-Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón

El objetivo general de este protocolo experimental es realizar un mapeo óptico del nódulo sinoauricular del ratón a partir de un corazón intacto perfundido por Langendorff o una preparación auricular aislada. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la electrofisiología y la fisiopatología del nódulo sinoauricular sobre los mecanismos de las anomalías del marcapasos, el síndrome del seno enfermo y varias enfermedades asociadas con las arritmias auriculares. La principal ventaja de esta técnica es que permite la investigación de múltiples parámetros en los tejidos intactos con una resolución espacial y atemporal muy alta.

Después de confirmar el nivel apropiado de anestesia mediante un pellizco en el dedo del pie, use unas tijeras Mayo curvas de 5.5 pulgadas y pinzas hemostáticas Kelly de 5.5 pulgadas para hacer una incisión de un centímetro en la parte delantera del tórax. Con pinzas de iris curvadas de cuatro pulgadas, agarre rápidamente el tejido pulmonar y use tijeras de iris de cuatro tercios de pulgada para cortar el pulmón, el timo y el corazón juntos, junto con el pericardio. Lavar los tejidos en una solución oxigenada de Tyrode modificada a 37 grados centígrados.

Luego use tijeras curvas Vannas Tubingen de tres pulgadas y pinzas número cinco de cuatro tercios de pulgada para extraer el pulmón, el timo y el tejido graso del corazón. A continuación, utilice una cánula de calibre 21 hecha a medida y dos pinzas curvas de 4,3 pulgadas número cinco B para canular la aorta y, al mismo tiempo, perfundir y superfusionar el corazón con una solución Tyrode de 37 grados Celsius dirigiendo la solución a través de un filtro de nailon en línea de 11 micras antes de la perfusión para evitar la obstrucción de la circulación coronaria. A continuación, conecte un transductor de presión a una cerradura Luer en la línea de perfusión a través de una llave de paso de tres vías para controlar la presión aórtica, ajustando la velocidad de perfusión para mantener la presión aórtica entre 60 y 80 milímetros de mercurio, según sea necesario.

Para el mapeo óptico del nódulo sinoauricular de un corazón perfundido por Langendorff, coloque el órgano en una orientación horizontal con el lado posterior hacia arriba en una cámara de baño de órganos de tejido de vidrio y use alfileres de 0,1 milímetros de diámetro para fijar el ápice ventricular al fondo de la cámara recubierto de silicona para evitar el movimiento inducido por la corriente durante el experimento. Inserte un pequeño tubo de silicona en el ventrículo izquierdo a través de la vena pulmonar, las aurículas izquierdas y la válvula mitral y use una sutura de seda 40 para fijar el tubo al tejido conectivo circundante. A continuación, utilice otras 40 suturas de seda para sujetar la vena cava superior e inferior y sujete el borde del apéndice auricular derecho al fondo de la cámara.

Estire y fije el otro extremo de la sutura al fondo de la cámara y coloque un electrodo de estimulación hecho a medida en el borde de la orejuela auricular derecha. A continuación, coloque dos electrodos monopolares de aguja de 12 milímetros de electrocardiograma cerca de la base de los ventrículos derecho e izquierdo y coloque el electrodo de electrocardiograma de tierra cerca del vértice del ventrículo. Para teñir el tejido, inyecte el tinte diluido en un puerto de perfusión en línea de la línea de perfusión coronaria para administrarlo durante un período de cinco a siete minutos.

Después de 20 minutos de estabilización, agregue 0,5 mililitros de blebbistatina a 37 grados Celsius en la perfusión, seguido de la inyección de 0,1 mililitros de blebbistatina diluida en 1 mililitro de solución Tyrode a 37 grados Celsius en la línea de perfusión coronaria durante otros cinco a siete minutos usando un puerto de inyección Luer lock en línea. La blebbistatina debe usarse con precaución. Para evitar la precipitación del inhibidor, primero disuelva la blebbistatina en un medio que se haya calentado a 37 grados y revuelva vigorosamente la mezcla.

Para mapear ópticamente la muestra, primero fije un pequeño vidrio cubierto en la superficie de la solución sobre el tejido para reducir cualquier artefacto de movimiento de la solución vibratoria. Luego, usando una guía de luz bifurcada flexible con una luz de excitación proporcionada por una lámpara halógena de corriente constante y bajo ruido, dirija el haz de luz filtrado sobre el tejido y obtenga una imagen de la señal fluorescente resultante. Después de canular el corazón como se acaba de demostrar, diseccionar los ventrículos lejos de la cara anterior y abrir la aurícula derecha a través de la válvula tricúspide a lo largo del eje de la vena cava superior de la válvula tricúspide, seguido de una incisión a través de la extremidad medial de la crista terminalis.

Para abrir la pared libre de la aurícula anterior, haga una incisión desde la línea media de la incisión de la extremidad medial hasta el borde de la esquina inferior derecha del apéndice auricular derecho y fije la pared libre de la aurícula aplanada en el fondo de una cámara recubierta de silicona. Para abrir la orejuela auricular izquierda, corte a través de la válvula mitral a lo largo de la esquina superior de la válvula mitral de la orejuela auricular izquierda. A continuación, sujete con alfileres la aurícula izquierda abierta como se hizo anteriormente para la aurícula derecha.

A continuación, extirpar parcialmente el tejido ventricular. Conserve un borde de tejido ventricular para sujetar la preparación con alfileres y evitar daños en las aurículas y sujetar el tejido al fondo de una cámara recubierta de Sylgard. A continuación, levante la preparación final unos 0,5 milímetros desde el fondo de la cámara recubierta de silicona para permitir la superfusión de las superficies epicárdica y endocárdica y superfusione la muestra con una solución de Tyrode a 37 grados centígrados.

A continuación, coloque un electrodo de cloruro de plata de estimulación hecho a medida en el borde del apéndice auricular derecho disecado. Coloque un electrodo monopolar de aguja de 12 milímetros para electrocardiograma cerca de cada uno de los apéndices auriculares derecho e izquierdo, y coloque el electrodo de electrocardiograma de tierra cerca de la unión ventricular auricular. Para teñir el tejido cardíaco, use una pipeta de 1 milímetro para liberar lentamente el tinte sensible al voltaje diluido en una solución Tyrode a 37 grados Celsius directamente sobre el tejido.

A continuación, inmovilizar la muestra con la aplicación directa de blebbistatina diluida sobre el tejido, seguida de la administración de otros 0,5 mililitros de blebbistatina a través de la perfusión y mapear ópticamente la muestra como se acaba de demostrar. Los pasos de tinción tisular e inhibición de la blebbistatina son críticos, ya que requieren una implementación precisa y un procedimiento de tinción preciso para que los parámetros fisiológicos auriculares, incluida la frecuencia cardíaca, la asignación del marcapasos principal y la conducción auricular, no se vean afectados. Aquí se muestra un mapa de contorno de activación de la aurícula derecha típico reconstruido para el ritmo sinusal espontáneo de un corazón de ratón perfundido por Langendorff con dos mapas de contorno de la aurícula derecha correspondientes adquiridos a frecuencias de muestreo de 1 y 0,5 milisegundos.

El punto de activación temprana se encuentra dentro de la región intercava, cerca de la vena cava superior, donde se define anatómicamente el nódulo sinoauricular. En este experimento, después de un espaciamiento del apéndice auricular derecho durante al menos un minuto a 10 a 12 hercios, se detuvo la estimulación eléctrica y se calculó el tiempo de recuperación del nódulo sinoauricular como el intervalo de tiempo entre el último potencial de acción capturado y el primer potencial de acción espontánea. La activación de la preparación auricular aislada durante el ritmo sinusal espontáneo permite identificar el área precisa de la ubicación del marcapasos principal.

Si la cirugía y los procedimientos de carga de tinte se siguen adecuadamente, no se deben observar cambios significativos en las características fisiológicas de la aurícula. Aunque la tinción arterial puede requerir una mayor cantidad de colorante, la señal fluorescente en el tejido del área del nódulo sinoauricular parece ser más estable mediante este método de carga, con un tiempo de decaimiento de la intensidad de la señal después de la tinción coronaria casi el doble que después de la tinción superficial. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en 30 o 40 minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, tenga cuidado de ubicar la anatomía auricular antes de hacer un corte para evitar dañar el tejido auricular y el nódulo sinusal. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras medidas, como los registros convencionales de electrodos mitrales de vidrio, para responder preguntas adicionales sobre las características del potencial transmembrana conmutativo. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología del intelecto exploraran las arritmias auriculares, incluida la disfunción del nódulo sinoauricular en el corazón.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar un mapeo óptico de alta resolución de la preparación del nódulo sinusal de un ratón.