Actividades de imagen de olores provocados en el bulbo olfatorio de ratón utilizando reflexión óptica y señales de autofluorescencia

El objetivo general de este experimento es mapear las actividades evocadas por el olor en la superficie del bulbo olfativo de ratones utilizando señales ópticas intrínsecas y señales autofluorescentes de flavoproteínas o imágenes FAS después de haber anestesiado al ratón y exponer el cráneo. El hueso por encima del bulbo olfatorio se adelgaza. Se dibuja un colgajo de hueso con la punta de una hoja de bisturí y luego se retira, se hace una cámara de cemento dental y rodea la superficie expuesta del bulbo olfatorio.

Se rellena con aros y se coloca un cubreobjetos encima de esta preparación. Los mapas olfativos se adquieren secuencialmente en el mismo ratón utilizando señales ópticas intrínsecas e imágenes FAS, La obtención de imágenes de otras actividades evocadas en el bulbo olfativo del ratón utilizando reflectancia óptica y señales autofluorescentes puede ayudar a responder preguntas clave sobre el recubrimiento especial de órdenes en el bulbo olfativo. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como las imágenes de glucosa dos doxy o FMRI, es que permite registrar las actividades de evocación de orden a una resolución especial de una sola lista de glamour.

Por lo general, las personas nuevas en estos métodos tendrán dificultades al comienzo de su trabajo porque tanto las habilidades quirúrgicas como las instrumentales son lentas de adquirir. La demostración visual de este método es fundamental para llamar la atención sobre los pasos cruciales de los procedimientos quirúrgicos y de imagen. Pellizque la pata trasera del ratón para confirmar la anestesia y retire el vello del cuero cabelludo con una maquinilla.

Limpie cualquier residuo de pelo de la piel con gasas estériles empapadas en agua destilada. Coloque el ratón en el marco estereotáxico de modo que el hocico esté en el mismo plano que la parte posterior de la cabeza. Para colocar el bulbo olfativo horizontalmente, asegure firmemente las barras de la oreja y la nariz para evitar el movimiento.

Aplique ungüento oftálmico en los ojos para evitar que se sequen durante la toma de imágenes y luego desinfecte el área del cuero cabelludo con Betadine con tijeras estériles. Haga una incisión en la parte posterior de la cabeza entre las orejas, luego corte en ambos lados hacia la base de la oreja y en la dirección anteroposterior hacia la frente a lo largo de los párpados. Termina de quitar el cuero cabelludo cortando la piel del hocico.

Usar la barra de la nariz como guía. Coloque al animal bajo un microscopio estereoscópico y use un hisopo de algodón empapado con solución salina para separar suavemente el periostio en la parte superior del cráneo. Utilice un par de pinzas para extraer el tejido restante y raspe la superficie del cráneo con un bisturí para asegurar una preparación limpia con el fin de mantener húmeda la zona del bulbo olfatorio durante todo el experimento.

Coloque un trozo de gelatina absorbible, esponja empapada con agua destilada sobre el hueso sobre el bulbo olfatorio ubicado entre los ojos. Retire la esponja de gelatina y comience raspando suavemente el hueso con una hoja de bisturí número 10. Mantenga un ángulo constante de 45 grados entre la hoja y el hueso y mueva la hoja desde los párpados hasta el lado sagital del área del bulbo.

Tenga cuidado de no aplicar presión vertical sobre el hueso o rascar el hueso por encima del seno venoso durante el proceso de adelgazamiento. Detente cada cinco minutos y coloca una esponja de gelatina hidratada sobre el hueso para enfriar la preparación. Frote el cráneo con la esponja para eliminar el hueso, el polvo y limpie la punta del bisturí periódicamente para mantenerlo limpio y afilado.

Continúe hasta que la capa de hueso esponjoso o trabécula sea visible. Cuando la vasculatura fina del bulbo olfatorio sea visible, deja de rascar el hueso y utiliza la punta de un bisturí número 11 para dibujar un área rectangular y cerrar el bulbo olfatorio. Manteniendo la ventana dentro de los límites de los senos venosos, continúe rascando el hueso dentro del área rectangular.

Tenga mucho cuidado con la profundidad de la punta del bisturí para evitar tocar la superficie de la duramadre. Para tener una idea del grosor del hueso restante, empújelo suavemente con la punta de un par de pinzas. Si el hueso se pliega bajo presión, continúe con el siguiente paso.

Añade una gota de solución salina y utiliza la punta del bisturí orientada horizontalmente para levantar el colgajo de hueso. Retire con cuidado el colgajo con pinzas para evitar arrancar el hueso restante. Una vez que la superficie del bulbo olfativo esté expuesta, verifique la ausencia de sangrado o vasos sanguíneos. Anastomosis.

Limpie el área con una esponja de gelatina empapada en solución salina. Para mantener húmedo el bulbo olfativo, aplique cemento dental de acrilato de polietileno con una jeringa de calibre 29 para formar un pozo en el hueso alrededor de la ventana craneal. Coloque una gota de aros de bajo punto de fusión sobre la duramadre y coloque un cubreobjetos estéril sobre la ventana craneal para la obtención de imágenes.

Coloque el marco estereotáxico bajo el microscopio estereoscópico con la ventana craneal centrada en el enfoque del campo de visión para ver los capilares. Cambie a la luz verde de 580 nanómetros y capture una imagen de control anatómico para comprobar el estado de la preparación durante la obtención de imágenes. A continuación, proceda a capturar los ensayos de estimulación utilizando imágenes de señal óptica intrínseca con una iluminación de 630 nanómetros o imágenes de señal autofluorescente de flavoproteínas con una iluminación de 480 nanómetros, una sesión de imagen estándar incluye una línea de base de cinco a 10 segundos en la que sólo se suministra aire, seguido de la estimulación del olor durante tres a 10 segundos, dependiendo de la concentración de olor elegida.

Y, por último, se registran de 70 a 82 segundos de suministro de aire para la recuperación basal. Aquí, se obtienen imágenes de la vasculatura del bulbo olfatorio a través de la ventana craneal, seguidas de los resultados de una prueba de estimulación que utiliza h sinal como odorante capturado mediante imágenes iOS y FAS. Con las imágenes de iOS, la actividad evocada por el olor se muestra a medida que las flechas blancas indican las áreas oscuras de las áreas de absorción activadas por AL, y las áreas activas se pueden ver tanto en ensayos únicos como en ensayos múltiples promediados.

El cambio a la obtención de imágenes FAS en la misma actividad evocada por OD de ratón ahora se muestra como áreas blancas de emisión de autofluorescencia indicadas por las flechas negras, y también se puede ver tanto en ensayos únicos como en ensayos múltiples promediados. Observe que tanto las zonas negras de absorción que se ven con las imágenes de iOS como las áreas blancas de emisión de autofluorescencia que se ven con las imágenes FAS se superponen. Esta coincidencia espacial confirma que las dos técnicas permiten la visualización de los mismos glomérulos olfatorios: una vez que el orden de imagen maestra evoca, las actividades que utilizan reflectancia óptica y señales de autofluorescencia se pueden realizar en una hora para la cirugía y un par de horas para la adquisición de imágenes.

Los principales inconvenientes de utilizar estos métodos de imagen óptica son el hecho de que no se pueden aplicar para visualizar mapas olfativos de una manera que se mueva libremente. Y debido a la limitada penetración de los fotones en los tejidos biológicos, no dan acceso a los glomérulos olfativos ventrales tras su desarrollo a finales de los años noventa, registrando señales intrínsecas en el sistema olfativo. Tal vez una forma para que los investigadores en el campo de la imagen óptica exploren las características del recubrimiento especial de od.

En el bulbo olfatorio, la autofluorescencia de flavoproteínas es una técnica prometedora para proporcionar nuevos conocimientos sobre el recubrimiento especial de OD utilizando señales ópticas endógenas.