El análisis de la migración de células troncales neurales Crest utilizando una versión modificada del ensayo Zigmond Cámara

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la capacidad de una molécula para provocar quimiotaxis y otras respuestas migratorias en células de la cresta neural del tronco explantadas. Esto se logra aislando primero los tubos neurales a nivel del tronco de entre aproximadamente ocho y 15 somitas de longitud y cultivando cada uno de los tubos neurales durante la noche en cubrebocas separados recubiertos de fibronectina para permitir la emigración de la cresta neural. A continuación, se selecciona un cultivo óptimo de la cresta neuronal.

El tubo neural se retira del cultivo y el cubreobjetos que contiene el cultivo se monta en una cámara zigmund modificada de modo que el borde más recto del cultivo sea paralelo al vector del gradiente molecular que se aplicará a través del cultivo. El tercer paso es generar un gradiente molecular a través del cultivo y luego filmar la migración de las células de la cresta neural periférica a lo largo del borde recto previamente seleccionado del cultivo. El paso final es rastrear y analizar la migración de las células de la cresta neural periférica colocadas a lo largo del borde seleccionado del cultivo utilizando el software Image J.

En última instancia, se puede determinar si la molécula seleccionada puede alterar la direccionalidad celular u otras características migratorias como la velocidad a través del análisis de los datos de trayectoria celular obtenidos. La principal ventaja de esta técnica sobre las técnicas existentes como el ensayo en cámara de Boyden, es que a un coste muy bajo. Este método se puede utilizar para analizar la migración de células ya polarizadas en la periferia de los cultivos primarios explan, utilizando imágenes de lapso de tiempo.

Después de incubar los huevos de pollito durante 56 horas a 38 grados centígrados, retire los huevos de la incubadora, rocíelos suavemente con etanol al 70% y luego deje que los huevos se sequen mientras se secan. Llene una placa de Petri de plástico estéril con solución Chick ringer y esterilice una bandeja de vidrio con rayos UV. Llene una placa de Petri de vidrio de cinco centímetros con pantallas de dis.

Ahora abra los huevos en la bandeja de vidrio esterilizada con rayos UV. Extraiga cada embrión de su yema cortando primero alrededor de las islas de sangre del embrión con unas tijeras curvas. Luego, con pinzas romas, recoja el embrión por su membrana embrionaria adicional y coloque el embrión en la placa de Petri preparada que contiene timbres.

A continuación, seleccione unos nueve embriones que se encuentran entre Hamburger y Hamilton. En las etapas 15 a 17, con una aguja de tungsteno, se corta cualquier tejido embrionario anterior al ácaro 10 y se eliminan todos los tejidos embrionarios cordales, comenzando desde alrededor del quinto ácaro más recién formado. A continuación, recorta las membranas embrionarias adicionales hasta unos dos milímetros del embrión.

Coloque los troncos de los embriones aislados en estas bahías e incube durante una hora y 15 minutos a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono mientras se incuban los troncos de los embriones. Prepara seis cubreobjetos para el cultivo. Primero enjuagándolos con etanol al 70% y dejándolos secar.

Luego, usando un marcador de laboratorio, dibuje un círculo en el centro de cada cubreobjetos de aproximadamente un centímetro de diámetro para la posterior identificación de la capa de conexión de fibrina en la misma cara de cada cubreobjetos. Escriba una palabra o símbolo asimétrico fuera del círculo dibujado para facilitar la identificación de la parte superior e inferior del cubreobjetos. Ahora coloque cada cubreobjetos en un plato estéril separado de 40 por 10 milímetros con el lado etiquetado hacia abajo, y deje que el plato se abra bajo una lámpara UV germicida durante 10 minutos.

A continuación, aplique 60 microlitros de fibronectina en la superficie no marcada del cubreobjetos dentro del círculo de un centímetro, asegurándose de que toda el área del círculo esté cubierta. Coloque los platos en la incubadora a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después del período de incubación, aspire con cuidado el aleta de cada cubreobjetos.

A continuación, agregue 250 microlitros de medio de cultivo al área recubierta de FI nin. El cubreobjetos y, a continuación, incubar los cubreobjetos de nuevo hasta que se hayan aislado los tubos neurales. Mientras se incuban los cubreobjetos, llene una placa de Petri de vidrio de cinco centímetros con medio L 15.

Ahora transfiera todos los troncos de los embriones incubados a la placa de Petri preparada. Use pinzas finas y una lengua y aguja afiladas para diseccionar el tubo neural cortando cuidadosamente a lo largo del borde del tubo neural y los somitas con la aguja. Retire los cubreobjetos de la incubadora.

Seleccione seis de los tubos neurales más largos y rectos y, a continuación, utilizando una punta de micropipeta cebada con medio de cultivo, transfiera un tubo neural a cada uno de los seis cubreobjetos. Asegúrese de que cada tubo neural esté dentro del área recubierta de fibronectina de su respectivo cubreobjetos con una micropipeta e incube durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. A continuación, coloque al menos dos mililitros de medio de cultivo sin suero en un tubo de centrífuga estéril de 15 mililitros.

Deje el ternero ligeramente desenroscado mientras incuba el tubo durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono para permitir que se ajuste el pH del medio. Después del cultivo nocturno, seleccione los tres mejores cultivos de células de cresta neural que tengan al menos un borde recto largo fuera de los tres cultivos. Elija una para cargar la primera cámara y devuelva las otras a la incubadora para su uso posterior.

Luego, con nuestro hisopo de algodón, aplique una capa delgada y uniforme de vaselina en las áreas que rodean los depósitos y el puente de una cámara Sigmund modificada. A continuación, con una aguja de tungsteno, retire suavemente el tubo neural del cubreobjetos que contiene el cultivo de células de la cresta neural seleccionado, dejando las células de la cresta neural rodeadas unidas a la capa de fibronectina. Marque el plato con un marcador de laboratorio para recordar la orientación del borde más recto del cultivo de células de cresta neural.

A continuación, coloque unas gotas del medio preincubado en el puente de la cámara de zigmund modificada. A continuación, recoja el cubreobjetos con pinzas finas. Aplique el borde del cubreobjetos contra una toallita Kim para eliminar la mayor parte del antiguo medio de cultivo, e inmediatamente coloque el cubreobjetos en la cámara zigmund modificada de modo que el borde recto de la célula de la cresta neural que se va a filmar esté centrado a lo largo del puente y aproximadamente perpendicular al borde del reservorio del puente.

Usando un microscopio invertido, mueva el borde recto de la célula de la cresta neural al lado del puente más cercano al reservorio. Eso contendrá el tacto de quimioterapia sospechado y alineará más finamente el borde recto de la célula de la cresta neurológica perpendicular al borde del reservorio puente. Ahora presione la tapa con cuidado pero con seguridad, deslícela en la vaselina presente en la cámara de zigmund, asegurándose de que esté completamente sellada en la cámara.

A continuación, coloque vaselina adicional a lo largo del borde del cubreobjetos para asegurarse de que quede bien hermético. Vuelva a ajustar el ángulo del borde de la célula de la cresta neural para corregir cualquier movimiento durante el proceso de techo. A continuación, cargue aproximadamente 300 microlitros de medio preincubado en una jeringa de un mililitro.

Con una aguja adjunta de calibre 25 por 1,5 pulgadas. Inyecte el medio en el depósito que no contendrá ningún contacto de quimioterapia hasta que esté lleno. Teniendo cuidado de no generar burbujas en el depósito.

A continuación, tape el depósito por ambos lados con una cantidad suficiente de vaselina antes de cargar el siguiente depósito. Ahora cargue una segunda jeringa con 300 microlitros de medio preincubado que contenga el tacto de quimioterapia deseado. A continuación, inyecte el medio en el depósito opuesto de la misma manera.

De nuevo, sellando cuidadosamente el depósito con vaselina. Después de incubar la cámara Sigmund cargada a 37 grados centígrados durante una hora antes de la filmación. Luego, mientras se incuba a aproximadamente 37 grados Celsius, el borde más recto de la cresta neural cultiva células durante tres horas a intervalos de 92 para los controles, cargue cámaras en zigmund que contienen cada uno de los otros dos mejores cultivos celulares de cresta neural como se acaba de mostrar.

Utilizar los tratamientos de control adecuados para el llenado de los embalses y el cebado del puente. Utilice el complemento de seguimiento manual de image J para rastrear la migración de las células de la cresta neural periférica a lo largo del borde recto del cultivo. Utilice el plugin de la herramienta de quimiotaxis y migración para analizar diversos parámetros de las trayectorias migratorias obtenidas.

Los cultivos celulares de la cresta neural del tronco alargado se prepararon mediante el cultivo nocturno de tubos neurales y se seleccionaron los cultivos celulares de la cresta neural resultantes con al menos un borde largo y recto para la experimentación. El borde recto más largo de un cultivo seleccionado se colocó perpendicular al borde del embalse del puente y, por lo tanto, paralelo al vector del gradiente futuro aplicado. El depósito que no contenía el presunto atrayente de quimioterapia representado aquí con un signo menos se cargó primero y se selló.

A continuación, se cargó el otro reservorio con el presunto atrayente de quimioterapia, representado con un signo más, y las células de la cresta neural periférica selladas a lo largo del borde previamente seleccionado se tomaron imágenes y se rastrearon utilizando el complemento de seguimiento manual para la imagen J. Se pueden evaluar numerosas características migratorias en respuesta al gradiente aplicado en función de los datos de seguimiento obtenidos, como se ilustra en este gráfico. Por ejemplo, un índice de quimiotaxis se puede derivar dividiendo el desplazamiento de una celda a lo largo del eje x por la distancia total que ha migrado. La respuesta atractiva de todas las células rastreadas se demuestra mediante el gráfico de trayectoria de células que se muestra aquí.

Cada rastro rojo es la trayectoria de una célula que migró hacia el reservorio cargada con un presunto atrayente de quimioterapia. En esta figura, hay una cantidad sustancialmente mayor de pistas rojas en comparación con las negras. En otra prueba, se validó la capacidad de una cámara Sigmund modificada para mantener un gradiente molecular.

Se añadió un conjugado Alexa Fluor 4 88 IGM al depósito izquierdo y se midió la intensidad de fluorescencia a través del puente en varios momentos. El gradiente se mantuvo durante al menos 26 horas Después de ver el video, debe tener una buena comprensión de cómo analizar la capacidad de una molécula para provocar quimiotaxis y otros comportamientos migratorios en cultivos celulares de cresta neural del tronco explantados utilizando un ensayo de cámara de zigmund modificado.