Caracterización de células madre mesenquimales modificadas genéticamente para aplicaciones neuroterapéuticas

Comience con células madre mesenquimales de ratón transgénicas, células multipotentes derivadas de la médula ósea.

Las células están diseñadas para expresar GFP y factores neurotróficos terapéuticos que apoyan el crecimiento y la supervivencia neuronal.

Lave las células con tampón y fíjelas para preservar la integridad celular.

Lavar nuevamente con tampón, luego agregar una solución para permeabilizar las membranas celulares y nucleares y bloquear los sitios de unión no específicos.

Introducir anticuerpos primarios dirigidos a una proteína marcadora de proliferación celular expresada exclusivamente en el núcleo de las células en división.

Lavar con tampón para eliminar los anticuerpos no unidos.

Agregue anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo dirigidos a los anticuerpos primarios y un colorante de unión al ADN para contrarrestar la tinción de los núcleos.

Lavar con tampón para eliminar los reactivos no unidos.

Cargue la placa en el sistema de cribado de alto contenido y capture imágenes para detectar señales fluorescentes.

La expresión del marcador de proliferación celular indica división celular activa, lo que sugiere la idoneidad de las células transgénicas para aplicaciones neuroterapéuticas.

Para llevar a cabo un ensayo de proliferación celular Ki-67, use tampón de fosfato molar 0.1 para enjuagar los cultivos celulares durante un minuto. Después de repetir el lavado, use paraformaldehído al 4%, o PFA, a temperatura ambiente durante 20 minutos para fijar los cultivos.

Después de la fijación, retire el PFA y use PBS para enjuagar los pocillos tres veces durante siete minutos cada uno. Después de bloquear las células de acuerdo con el protocolo de texto, aplique 100 microlitros de solución de anticuerpos primarios a cada pocillo. Cubra el plato e incube a 4 grados centígrados durante la noche.

Después de lavar las células tres veces durante siete minutos para cada lavado, aplique un anticuerpo secundario, coloque las células en la oscuridad e incube a temperatura ambiente durante 90 minutos. Después de otros tres lavados, cubra la placa y guárdela a 4 grados centígrados hasta obtener imágenes.

Para realizar imágenes automatizadas, cargue la placa inmunomarcada en el sistema HCS y deje que la placa se equilibre durante 20 minutos. Abra el software de adquisición y análisis de imágenes del sistema HCS. Elija la configuración de adquisición para el objetivo 10X usando el binning de la cámara en 1 y la configuración de ganancia de 2.

Utilice la función de exposición automática para encontrar el plano Z en el que residen las celdas y calcule el desplazamiento para cada longitud de onda de interés. Para el análisis que se muestra aquí, capture imágenes para DAPI, GFP y Cy3.

Elija el nivel de intensidad máximo en el que los pocillos de control negativos no muestran ninguna señal para la adquisición de imágenes. Utilice la misma configuración de umbral para pocillos positivos. Finalmente, capture imágenes y guárdelas en una base de datos, antes de realizar el análisis de imágenes de acuerdo con el protocolo de texto.