactos de movimiento, agregue estatina BLE adicional de inmediato para eliminar el movimiento, asegurándose de que todo esté en orden. Continúe con el experimento planeado y limpie el sistema.
Una vez finalizado, se utilizó el sistema de mapeo óptico panorámico para mostrar esta vista anterior de un corazón de conejo Lang Endorf perfundido. Por comparación, una reconstrucción de la geometría del corazón muestra la misma vista anterior. La superficie epicárdica desenrollada que se muestra aquí está codificada por colores según la fase.
El corazón estaba experimentando un episodio de arritmia táquica desde cinco ubicaciones alrededor del rotor. Se presentaron potenciales de acción ópticos. Aquí, en rojo, se observa un frente de activación que se propaga durante un ciclo de arritmia reentrante estable.
El frente de onda gira en sentido horario alrededor de una singularidad de fase en la superficie anterior del corazón. La repolarización se muestra en azul transparente para permitir la visualización de los frentes de onda en la superficie posterior. El corazón se analizó mediante el sistema de mapeo dual para mostrar el mapeo simultáneo de potenciales de acción y transitorios de calcio.
Una vista de cerca de las grabaciones de un sitio muestra que los potenciales de acción están en azul y el transitorio de calcio en rojo. Se muestran una serie de trazas de ejemplo procedentes de una matriz de sitios equidistantes, como se representa mediante los puntos en esta vista anterior. Estos datos se recopilaron con una resolución óptica de 200 micrómetros por 200 micrómetros por píxel.
Las implicaciones de la terapia amplían la terapia de desfibrilación para arritmias auriculares y ventriculares de 10 K, ya que podemos visualizar directamente el efecto de los estímulos eléctricos intensos durante la electroterapia. Ningún método alternativo es capaz de hacerlo. Mediante este método, desarrollamos y validamos una nueva terapia de desfibrilación indolora de bajo voltaje para la fibrilación auricular y la taquicardia ventricular.
Descripción general
Este artículo describe los procedimientos para realizar experimentos de mapeo óptico en el corazón de conejo perfundido mediante el método de Langendorff, utilizando un sistema de imagen panorámico. El estudio se centra en las propiedades electrofisiológicas cardíacas, incluyendo la conducción y el manejo del calcio.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Electrofisiología cardíaca
- Técnicas de mapeo óptico
- Arritmogénesis
Antecedentes
- El mapeo óptico permite la grabación simultánea de potenciales de acción y transitorios de calcio.
- Este método proporciona información sobre la función cardíaca y las arritmias.
- Los métodos tradicionales pueden estar limitados por artefactos provenientes de la estimulación eléctrica.
- El estudio utiliza un modelo de corazón de conejo perfundido mediante técnica de Langendorff.
Objetivo del estudio
- Investigar la conducción cardíaca, la repolarización y la arritmogénesis.
- Analizar el manejo del calcio en el miocardio.
- Proporcionar datos cuantitativos sobre la dinámica de excitación y repolarización.
Métodos Utilizados
- Aislamiento y perfusión retrógrada del corazón de conejo.
- Tinción del miocardio con indicadores fluorescentes sensibles al voltaje y al calcio.
- Grabación de potenciales de acción ópticos mediante un sistema panorámico de mapeo óptico.
- Imagen dual simultánea de potenciales de acción ópticos y transitorios de calcio.
Resultados Principales
- Datos cuantitativos sobre las características espaciales y temporales del miocardio.
- Información sobre los mecanismos de las arritmias y las enfermedades cardíacas.
- Exposición de las ventajas del mapeo óptico frente a los electrogramas tradicionales.
Conclusiones
- La cartografía óptica es una herramienta poderosa para estudiar la electrofisiología cardíaca.
- Esta técnica puede ayudar a responder preguntas clave en la investigación de arritmias.
- Estudios futuros pueden aprovechar este método para obtener mayores conocimientos sobre la función cardíaca.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El mapeo óptico en corazones de conejo perfundidos mediante el método Langendorff permite una visualización de alta resolución y libre de artefactos de la electrofisiología cardíaca, apoyando la reducción mecanicista de riesgos en la validación de dianas antiarrítmicas. Este enfoque proporciona datos cuantitativos espacio-temporales sobre potenciales de acción y transitorios de calcio, aportando directamente información sobre la confianza predictiva en modelos preclínicos de arritmias ventriculares y auriculares. El método conecta la biología del descubrimiento con la investigación traslacional al permitir una evaluación reproducible y escalable del riesgo proarrítmico y de la respuesta terapéutica en un sistema relevante para la enfermedad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la cartografía de la dinámica de ondas reentrantes y singularidades de fase durante arritmias inducidas.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de objetivos mediante imágenes simultáneas de voltaje y calcio para reducir los riesgos asociados a los mecanismos de acoplamiento excitación-contracción.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al cuantificar la vulnerabilidad del sustrato arritmogénico bajo condiciones controladas de perfusión.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante el establecimiento de fenotipos basales de propiedades electrofisiológicas y manejo de calcio.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad del ensayo mediante el control de la perfusión Langendorff y protocolos de tinción con colorantes.
- Escalabilidad: Destaca la preparación para cribado mediante sistemas panorámicos y de doble imagen capaces de registrar ópticamente múltiples sitios simultáneamente.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Relevancia para la enfermedad: Utiliza un modelo de corazón de conejo con similitud demostrada respecto al acoplamiento excitación-contracción y a los patrones de onda de arritmia en humanos.
- Continuidad traslacional: Conecta hallazgos de descubrimiento con validación preclínica mediante análisis cuantitativo de la conducción, la repolarización y el manejo del calcio durante ritmos normales y arrítmicos.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya las decisiones de continuar o no continuar proporcionando conocimientos mecanicistas sobre la inducción, el mantenimiento y la terminación de arritmias.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos activos y la evaluación preclínica, permitiendo la refinación iterativa de candidatos antiarrítmicos basada en perfiles electrofisiológicos y de manejo del calcio.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al visualizar las relaciones entre la dinámica del rotor y el transitorio de calcio del potencial de acción durante la arritmogénesis.
- Selección: Describe la disponibilidad del ensayo mediante la adquisición reproducible de señales ópticas con una relación señal-ruido suficiente para el análisis espacio-temporal.
- Análisis: Destaca las mediciones cuantitativas de la dinámica de excitación y repolarización, permitiendo la evaluación comparativa entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta el método con la continuidad preclínica mediante modelos de arritmia relevantes a enfermedades y conocimientos sobre el manejo de calcio relacionados con insuficiencia cardíaca y enfermedades metabólicas.
- Reutilización Empresarial: Presenta el sistema de mapeo óptico como una plataforma reutilizable para evaluar múltiples compuestos o modificaciones genéticas en una preparación estandarizada de corazón perfundido.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos terapéuticos, reducción de la ambigüedad mecanicista en los mecanismos de arritmia.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de las mediciones electrofisiológicas y de transitorios de calcio.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance/no avance, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas en programas cardiovasculares.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en datos cuantitativos de riesgo de arritmia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en aislamiento cardíaco, perfusión Langendorff y manejo de colorantes fluorescentes.
- Necesita sistemas de mapeo óptico con matrices de fotodiodos o cámaras CMOS, fuentes de luz y control de presión de perfusión.
- Exige estandarización entre equipos de los protocolos de tinción, desacoplamiento excitación-contracción y parámetros de adquisición de señales.
- Incluye consideraciones de adaptación para tasas de flujo, óptica y carga de colorante específicas de cada especie al extenderse más allá de corazones de conejo.
- Incluye limitaciones prácticas como el fotoblanqueo del colorante, la susceptibilidad a artefactos por movimiento y la necesidad de mantener con precisión la temperatura y el pH durante los experimentos.
