El análisis de la migración de células troncales neurales Crest utilizando una versión modificada del ensayo Zigmond Cámara

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la capacidad de una molécula para inducir quimiotaxis y otras respuestas migratorias en células de cresta neural troncal aisladas. Esto se logra primero aislando tubos neurales del nivel troncal con una longitud aproximada de entre ocho y 15 somitas, y cultivando cada uno de los tubos neurales durante la noche en laminillas separadas recubiertas con fibronectina, para permitir la emigración de las células de la cresta neural. A continuación, se selecciona un cultivo óptimo de cresta neural.

Se retira el tubo neural del cultivo y se monta el cubreobjetos que contiene el cultivo en una cámara Zigmund modificada, de modo que el borde más recto del cultivo quede paralelo al vector del gradiente molecular que se aplicará a través del cultivo. El tercer paso consiste en generar un gradiente molecular a través del cultivo y luego filmar la migración de las células de la cresta neural periférica a lo largo del borde recto previamente seleccionado del cultivo. El paso final es rastrear y analizar la migración de las células de la cresta neural periférica situadas a lo largo del borde seleccionado del cultivo utilizando el software Image J.

Finalmente, se puede determinar si la molécula seleccionada puede alterar la direccionalidad celular u otras características migratorias, como la velocidad, mediante el análisis de los datos de trayectoria celular obtenidos. La principal ventaja de esta técnica frente a técnicas existentes como el ensayo de cámara de Boyden es que tiene un costo muy bajo. Este método puede utilizarse para analizar la migración de células ya polarizadas en la periferia de cultivos primarios de explantes mediante imágenes de lapso de tiempo.

Después de incubar los huevos de pollo durante 56 horas a 38 grados Celsius, retire los huevos del incubador, rocíelos ligeramente con etanol al 70 % y luego déjelos secar mientras se secan los huevos. Llene un plato de Petri plástico estéril con solución de Ringer para pollo y esterilice con luz UV una bandeja de vidrio. Llene un plato de Petri de vidrio de cinco centímetros con dis displays.

Ahora rompa los huevos y ábralos en la bandeja de vidrio esterilizada con UV. Extraiga cada embrión de su yema cortando primero alrededor de las islas sanguíneas del embrión con tijeras curvas. Luego, con pinzas romas, tome el embrión por su membrana extraembrionaria y colóquelo en la placa de Petri preparada que contiene ringer.

A continuación, seleccione aproximadamente nueve embriones que se encuentren entre las etapas de hamburguesa y Hamilton, desde la 15 hasta la 17. Con una aguja de tungsteno, corte cualquier tejido embrionario anterior al somita 10 y elimine todos los tejidos embrionarios cordales a partir del quinto somita más recientemente formado. Luego, recorte las membranas extraembrionarias hasta dejarlas a unos dos milímetros del embrión.

Coloque los troncos embrionarios aislados en bahías de disco e incúbelos durante una hora y 15 minutos a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono mientras los troncos embrionarios están en incubación. Prepare seis cubreobjetos para el cultivo. Primero, enjuáguelos con etanol al 70% y déjelos secar.

Luego, utilizando un marcador de laboratorio, dibuje un círculo en el centro de cada cubreobjetos con un diámetro de aproximadamente un centímetro para la posterior identificación del recubrimiento de fibrina en la misma cara de cada cubreobjetos. Escriba una palabra o símbolo asimétrico fuera del círculo dibujado para facilitar la identificación de la parte superior e inferior del cubreobjetos. Ahora coloque cada cubreobjetos en una placa estéril separada de 40 por 10 milímetros con el lado etiquetado hacia abajo y deje la placa abierta bajo una lámpara germicida de UV durante 10 minutos.

Luego, aplique 60 microlitros de fibronectina sobre la superficie sin marcar del cubreobjetos dentro del círculo de un centímetro, asegurándose de que toda el área del círculo quede recubierta. Coloque las placas en el incubador a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después del período de incubación, aspire cuidadosamente la fibronectina de cada cubreobjetos.

A continuación, agregue 250 microlitros de medio de cultivo al área recubierta con FI nin. La cubreobjetos y luego incube nuevamente las cubreobjetos hasta que se hayan aislado los tubos neurales. Mientras las cubreobjetos están incubando, llene una placa de Petri de vidrio de cinco centímetros con medio L 15.

Ahora transfiera todos los troncos embrionarios incubados a la placa de Petri preparada. Utilice pinzas finas y una aguja afilada para diseccionar el tubo neural, cortando cuidadosamente a lo largo del borde entre el tubo neural y los somitas con la aguja. Retire las laminillas del incubador.

Seleccione seis de los tubos neurales más largos y rectos, y luego, utilizando una punta de micropipeta cebada con medio de cultivo, transfiera un tubo neural a cada una de seis laminillas. Asegúrese de que cada tubo neural se encuentre dentro del área recubierta con fibronectina de su laminilla respectiva utilizando una micropipeta e incube durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. A continuación, coloque al menos dos mililitros de medio de cultivo sin suero en un tubo cónico estéril de 15 mililitros.

Deje el tapón ligeramente desenroscado mientras incuba el tubo durante la noche a 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono para permitir que el pH del medio se ajuste. Después del cultivo nocturno, seleccione los tres mejores cultivos de células de cresta neural que tengan al menos un borde largo y recto de los tres cultivos. Elija uno para cargar la primera cámara y devuelva los demás al incubador para su uso posterior.

Luego, utilizando nuestro hisopo de algodón, aplique una capa fina y uniforme de vaselina en las áreas que rodean los depósitos y el puente de una cámara Sigmund modificada. A continuación, con una aguja de tungsteno, retire suavemente el tubo neural del portaobjetos que contiene el cultivo seleccionado de células de cresta neural, dejando las células de cresta neural circundantes adheridas al recubrimiento de fibronectina. Marque el recipiente con un rotulador de laboratorio para recordar la orientación del borde más recto del cultivo de células de cresta neural.

A continuación, coloque unas gotas del medio preincubado sobre el puente de la cámara de Zigmund modificada. Luego, tome la cubreobjetivo con pinzas finas. Toque el borde de la cubreobjetivo contra una toalla de papel Kim para eliminar la mayor parte del medio de cultivo antiguo, e inmediatamente coloque la cubreobjetivo sobre la cámara de Zigmund modificada de manera que el borde recto de las células de la cresta neural que se va a filmar quede centrado a lo largo del puente y aproximadamente perpendicular al borde del reservorio del puente.

Utilizando un microscopio invertido, mueva el borde recto de las células de la cresta neural hacia el lado del puente más cercano al reservorio. Esto contendrá el quimiotáctico sospechoso y alineará más finamente el borde recto de las células de la cresta neural perpendicularmente al borde del reservorio del puente. Ahora presione cuidadosa pero firmemente la cubierta, deslizándola hacia la gelatina de petróleo presente en la cámara de Zigmund, asegurándose de que quede completamente sellada sobre la cámara.

Luego, coloque gelatina de petróleo adicional a lo largo del borde del cubreobjetos para asegurar aún más que quede hermético. Ajuste nuevamente el ángulo del borde de las células de la cresta neural para corregir cualquier movimiento ocurrido durante el proceso de colocación. A continuación, cargue aproximadamente 300 microlitros de medio preincubado en una jeringa de un mililitro.

Con una aguja de 25 gauge y 1,5 pulgadas. Inyecte el medio en el reservorio que no contendrá ningún quimiotacto hasta que esté lleno. Tenga cuidado de no generar burbujas en el reservorio.

Luego, tape ambos extremos del depósito con una cantidad suficiente de vaselina antes de cargar el siguiente depósito. Ahora cargue una segunda jeringa con 300 microlitros de medio preincubado que contenga el quimiotáctico deseado. A continuación, inyecte el medio en el depósito opuesto de la misma manera.

Nuevamente, selle cuidadosamente el depósito con vaselina. Incube la cámara de Sigmund cargada a 37 grados Celsius durante una hora antes de filmar. Luego, durante la incubación a aproximadamente 37 grados Celsius, capture la imagen del borde más recto de la cultura de células de cresta neural durante tres horas a intervalos de 92 segundos. Como controles, cargue cámaras de zigmund que contengan cada una de las otras dos mejores culturas de células de cresta neural, tal como se acaba de mostrar.

Utilice los tratamientos de control apropiados para llenar los depósitos y cebado del puente. Utilice el complemento manual de seguimiento de la imagen J para rastrear la migración de las células de la cresta neural periférica a lo largo del borde recto del cultivo. Utilice el complemento de herramienta de quimiotaxis y migración para analizar varios parámetros de las trayectorias migratorias obtenidas.

Se prepararon cultivos de células de la cresta neural del tronco alargadas mediante el cultivo nocturno de tubos neurales, y se seleccionaron para experimentación aquellos cultivos de células de la cresta neural que presentaban al menos un borde largo y recto. Luego, el borde recto más largo de un cultivo seleccionado se colocó perpendicular al borde del reservorio puente, y por lo tanto paralelo al vector del gradiente que se aplicaría posteriormente. Primero se cargó y selló el reservorio que no contenía el quimioatractivo sospechoso, representado aquí con un signo menos.

Luego, el otro depósito se cargó con el quimioatractivo sospechoso representado con un signo más, y se sellaron las células de la cresta neural periférica a lo largo del borde previamente seleccionado; después, se capturaron imágenes y se rastrearon utilizando el complemento de rastreo manual para ImageJ. Numerosas características migratorias en respuesta al gradiente aplicado pueden evaluarse en función de los datos de rastreo obtenidos, como se ilustra con este gráfico. Por ejemplo, se puede calcular un índice de quimiotaxis dividiendo el desplazamiento de una célula a lo largo del eje x por la distancia total que ha migrado. La respuesta atractiva de todas las células rastreadas se demuestra mediante el gráfico de trayectorias celulares mostrado aquí.

Cada pista roja es la trayectoria de una célula que migró hacia el reservorio cargado con un quimioatractivo sospechoso. En esta figura, hay una cantidad considerablemente mayor de pistas rojas en comparación con las negras. En otra prueba, se validó la capacidad de una cámara sigmund modificada para mantener un gradiente molecular.

Se agregó un conjugado de Alexa Fluor 488 IGM al reservorio izquierdo y se midió la intensidad de fluorescencia a través del puente en varios momentos. El gradiente persistió durante al menos 26 horas. Después de ver el video, debería tener una comprensión clara de cómo analizar la capacidad de una molécula para inducir quimiotaxis y otros comportamientos migratorios en cultivos de células del crestón neural del tronco, utilizando un ensayo modificado con cámara de Zigmond.