Name: -Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Aprende mapeo óptico de alta resolución del nodo sinoauricular en corazón de ratón perfundido con Langendorff. Este método permite estudiar arritmias auriculares y anomalías del marcapasos con gran precisión espacial.

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Contamos con el apoyo de la start-up de la Facultad de Medicina de la Universidad de Wisconsin-Madison (A.V.G.).

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los Institutos Nacionales de Salud de Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio (NIH Pub. No. 80-23). Todos los métodos y protocolos que se utilizan en estos estudios han sido aprobados por la Universidad de Wisconsin Cuidado de Animales y el empleo Comité de Protocolo siguiendo las directrices para el cuidado y uso de animales de laboratorio publicados por el NIH (publicación No. 85-23, revisada en 1996). Todos los animales utilizados en este estudio recibieron atención humanitaria de conformidad con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. 1. Eliminación del corazón y la perfusión de Langendorff <ol><li> Antes del aislamiento del corazón, la solución de Tyrode caliente a 37 ° C utilizando un baño de agua y una camisa de agua. </li><li> Anestesiar al ratón con isoflurano 5% / 95% de O2. </li><li> Garantizar el nivel adecuado de anestesia mediante la comprobación de la pérdida del reflejo del dolor. </li><li> Realizar una toracotomía. Abre el cofre mediante el uso de curvas 5.5 &quot;tijeras de Mayo y 5.5&quot; hemostática para Kellyceps para hacer un corte de 1 cm en la parte frontal del tórax. <ol><li> extraer rápidamente el corazón del pecho (a menos de 30 segundos). Utilice 4 &quot;Iris fórceps curvos para agarrar el tejido pulmonar y cortar el pulmón, el timo y el corazón junto con el pericardio mediante 4.3&quot; tijeras iris. No agarre directamente el corazón. </li><li> Lavar en oxigenada (95% O 2/5% de CO 2), a temperatura constante (36,8 ± 0,4 ° C) modificado solución de Tyrode. Utilice la siguiente composición de la solución (en mM): NaCl 128,2, KCl 4,7, 1,19 NaH 2 PO 4, 1,05 MgCl 2, 1,3 CaCl 2, 20,0 NaHCO 3, y 11,1 glucosa (pH 7,35 ± 0,05). </li></ol></li><li> Mientras bañado en la misma solución, identificar el pulmón, el timo y el tejido graso. Con cuidado, diseccionar ellos desde el corazón. Utilice curva 3 &quot;tijeras Vannas-Tübingen y 4,3&quot; # 5 pinzas. </li><li> Luego identificar la aorta y canular que en un 21 G cánula a medida. Utilice dos curvas &quot;fuerza # 5B 4.3PD. </li><li> Después de la canulación, perfundir simultáneamente (a través de la cánula a una velocidad de flujo de ~ 5 ml / min, lo que debe ajustarse en base a la presión aórtica, ver más abajo) y superfuse (en el baño a una velocidad de flujo de ~ 50 ml / min) el corazón con una solución de Tyrode calentado y se filtró a través de todo el experimento. Pasar la solución de perfusión a través de un filtro de nylon de 11 micras en línea para evitar la obstrucción de la circulación coronaria. </li><li> El uso de un transductor de presión (o un indicador de presión) conectado a través de una de 3 vías de bloqueo de la llave de paso Luer a la línea de perfusión, monitorizar la presión aórtica y mantenerla entre 60 y 80 mmHg. Ajustar la velocidad de perfusión, si es necesario para mantener la presión aórtica dentro de este rango. </li></ol> 2. Mapeo óptico de la SAN de todo el corazón Langendorff perfundidos <ol><li> Instrumentación <ol><li> Colocar el corazón en posición horizontal y el pin de la punta del ventrículo a la parte inferior revestida de silicio de la cámara usando 0,1 mm de diámetro a pasadores prevenir corriente inducida por el movimiento durante el experimento. 12 </li><li> Introduzca un pequeño ( &quot;x ID 0,005&quot; 0,012) tubo de silicona en el ventrículo izquierdo (VI) a través de la vena pulmonar, la aurícula izquierda (LA) y la válvula mitral (MV). Fijar el tubo mediante una sutura de seda (4-0) en el tejido conectivo de resonancia. </li><li> Coloque el corazón con su cara posterior hacia arriba (Figura 1, panel izquierdo). </li><li> Pin el borde del apéndice RA (RAA) a la parte inferior de silicio de la cámara usando diámetro pasadores minutien 0,1 mm. Ajustar su nivel con el fin de hacer que la superficie posterior de la RA plana y permitir que se encuentra el plano focal de la cámara. Esto permitirá que las mediciones ópticas de la superficie máxima de la aurícula. </li><li> Soga superior (VCS) e inferior (IVC) de la vena cava por una sutura de seda (4-0), estirar y fijar el otro extremo de la sutura a la parte inferior de una cámara revestida de silicio (véase la Figura 3A). Asegúrese de que las suturas no bloqueen elcampo de vista óptico. </li><li> Coloque el electrodo de estimulación a medida en el borde de la RAA. Para hacer electrodos, el uso de silicio recubierto alambres de plata diámetro de 0,25 mm, con 0,5 mm de distancia entre electrodos y carente de silicio para una longitud de 1 mm en el extremo de estimulación. A continuación, coloque dos ECG de 12 mm de aguja (calibre 29) electrodos monopolares cerca de la base de los ventrículos derecho e izquierdo. Coloque el ECG electrodo de tierra cerca del vértice de los ventrículos. </li></ol></li><li> tinción <ol><li> Dado que los dos tintes fluorescentes y blebbistatin desacoplador electromecánico son sensibles a la luz, realice todos los procedimientos descritos a continuación en un cuarto oscuro. En primer lugar preparar colorante sensible al voltaje RH-237 o di-4-ANNEPS como una solución madre, 1,25 mg / ml en sulfóxido de dimetilo (2,5 mM), que alícuota (30 l cada una) y almacenar las alícuotas a -20 ° C. </li><li> Diluir 5-10 l de solución de colorante de valores en 1 ml de solución de Tyrode calentado (37 ° C) y luego inyectarla en la línea de perfusión coronariadurante un período de 5-7 min usando un puerto de inyección en línea Luer. </li><li> Preparar blebbistatin como una solución madre (2 mg / ml en dimetilsulfóxido, 6,8 mM) por adelantado y almacenarlo a 4ºC. </li><li> Después de 20 min de estabilización, añadir 0,5 ml de calentado (37 ° C) blebbistatin en el perfundido y diluir 0,1 ml de blebbistatin en 1 ml de (37 ° C) solución de Tyrode calentado. A continuación, inyectar en la línea de perfusión coronaria durante un periodo de 5-7 min usando un puerto de inyección en línea Luer. </li></ol></li></ol> 3. mapeo óptico de la SAN desde el auricular aislada Preparación <ol><li> Instrumentación <ol><li> Para la preparación atrial aislado, aislar y canular el corazón como se describió anteriormente en los pasos 1.1-1.5 para la preparación de todo el corazón. </li><li> Diseccionar los ventrículos lejos de la cara anterior. Ver Figura 1A, panel derecho, cortar # 1 para más detalles. </li><li> Abra la RA cortando a través de la VA tricúspideLVE (TV) a lo largo del eje de TV-SVC. Ver Figura 1A, panel derecho, cortar # 2 para más detalles. </li><li> Corte la rama medial de la cresta terminal para abrir el RAA. Ver Figura 1A, panel derecho, cortar # 3. </li><li> Abrir la pared libre de la aurícula anterior mediante la realización de un corte de la línea media de la corte anterior # 3 hasta el borde de la esquina inferior derecha de la RAA, aplanar y el pin de la pared libre de la aurícula hasta el fondo de una cámara revestida de silicio. Ver la dirección mostrada por la flecha hueca en la Figura 1A, corte # 4. Preservar un borde de tejido ventricular para fijar la preparación para evitar daños en las aurículas. </li><li> Del mismo modo, abierta LA cortando a través de la MV a lo largo de la esquina MV-superior del apéndice LA (LAA). </li><li> Para abrir la LAA, cortado desde la mitad de la LAA abierto, a través de la pared libre de la aurícula anterior hasta cerca de un borde medio de la LAA. </li><li> Abrir la pared libre de la aurícula alo anteriorendo la misma dirección, y luego aplanar y el pin a la parte inferior de una cámara recubierta con Sylgard. </li><li> Retire parcialmente el tejido del tabique interauricular. Esto reducirá la dispersión de la señal óptica a partir de tejido que no está en el foco. Por lo tanto, tanto el LA y RA, así como la SAN y la unión aurículo-ventricular (AVJ) son accesibles en esta preparación (Figura 1B). </li><li> Levante la preparación final en alrededor de 0,5 mm desde la parte inferior de la cámara de silicio recubierto con el fin de permitir superfusión desde ambas superficies epicárdicos y endocárdicos. </li><li> Superfuse la preparación con calentado (37 ° C) solución de Tyrode a una velocidad constante de 12 ~ ml / min para un flujo de centrado situado cerca de la SVC y ~ 30 ml / min para una superfusión baño. </li><li> Coloque el Ag / AgCl 2 electrodo de medida de estimulación (0,25 mm de diámetro) en el borde de la RAA diseccionado. A continuación, coloque dos ECG de 12 mm de aguja (29G) electrodos (monopolar) cerca de la RAA y LAA, respectivamente. Coloque la planta ECG elegidosmontó cerca de la AVJ. </li></ol></li><li> tinción <ol><li> Realizar una aplicación directa del colorante sensible al voltaje (RH-237 o di-4-ANNEPS). Para esto, diluir 1-2 l de la solución de colorante de valores de 1 mm de solución de Tyrode calentado (37 ° C) y liberar lentamente el colorante diluido en la superficie de la preparación mediante el uso de un 1 mm de la pipeta. </li><li> Alternativamente, lleve a cabo la tinción de la aurícula con el colorante sensible al voltaje a través de una perfusión coronaria del corazón perfundido Langendorff similar a la descrita anteriormente para la preparación de todo el corazón (pasos 2.2.1-2.2.2). <ol><li> Después de la tinción de la perfusión coronaria, aislar la preparación atrial como se describe. Realizar tinción de la superficie adicional cuando sea necesario para alcanzar un nivel de fluorescencia satisfactorio. aislamiento auricular rápido no blanquear el tinte y no afecta a la calidad de la tinción. </li></ol></li><li> Inmovilizar la preparación con el electro-mecánico de desenganche, blebbistatin. Diluir 3-5 l blebbistatin solución madre en la solución de Tyrode calentado (37 ° C) y liberan lentamente el blebbistatin diluida sobre la superficie de la preparación y la solución circundante. Desde blebbistatin ha demostrado ser sensible a la luz, de 13,14 a evitar una larga exposición a la luz durante la preparación y tinción. </li><li> Realizar la aplicación blebbistatin adicional tanto como sea necesario para suprimir la contracción. Normalmente hasta 3 aplicaciones adicionales (3-5 l por cada aplicación) se puede utilizar para suprimir el artefacto de movimiento suficientemente con el fin de reconstruir con precisión SAN y activación auricular. </li><li> Añadir 0,5 ml adicionales de blebbistatin calentado en el perfundido. Durante este procedimiento, una pausa en la superfusión durante 30 segundos para permitir que el tinte / blebbistatin para teñir el tejido auricular. </li></ol></li></ol> 4. Mapeo óptico configurar NOTA:. Una descripción detallada del sistema de mapeo óptico se proporciona en otra parte 12 <ol><li> Utilizar una cámara con una temresolución poral de 2.000 cuadros / seg o superior, y una serie de lentes de condensador para llegar a una resolución espacial de 100 m / pixel o superior. Esto es necesario para reconstruir la activación y propagación SAN intranodal. </li><li> Para reducir los artefactos de movimiento de la solución de vibración, fijar un pequeño vidrio de cubierta en la superficie de la solución sobre el corazón / aislados preparación auricular. </li><li> Utilice una luz de excitación (520 ± 45 nm de longitud de onda) proporcionado por una corriente constante, lámpara halógena de bajo ruido. Dirigir el haz de luz que se filtra en la preparación mediante el uso de una guía de luz bifurcada flexible. </li><li> Se filtra la fluorescencia emitida por un filtro de paso largo (&gt; 715 nm). Recoger, digitalizar y guardar la señal fluorescente adquirida en un software de ordenador utilizando proporcionada por el fabricante de la cámara. </li></ol> 5. Procesamiento de Datos Nota: Los datos de mapeo óptico se recoge y se almacena como una serie de matrices de intensidad de fluorescencia en diferentes puntos temporales. Cada píxel represeNTS una medida de la intensidad de fluorescencia recogida de una ubicación específica en la preparación del tejido en un punto de tiempo específico. La fluorescencia de fondo se elimina automáticamente por píxel para permitir una mejor visualización de los cambios de fluorescencia producidos por cambios de voltaje de membrana y de arriba abajo para que se corresponda con los potenciales de acción (AP) medidos por los sistemas de microelectrodos. Los detalles de los diferentes pasos en el procesamiento de datos de imágenes ópticas, incluyendo la segmentación de imágenes, filtrado espacial, filtrado temporal, y la eliminación deriva de referencia, se proporcionan en la revisión enfocada. 15 <ol><li> Manualmente o mediante el algoritmo especial (por ejemplo, un umbral o el borde de detección) 15 para determinar los límites del tejido, crear una máscara binaria de 1 (píxeles incluidas) y 0 (píxeles excluidos) y aplicar la máscara para cada trama de la secuencia. Este proceso crea una imagen binaria que pone de relieve las áreas de interés para su posterior procesamiento. </li><li> Para mejorar la relación señal-ruido de la opciónlos datos de iCal, filtran las señales dentro de las áreas de interés seleccionadas. Para ello, utilice espacial (es decir, un promedio de píxeles fluorescentes vecinos según la definición de un contenedor de convolución deseado o kernel, por ejemplo 3 x 3 o, para los datos ruidosos, 5 x 5) y / o filtrado temporal (por ejemplo, Butterworth, tipo Chebyshev 1, Chebyshev tipo 2, elíptica etc.) (Figura 2). Tenga en cuenta la posibilidad de artefactos inducidos filtrados-hora de interpretar los datos. Para más detalles, véase la revisión. 15 </li><li> Retire la deriva de la línea de base en las grabaciones ópticas cuando sea necesario (mediante el uso de filtración de paso alto o ajuste polinómico a la señal original) y luego normalizar cada señal de píxel desde 0 (fluorescencia mínimo) a 1 (fluorescencia máxima). </li><li> Seleccionar una ventana de tiempo que abarca los tiempos de activación de todos los píxeles para una única propagación AP. Asignar a cada pixel de su tiempo de activación como el tiempo de derivado de máxima carrera ascendente (dF / dt max, donde F es fluorescenintensidad ce). El uso de todos los tiempos de activación de píxeles, reconstruir el mapa de activación isócrono. Cada isócrona será por lo tanto mostrar los píxeles activados al mismo tiempo. </li><li> Para reconstruir el mapa de distribución de la duración del PA (APD), para cada pixel calcular la duración entre el tiempo de activación y el tiempo en un nivel específico de la repolarización (por ejemplo, al 80% de la repolarización, APD 80). El uso de todos los valores de píxel de APD, reconstruir la distribución Mapa isócrono APD. Cada isócrona será por lo tanto mostrar los píxeles con la misma APD. </li><li> Para el cálculo de la velocidad de conducción para la propagación AP, adaptarse a una superficie de la preparación de los datos de tiempo de activación calculados en 5.4. Para ello, utilice polinomio superficie de ajuste o local suavizado superficie del núcleo y luego calcular los vectores de velocidad de conducción locales a partir del gradiente de la superficie ajustada. </li><li> Para crear el mapa de la repolarización, asignar a cada pixel de su tiempo de repolarización, definida como la segunda derivada máxima (D 2 F / dt2) de la señal óptica en el extremo de la OAP, o el tiempo de 90% de repolarización. </li></ol>

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<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+sinoatrial+node+function+and+intra-atrial+conduction+in+murine+gain-of-function+Scn5a%2B%2FDeltaKPQ+hearts+suggest+an+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).</li>
</ol>

No se declaran conflictos de intereses.

A continuación, presentamos dos tipos de preparaciones de ratón SAN: 1) SAN intacto en el corazón entero perfundido Langendorff, y 2) en el SAN aislado, abrimos la preparación de la aurícula. Estos dos tipos de preparación sirven para diferentes propósitos experimentales. En la preparación todo el corazón perfundido Langendorff, la estructura de la aurícula intacto se conserva lo que hace posible el estudio de arritmias complejas auriculares como la fibrilación auricular, así como las interacciones entre el SAN y el atr...

Los nuevos avances científicos que conducen a saltos en la comprensión de la fisiología humana suelen ir precedidos de avances tecnológicos. El mapeo óptico fluorescente, por ejemplo, permite la investigación de múltiples parámetros fisiológicos tanto en células como en tejidos. 1,2 Mejoró significativamente nuestra comprensión de cómo la estructura anatómica se asocia con las funciones y disfunciones electrofisiológicas. En el corazón, el marcapasos natural y los sistemas de conducción, como el nódulo sinoauricular (SAN) y la unión auriculoventricular, están formados por miocitos ganglionares que están aislados por los miocitos auriculares circundantes. 3-5 Dicha organización crea estructuras tridimensionales complejas con propiedades eléctricas especializadas. Se ha reconocido que tanto la remodelación estructural como funcional de estas estructuras de marcapasos forman heterogeneidades electrofisiológicas significativas. 6,7 Comprender el mecanismo que subyace a la forma en que tales heterogeneidades dan lugar a disfunciones de SAN y arritmogénesis auricular beneficiará enormemente el tratamiento clínico de estas enfermedades. Requiere una técnica para visualizar la propagación de señales eléctricas a nivel tisular, como el mapeo óptico. 
Recientemente, la evidencia acumulada ha demostrado el avance del mapeo óptico en estudios de electrofisiología y patología auricular. 2 Sin embargo, los estudios novedosos y rigurosos dependen de la interpretación precisa de los datos experimentales, cuya validez y estabilidad dependen de protocolos de experimentación cuidadosos. Los ratones modificados genéticamente se utilizan ampliamente para la investigación como modelos animales de enfermedades humanas, como el síndrome del seno enfermo, las anomalías del marcapasos y las arritmias auriculares. 6,8-11 Por lo tanto, una combinación de mapeo óptico fluorescente con modelos de ratones transgénicos proporciona una poderosa herramienta para estudiar las anomalías eléctricas cardíacas asociadas con diversas patologías. En este artículo, presentamos un protocolo para el mapeo óptico de alta resolución de la SAN y el atrio del ratón. Específicamente, discutimos y comparamos diferentes enfoques de carga de tinte, efectos del tiempo en el blanqueo del tinte y la estabilidad de la frecuencia cardíaca durante el experimento.

<table><tbody><tr><td>camisa de agua</td><td>Radnoti</td><td>1660 series Baño de tejidos para procedimientos</td><td></td>de aislamiento de órganos grandes o células individuales</tr> baño <tr><td>de agua / circulador</td><td>Fisher Scientific</td><td>1016S amplificador de</td><td></td></tr><tr><td>presión</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Filtros de red de nailon Millipore</td><td></td><td></td> Transductor de presión NY1102500 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific AD Instrumentos</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>Acero inoxidable Pines Minutien - 0,1 mm de diámetro</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>bomba de perfusión</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4LS Bomba de</td><td></td></tr><tr><td>superfusión</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tijeras de tubinga&nbsp;</td>Pinzas de World <td>Precision Instruments</td><td>503379</td><td></td></tr><tr><td>Dumont</td><td>501201 de World Precision Instruments</td><td>500085</td><td></td></tr><tr><td>tijeras Mayo World</td><td>Precision Instruments</td><td>501750</td><td></td></tr><tr><td>pinzas hemostáticas Kelly</td><td></td><td></td> Pinzas de 501241 <td></td></tr><tr><td>de World</td> Precision <td>Instruments World Precision Instruments</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Iris tijeras,</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>ECG, aguja de 12 mm (calibre 29), electrodos (monopolares);</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>puerto de inyección Luer en línea</td> Cámara CMOS <td>Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L&nbsp;</td><td>SciMedia</td><td>MiCAM-05&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>lámpara halógena</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetilo (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

-alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular ratón

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Las disfunciones del nódulo sinoauricular (SAN) y las complicaciones asociadas constituyen causas importantes de morbilidad en pacientes con enfermedades cardíacas. El desarrollo de nuevas terapias farmacológicas para curar a estos pacientes se basa en la comprensión profunda de la fisiología normal y la fisiopatología de la RAS. Entre los estudios de marcapasos cardíacos, la RAS de ratón es ampliamente utilizada debido a su factibilidad para modificaciones en la expresión de diferentes genes que codifican canales iónicos SAN o proteínas de manejo de calcio. La evidencia emergente de estudios electrofisiológicos e histológicos también ha demostrado la representatividad y similitud de la estructura y las funciones de la SAN del ratón con los mamíferos más grandes, incluida la presencia de vías de conducción especializadas desde la SAN hasta la aurícula y una compleja jerarquía de marcapasos dentro de la SAN. Recientemente, la técnica de mapeo óptico ha facilitado en gran medida la exploración e investigación del origen de la excitación y la conducción dentro y desde la RAN de ratón, lo que a su vez ha ampliado la comprensión de la RAS y ha beneficiado los tratamientos clínicos de las enfermedades asociadas a la disfunción de la RAS. En este manuscrito, hemos descrito en detalle cómo realizar el mapeo óptico de la SAN de ratón a partir del corazón intacto, perfundido por Langendorff, y de la preparación auricular aislada. Este protocolo es una herramienta útil para mejorar la comprensión de la fisiología y la fisiopatología de la RAS en ratones.

Mapeo óptico de la avería SAN desde el corazón Langendorff perfundidos Un ejemplo típico de un mapa de contornos activación de la AD reconstruida por el ritmo sinusal espontánea se muestra en la Figura 3 para un corazón de ratón Langendorff perfundidos. El punto de activación temprana se encuentra dentro de la región intercaval cerca del SVC en la red SAN se define anatómicamente. 3,16 Dos RA mapas de contorno de activación adquirido en...

A continuación, se presenta un protocolo para el mapeo óptico de la actividad eléctrica de la aurícula derecha del ratón y, especialmente, el nodo sinoauricular, con una resolución espacial y temporal alta.

-Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

El objetivo general de este protocolo experimental es realizar un mapeo óptico del nódulo sinoauricular del ratón en un corazón intacto perfundido mediante el método de Langendorff o en una preparación auricular aislada. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la electrofisiología y fisiopatología del nódulo sinoauricular sobre los mecanismos de las anomalías del marcapasos, el síndrome del seno enfermo y diversas enfermedades asociadas a arritmias auriculares. La principal ventaja de esta técnica es que permite investigar múltiples parámetros en tejidos intactos con una resolución espacial y temporal muy alta.Después de confirmar el nivel adecuado de anestesia mediante la compresión del dedo del pie, utilice tijeras curvas Mayo de 5,5 pulgadas y pinzas hemostáticas Kelly de 5,5 pulgadas para realizar una incisión de un centímetro en la parte frontal del tórax. Usando pinzas iris curvas de cuatro pulgadas, agarre rápidamente el tejido pulmonar y utilice tijeras iris de una pulgada y tres cuartos para extirpar juntos el pulmón, el timo y el corazón, junto con el pericardio. Lave los tejidos en solución de Tyrode modificada oxigenada a 37 grados Celsius.Luego, utilice tijeras curvas Vannas Tubingen de tres pulgadas y pinzas número cinco de cuatro tercios de pulgada para extraer el pulmón, el timo y el tejido adiposo del corazón. A continuación, use una cánula personalizada de calibre 21 y dos pinzas curvas B número cinco de 4,3 pulgadas para canular la aorta y perfundir simultáneamente y superperfundir el corazón con solución de Tyrode a 37 grados Celsius, dirigiendo la solución a través de un filtro de nailon de 11 micrones en línea antes de la perfusión para evitar la obstrucción de la circulación coronaria. Luego, conecte un transductor de presión a un bloqueo Luer en la línea de perfusión mediante una llave de tres vías para monitorear la presión aórtica, ajustando la velocidad de perfusión según sea necesario para mantener la presión aórtica entre 60 y 80 milímetros de mercurio.Para la cartografía óptica del nódulo sinoauricular en un corazón perfundido mediante el método de Langendorff, coloque el órgano en orientación horizontal con la cara posterior hacia arriba en una cámara de baño para tejidos de vidrio y utilice alfileres de 0,1 milímetros de diámetro para fijar el ápice ventricular al fondo recubierto de silicona de la cámara, con el fin de evitar movimientos inducidos por el flujo durante el experimento. Inserte un pequeño tubo de silicona en el ventrículo izquierdo a través de la vena pulmonar, la aurícula izquierda y la válvula mitral, y use un hilo de seda 40 para fijar el tubo al tejido conectivo circundante. A continuación, use otro hilo de seda 40 para rodear las venas cavas superior e inferior y clave el borde de la orejuela auricular derecha al fondo de la cámara.Estire y sujete con alfileres el otro extremo de la sutura en la parte inferior de la cámara y coloque un electrodo de estimulación personalizado en el borde del apéndice auricular derecho. Luego, coloque dos electrodos monopolar de electrocardiograma de 12 milímetros en forma de aguja cerca de la base de los ventrículos derecho e izquierdo, y coloque el electrodo de tierra del electrocardiograma cerca del ápice del ventrículo. Para teñir el tejido, inyecte el colorante diluido en un puerto de perfusión en línea de la línea de perfusión coronaria para su administración durante un período de cinco a siete minutos.Después de 20 minutos de estabilización, añada 0,5 mililitros de blebbistatina a 37 grados Celsius al perfusato, seguido de la inyección de 0,1 mililitros de blebbistatina diluida en 1 mililitro de solución de Tyrode a 37 grados Celsius en la línea de perfusión coronaria durante otros cinco a siete minutos, utilizando un puerto de inyección en línea con bloqueo Luer. La blebbistatina debe usarse con precaución. Para evitar la precipitación del inhibidor, primero disuelva la blebbistatina en un medio que se haya calentado hasta alcanzar una temperatura clara de 37 grados y agite vigorosamente la mezcla.Para mapear ópticamente la muestra, primero fije un pequeño vidrio cubierto sobre la superficie de la solución por encima del tejido para reducir cualquier artefacto de movimiento causado por la vibración de la solución. Luego, utilizando una guía de luz bifurcada flexible con una luz de excitación proporcionada por una lámpara de halógeno de corriente constante y bajo ruido, dirija el haz de luz filtrado hacia el tejido e imagine la señal fluorescente resultante. Después de canular el corazón tal como se acaba de demostrar, disecque los ventrículos desde el lado anterior y abra la aurícula derecha a través de la válvula tricúspide a lo largo del eje de la válvula tricúspide-vena cava superior, seguido de una incisión a través del brazo medial de la cresta terminal.Para abrir la pared libre anterior de la aurícula, realice una incisión desde la línea media del corte del brazo medial hasta el borde de la esquina inferior derecha de la orejuela auricular derecha y sujete con alfileres la pared libre auricular aplanada en la parte inferior de una cámara recubierta de silicona. Para abrir la orejuela auricular izquierda, corte a través de la válvula mitral siguiendo la esquina superior de la válvula mitral de la orejuela auricular izquierda. Luego sujete con alfileres la aurícula izquierda abierta tal como se realizó previamente con la aurícula derecha.Luego, retire parcialmente el tejido ventricular. Preserve un borde de tejido ventricular para fijar la preparación y evitar daños en las aurículas, y sujete el tejido al fondo de una cámara recubierta con Sylgard. Ahora levante la preparación final aproximadamente 0,5 milímetros desde el fondo de la cámara recubierta con silicona para permitir la superfusión desde las superficies epicárdica y endocárdica, y superefunda la muestra con solución de Tyrode a 37 grados Celsius.Luego, coloque un electrodo personalizado de cloruro de plata para estimulación en el borde del apéndice auricular derecho disecado. Coloque un electrodo aguja monopolar de electrocardiograma de 12 milímetros cerca de cada uno de los apéndices auriculares derecho e izquierdo, y coloque el electrodo de tierra del electrocardiograma cerca de la unión aurículo-ventricular. Para teñir el tejido cardíaco, use una pipeta de 1 milímetro para liberar lentamente el colorante sensible al voltaje diluido en solución de Tyrode a 37 grados Celsius directamente sobre el tejido.Luego, inmovilice la muestra mediante la aplicación directa de blebbistatina diluida sobre el tejido, seguida de la administración de otros 0,5 mililitros de blebbistatina a través del perfusato, y realice el mapeo óptico de la muestra tal como se acaba de demostrar. Los pasos de tinción del tejido y de inhibición con blebbistatina son críticos y requieren una implementación precisa y un procedimiento de tinción exacto para que no se vean afectados los parámetros fisiológicos auriculares, incluyendo la frecuencia cardíaca, la ubicación del marcapasos principal y la conducción auricular. Aquí se muestra un mapa típico de contorno de activación de la aurícula derecha reconstruido para un ritmo sinusal espontáneo en un corazón de ratón perfundido mediante técnica de Langendorff, junto con dos mapas de contorno correspondientes de la aurícula derecha obtenidos con tasas de muestreo de 1 y 0,5 milisegundos.El punto de activación temprana se encuentra dentro de la región intercaval cerca de la vena cava superior, donde se define anatómicamente el nódulo sinusal. En este experimento, tras la estimulación del apéndice auricular derecho durante al menos un minuto a una frecuencia de 10 a 12 hercios, se interrumpió la estimulación eléctrica y se calculó el tiempo de recuperación del nódulo sinusal como el intervalo de tiempo entre el último potencial de acción captado y el primer potencial de acción espontáneo. La activación del preparado auricular aislado durante el ritmo sinusal espontáneo permite identificar con precisión la zona exacta de la ubicación del marcapasos principal.Si los procedimientos quirúrgicos y de carga del colorante se siguen adecuadamente, no se deberían observar cambios significativos en las características fisiológicas del atrio. Aunque la tinción arterial puede requerir una mayor cantidad de colorante, la señal fluorescente en el tejido del área del nódulo sinoauricular parece ser más estable mediante este método de carga, con un tiempo de decaimiento de la intensidad de la señal tras la tinción coronaria casi el doble de largo que tras la tinción superficial. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en 30, 40 minutos si se realiza correctamente.Al realizar este procedimiento, tenga cuidado en localizar la anatomía auricular antes de hacer un corte para evitar dañar el tejido auricular y el nódulo sinusal. Después de este procedimiento, se pueden realizar otras mediciones, como grabaciones convencionales con electrodos mitrales de vidrio, para responder preguntas adicionales sobre las características del potencial transmembranal conmutativo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología intelectual exploraran arritmias auriculares, incluyendo la disfunción del nódulo sinoauricular en el corazón.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un mapeo óptico de alta resolución de una preparación del nódulo sinusal de ratón.

high-resolution-optical-mapping-of-the-mouse-sino-atrial-node

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

En este artículo se describe una técnica de alta resolución temporal y espacial de la imagen ópticamente movimiento de acción potencial en la superficie de los corazones de rata Langendorff perfundidos con un tinte potenciométrica (di-8-ANEPPS).

Mapeo óptico de corazones de ratas Langendorff perfundidos

Este informe proporciona una descripción detallada de la metodología y los resultados del mapeo simultáneo óptico endocárdico y epicárdico de excitación eléctrica de la aurícula izquierda intacta de un corazón de oveja Langendorff perfundidos durante el estiramiento inducido por fibrilación auricular.

Cartografía de alta resolución óptica endocárdicos y epicárdicos en un modelo de ovejas inducidas por el estiramiento de la fibrilación auricular

En este artículo se describen los procedimientos básicos para la realización de experimentos ópticos de asignación en el corazón de conejo Langendorff perfundidos con el sistema de imágenes panorámicas, y el doble (voltaje y calcio) modalidad de imagen.

Multiparamétrico óptico Cartografía del corazón de conejo Langendorff perfundidos

Este documento detalla el procedimiento de disección, la configuración instrumental y las condiciones experimentales durante el mapeo óptico del potencial de membrana (Vm) y el calcio intracelular transitoria (CAT) en Langendorff perfundidos aislados intactos los corazones de ratón.

Mapeo óptico de potenciales de acción y transitorios de calcio en el corazón de ratón

Este video muestra el procedimiento para aislar el nodo sinoauricular o SAN del corazón del ratón. La SAN alberga las células sinoauriculares que inician los latidos del corazón mediante la generación de potenciales de acción espontáneos.

Aislamiento de nodo sinoauricular a partir de un modelo de ratón: un procedimiento para recolectar un nodo SA del corazón murino

Este protocolo describe la evaluación electrofisiológica de atria murino utilizando un sistema de mapeo óptico con una alta resolución espacial y temporal, incluyendo grabaciones duales de la tensión de la membrana y Ca2 + transitoria bajo programado estimulación a través de un catéter electrodo especializados.

Evaluación electrofisiológica de Atria murino con mapeo óptico alta resolución

Proporcionamos un protocolo paso a paso para la tinción de inmunofluorescencia de montaje completo del nódulo sinoauricular (SAN) y el nódulo auriculoventricular (AVN) en corazones murinos.

Tinción de inmunofluorescencia de montaje completo, imágenes confocales y reconstrucción 3D del nódulo sinoauricular y auriculoventricular en el ratón

Este protocolo tiene como objetivo describir una nueva metodología para medir la velocidad de disparo cardíaco intrínseca utilizando el registro de la matriz de microelectrodos de todo el tejido del ganglio sinoauricular para identificar defectos de marcapasos en ratones. Los agentes farmacológicos también se pueden introducir en este método para estudiar sus efectos sobre el marcapasos intrínseco.

Registro de la matriz de microelectrodos de la tasa de disparo del nódulo sinoauricular para identificar defectos intrínsecos de marcapasos cardíacos en ratones

Presentamos un método para la reconstrucción mesoscópica de todo el corazón del ratón mediante la combinación de nuevos avances en la transformación de tejidos y la tinción con el desarrollo de un microscopio de hoja de luz escaneado axialmente.

Imágenes ópticas mesoscópicas del corazón de todo el ratón

El protocolo utiliza microscopía avanzada de lámina de luz junto con métodos de limpieza de tejidos adaptados para investigar estructuras cardíacas intrincadas en corazones de roedores, con un gran potencial para la comprensión de la morfogénesis y la remodelación cardíaca.

Imágenes con lámina de luz para revelar la estructura cardíaca en corazones de roedores

Aprende mapeo óptico de alta resolución del nodo sinoauricular en corazón de ratón perfundido con Langendorff. Este método permite estudiar arritmias auriculares y anomalías del marcapasos con gran precisión espacial.

-Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón

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