-Alta resolución de mapeo óptico del nodo sinoauricular Ratón

El objetivo general de este protocolo experimental es realizar un mapeo óptico del nódulo sinoauricular del ratón en un corazón intacto perfundido mediante el método de Langendorff o en una preparación auricular aislada. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la electrofisiología y fisiopatología del nódulo sinoauricular sobre los mecanismos de las anomalías del marcapasos, el síndrome del seno enfermo y diversas enfermedades asociadas a arritmias auriculares. La principal ventaja de esta técnica es que permite investigar múltiples parámetros en tejidos intactos con una resolución espacial y temporal muy alta.

Después de confirmar el nivel adecuado de anestesia mediante la compresión del dedo del pie, utilice tijeras curvas Mayo de 5,5 pulgadas y pinzas hemostáticas Kelly de 5,5 pulgadas para realizar una incisión de un centímetro en la parte frontal del tórax. Usando pinzas iris curvas de cuatro pulgadas, agarre rápidamente el tejido pulmonar y utilice tijeras iris de una pulgada y tres cuartos para extirpar juntos el pulmón, el timo y el corazón, junto con el pericardio. Lave los tejidos en solución de Tyrode modificada oxigenada a 37 grados Celsius.

Luego, utilice tijeras curvas Vannas Tubingen de tres pulgadas y pinzas número cinco de cuatro tercios de pulgada para extraer el pulmón, el timo y el tejido adiposo del corazón. A continuación, use una cánula personalizada de calibre 21 y dos pinzas curvas B número cinco de 4,3 pulgadas para canular la aorta y perfundir simultáneamente y superperfundir el corazón con solución de Tyrode a 37 grados Celsius, dirigiendo la solución a través de un filtro de nailon de 11 micrones en línea antes de la perfusión para evitar la obstrucción de la circulación coronaria. Luego, conecte un transductor de presión a un bloqueo Luer en la línea de perfusión mediante una llave de tres vías para monitorear la presión aórtica, ajustando la velocidad de perfusión según sea necesario para mantener la presión aórtica entre 60 y 80 milímetros de mercurio.

Para la cartografía óptica del nódulo sinoauricular en un corazón perfundido mediante el método de Langendorff, coloque el órgano en orientación horizontal con la cara posterior hacia arriba en una cámara de baño para tejidos de vidrio y utilice alfileres de 0,1 milímetros de diámetro para fijar el ápice ventricular al fondo recubierto de silicona de la cámara, con el fin de evitar movimientos inducidos por el flujo durante el experimento. Inserte un pequeño tubo de silicona en el ventrículo izquierdo a través de la vena pulmonar, la aurícula izquierda y la válvula mitral, y use un hilo de seda 40 para fijar el tubo al tejido conectivo circundante. A continuación, use otro hilo de seda 40 para rodear las venas cavas superior e inferior y clave el borde de la orejuela auricular derecha al fondo de la cámara.

Estire y sujete con alfileres el otro extremo de la sutura en la parte inferior de la cámara y coloque un electrodo de estimulación personalizado en el borde del apéndice auricular derecho. Luego, coloque dos electrodos monopolar de electrocardiograma de 12 milímetros en forma de aguja cerca de la base de los ventrículos derecho e izquierdo, y coloque el electrodo de tierra del electrocardiograma cerca del ápice del ventrículo. Para teñir el tejido, inyecte el colorante diluido en un puerto de perfusión en línea de la línea de perfusión coronaria para su administración durante un período de cinco a siete minutos.

Después de 20 minutos de estabilización, añada 0,5 mililitros de blebbistatina a 37 grados Celsius al perfusato, seguido de la inyección de 0,1 mililitros de blebbistatina diluida en 1 mililitro de solución de Tyrode a 37 grados Celsius en la línea de perfusión coronaria durante otros cinco a siete minutos, utilizando un puerto de inyección en línea con bloqueo Luer. La blebbistatina debe usarse con precaución. Para evitar la precipitación del inhibidor, primero disuelva la blebbistatina en un medio que se haya calentado hasta alcanzar una temperatura clara de 37 grados y agite vigorosamente la mezcla.

Para mapear ópticamente la muestra, primero fije un pequeño vidrio cubierto sobre la superficie de la solución por encima del tejido para reducir cualquier artefacto de movimiento causado por la vibración de la solución. Luego, utilizando una guía de luz bifurcada flexible con una luz de excitación proporcionada por una lámpara de halógeno de corriente constante y bajo ruido, dirija el haz de luz filtrado hacia el tejido e imagine la señal fluorescente resultante. Después de canular el corazón tal como se acaba de demostrar, disecque los ventrículos desde el lado anterior y abra la aurícula derecha a través de la válvula tricúspide a lo largo del eje de la válvula tricúspide-vena cava superior, seguido de una incisión a través del brazo medial de la cresta terminal.

Para abrir la pared libre anterior de la aurícula, realice una incisión desde la línea media del corte del brazo medial hasta el borde de la esquina inferior derecha de la orejuela auricular derecha y sujete con alfileres la pared libre auricular aplanada en la parte inferior de una cámara recubierta de silicona. Para abrir la orejuela auricular izquierda, corte a través de la válvula mitral siguiendo la esquina superior de la válvula mitral de la orejuela auricular izquierda. Luego sujete con alfileres la aurícula izquierda abierta tal como se realizó previamente con la aurícula derecha.

Luego, retire parcialmente el tejido ventricular. Preserve un borde de tejido ventricular para fijar la preparación y evitar daños en las aurículas, y sujete el tejido al fondo de una cámara recubierta con Sylgard. Ahora levante la preparación final aproximadamente 0,5 milímetros desde el fondo de la cámara recubierta con silicona para permitir la superfusión desde las superficies epicárdica y endocárdica, y superefunda la muestra con solución de Tyrode a 37 grados Celsius.

Luego, coloque un electrodo personalizado de cloruro de plata para estimulación en el borde del apéndice auricular derecho disecado. Coloque un electrodo aguja monopolar de electrocardiograma de 12 milímetros cerca de cada uno de los apéndices auriculares derecho e izquierdo, y coloque el electrodo de tierra del electrocardiograma cerca de la unión aurículo-ventricular. Para teñir el tejido cardíaco, use una pipeta de 1 milímetro para liberar lentamente el colorante sensible al voltaje diluido en solución de Tyrode a 37 grados Celsius directamente sobre el tejido.

Luego, inmovilice la muestra mediante la aplicación directa de blebbistatina diluida sobre el tejido, seguida de la administración de otros 0,5 mililitros de blebbistatina a través del perfusato, y realice el mapeo óptico de la muestra tal como se acaba de demostrar. Los pasos de tinción del tejido y de inhibición con blebbistatina son críticos y requieren una implementación precisa y un procedimiento de tinción exacto para que no se vean afectados los parámetros fisiológicos auriculares, incluyendo la frecuencia cardíaca, la ubicación del marcapasos principal y la conducción auricular. Aquí se muestra un mapa típico de contorno de activación de la aurícula derecha reconstruido para un ritmo sinusal espontáneo en un corazón de ratón perfundido mediante técnica de Langendorff, junto con dos mapas de contorno correspondientes de la aurícula derecha obtenidos con tasas de muestreo de 1 y 0,5 milisegundos.

El punto de activación temprana se encuentra dentro de la región intercaval cerca de la vena cava superior, donde se define anatómicamente el nódulo sinusal. En este experimento, tras la estimulación del apéndice auricular derecho durante al menos un minuto a una frecuencia de 10 a 12 hercios, se interrumpió la estimulación eléctrica y se calculó el tiempo de recuperación del nódulo sinusal como el intervalo de tiempo entre el último potencial de acción captado y el primer potencial de acción espontáneo. La activación del preparado auricular aislado durante el ritmo sinusal espontáneo permite identificar con precisión la zona exacta de la ubicación del marcapasos principal.

Si los procedimientos quirúrgicos y de carga del colorante se siguen adecuadamente, no se deberían observar cambios significativos en las características fisiológicas del atrio. Aunque la tinción arterial puede requerir una mayor cantidad de colorante, la señal fluorescente en el tejido del área del nódulo sinoauricular parece ser más estable mediante este método de carga, con un tiempo de decaimiento de la intensidad de la señal tras la tinción coronaria casi el doble de largo que tras la tinción superficial. Una vez dominada, esta técnica puede completarse en 30, 40 minutos si se realiza correctamente.

Al realizar este procedimiento, tenga cuidado en localizar la anatomía auricular antes de hacer un corte para evitar dañar el tejido auricular y el nódulo sinusal. Después de este procedimiento, se pueden realizar otras mediciones, como grabaciones convencionales con electrodos mitrales de vidrio, para responder preguntas adicionales sobre las características del potencial transmembranal conmutativo. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la fisiología intelectual exploraran arritmias auriculares, incluyendo la disfunción del nódulo sinoauricular en el corazón.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar un mapeo óptico de alta resolución de una preparación del nódulo sinusal de ratón.