Imunocoloración Cuádruple del Bulbo Olfativo para la Visualización de Códigos de Identidad Molecular del Axón Sensorial Olfativo
June 5th, 2017
Las neuronas sensoriales olfativas expresan una amplia variedad de moléculas de clasificación de axones para establecer circuitos neurales adecuados. Este protocolo describe un método de tinción inmunohistoquímica para visualizar las expresiones combinatorias de las moléculas de clasificación de axones en los terminales axónicos de las neuronas sensoriales olfatorias.
El objetivo general de este método de tinción inmunohistoquímica es visualizar la expresión combinada de las moléculas de clasificación de axones en el extremo axónico de las neuronas sensoriales olfativas. Este método puede ayudar a caracterizar procesos clave en el campo del desarrollo olfativo, como la guía de los axones, la formación de sinapsis y la regeneración de las neuronas sensoriales olfativas. La principal ventaja de esta técnica es que permite a los científicos comparar y analizar los patrones de expresión de las moléculas de clasificación de axones en el bulbo olfatorio sin mantener variación entre secciones.
La demostración visual de este método es fundamental, ya que el paso de inclusión es difícil de aprender, porque la posición y el ángulo de la muestra de tejidos olfativos en el molde son difíciles de describir con palabras. Comience con cabezas de ratones de una a dos semanas de edad que se hayan fijado mediante perfusión intracardíaca de paraformaldehído al 4%. Inserte una hoja de tijera en el espacio entre los dientes superiores e inferiores, y corte horizontalmente para quitar la mandíbula inferior.
A continuación, recorte el exceso de tejido con pinzas y tijeras, para dejar el tejido olfativo, incluido el bulbo olfatorio y el epitelio olfativo. Sumerja el tejido olfativo en PBS para eliminar el aire en la cavidad nasal, luego haga un corte vertical para eliminar la parte posterior del cerebro y coloque el tejido olfativo en la parte inferior de un molde de inclusión con el extremo cortado hacia abajo. Llene el molde con compuesto para temperatura de corte óptima y luego sumérjalo en nitrógeno líquido.
Después de que el tejido y la OCT estén completamente congelados, equilibre el tejido en el criostato a 20 grados centígrados durante una hora. Ahora haga secciones parasagittales en serie del bulbo olfativo con el criostato, y recójalas pegándolas a portaobjetos de vidrio recubierto de MAS. Después de pegar, seque los portaobjetos inmediatamente con un secador de pelo.
Comience la inmunotinción lavando los portaobjetos secos con PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente. Bloquee los sitios de unión inespecíficos incubando los portaobjetos durante una hora con una solución de bloqueo al 5% a temperatura ambiente. A continuación, añada 400 microlitros de un cóctel de anticuerpos primarios diluidos en una solución bloqueante al 1% a cada portaobjetos.
Incuba los portaobjetos durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, deseche la solución de anticuerpos primarios y lave los portaobjetos con PBST tres veces durante cinco minutos cada uno a temperatura ambiente. A continuación, añada 400 microlitros de un cóctel de anticuerpos secundarios y PBS a cada portaobjetos.
Proteger de la luz e incubar durante una hora a temperatura ambiente. Después de la incubación, deseche la solución y vuelva a lavar los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada uno con PBS a temperatura ambiente. Finalmente, monte los cubreobjetos en las guías aplicando dos gotas de medio de montaje a cada portaobjetos, colocando el cubreobjetos y eliminando las burbujas de aire.
Obtener imágenes fluorescentes con el microscopio de fluorescencia utilizando el filtro adecuado para cada fluoróforo. Ajuste el tiempo de exposición para obtener señales fluorescentes de la imagen sin saturación. Definir la estructura glomerular mediante señales inmunofluorescentes de GLUT2.
Utilice la imagen J para medir las intensidades de tinción de las moléculas de clasificación de axones dentro de los glomérulos. Esta imagen muestra una sección de bulbo olfativo parasaggital de un ratón de dos semanas de edad inmunoteñido con anticuerpos contra VGLUT2, Kirrel2 en rojo, Semaphorin 7A en verde y OLPC en azul. La imagen combinada demuestra que las moléculas de clasificación de axones involucradas en la segregación glomerular se expresan en un patrón de mosaico independiente de la posición.
Cada glomérulo está definido por señales fluorescentes del marcador presináptico VGLUT2. Las estructuras glomerulares están rodeadas por líneas discontinuas. Se midieron las intensidades de señal de las moléculas de clasificación de axones en cada glomérulo.
Como se ve aquí, las moléculas de clasificación de axones se expresan diferencialmente en cada glomérulo. Por ejemplo, el glomérulo 3 tiene niveles altos de OLPC, niveles intermedios de semáfora 7A y niveles más bajos de Kirrel2, y esta diferencia se puede cuantificar midiendo la intensidad de la tinción. Mientras que el glomérulo 4 tiene niveles altos de OLPC y niveles más bajos de Kirrel2 y Semaphorina 7A.
Una vez más, esta diferencia se puede cuantificar midiendo la intensidad de la tinción. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe omitir la posfijación con PFA y el tratamiento con solución de sacarosa, que normalmente se recomiendan. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo colocar más glomérulos en la sección única del bulbo olfativo y cómo realizar una inmunotinción de alta calidad con múltiples anticuerpos, que se pueden aplicar a otras áreas del cerebro.
No olvides tener esperanza, este método te ayudará a tener éxito en tus futuros experimentos.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Visión general
Este protocolo describe un método de tinción inmunohistoquímica para visualizar la expresión de moléculas de clasificación axónica en los extremos de los axones de las neuronas sensoriales olfativas. Esta técnica es crucial para comprender los procesos de desarrollo olfativo como la guía axónica y la formación de sinapsis.
Componentes clave del estudio
Área de ciencia
- Neurociencia
- Desarrollo olfativo
- Inmunohistoquímica
Antecedentes
- Las neuronas sensoriales olfativas juegan un papel clave en el sentido del olfato.
- Las moléculas de clasificación axónica son esenciales para establecer una circuito neural adecuado.
- Comprender sus patrones de expresión puede proporcionar información sobre las funciones del sistema olfativo.
- Visualizar estas expresiones puede ayudar a estudiar los procesos de regeneración en las neuronas sensoriales olfativas.
Propósito del estudio
- Visualizar la expresión combinada de moléculas de clasificación axónica.
- Caracterizar procesos clave en el desarrollo olfativo.
- Facilitar la comparación de patrones de expresión en el bulbo olfativo.
Métodos utilizados
- Técnica de tinción inmunohistoquímica.
- Uso de cabezas de ratón de una a dos semanas de edad.
- Perfusión intracardíaca con paraformaldehído al 4% para fijación.
- Incrustación y corte de muestras de tejido olfativo.
Principales resultados
- Visualización exitosa de las expresiones de moléculas de clasificación axónica.
- Demostró la capacidad de analizar patrones de expresión sin variación entre secciones.
- Proporcionó un método claro para incrustar tejidos olfativos.
- Destacó la importancia de las demostraciones visuales para aprender la técnica.
Conclusiones
- El método inmunohistoquímico es efectivo para estudiar las neuronas sensoriales olfativas.
- Comprender las moléculas de clasificación axónica puede mejorar el conocimiento del desarrollo del sistema olfativo.
- Esta técnica puede ser una herramienta valiosa para futuras investigaciones en regeneración olfativa.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables precise molecular mapping of axon-sorting molecules in the olfactory bulb, supporting target validation in neurodevelopmental research. By allowing quantitative comparison of protein expression patterns across glomeruli without section-to-section variability, it enhances predictive confidence in mechanistic studies of neural circuit formation. The approach provides a scalable, reproducible platform for de-risking hypotheses related to axon guidance and synaptic specificity in preclinical discovery pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of molecular identity codes at axon termini to clarify target engagement mechanisms in olfactory sensory neuron development.
- Operational Value: Supports functional target validation by correlating axon-sorting molecule expression with glomerular organization patterns.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream screening by establishing standardized immunostaining protocols for multiplex protein detection.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent glomerular definition using VGLUT2 as a presynaptic marker.
- Strategic Value: Highlights screening readiness via quantitative intensity measurements that enable reliable comparison of molecular expression across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Discusses disease relevance by linking axon-sorting molecule codes to neural circuit formation processes applicable to neurodegenerative models.
- Operational Value: Describes continuity from discovery through preclinical validation by enabling longitudinal analysis of axonal regeneration and reinnervation patterns.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing to lead identification by providing molecular resolution of axon guidance mechanisms critical for neurotherapeutic development.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing of OR-specific axon guidance through combinatorial molecular code visualization at axon termini.
- Screening: Describes assay readiness through standardized section collection and immunostaining that minimizes technical variation across samples.
- Analytics: Highlights quantitative readouts from ImageJ-based intensity measurements that enable statistical comparison of axon-sorting molecule expression across glomeruli.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity by enabling analysis of olfactory regeneration processes relevant to injury models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability for multiplex protein profiling in other brain regions beyond the olfactory system.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through direct visualization of molecular determinants of axonal segregation.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability achieved via consistent tissue embedding and sectioning protocols.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by reducing mechanistic ambiguity in neural pathway models.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantitative biomarker-like readouts of axon-sorting molecule co-expression patterns.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in immunohistochemistry, cryosectioning, and fluorescent microscopy.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs including cryostat, fluorescence microscope, and image analysis software.
- Cross-team standardization requirements for antibody validation and staining protocol consistency.
- Adaptation considerations across model systems, particularly for tissues with different embedding properties.
- Practical limitations include the technical challenge of tissue orientation in embedding molds, which requires hands-on training to master.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
5:42
Conclusion
4:26
Results: Quantification of Axon-sorting Molecules in the Olfactory Bulb
1:11
Preparation of Parasagittal Olfactory Bulb Sections
2:33
Day 1: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:07
Day 2: Quadruple Immunostaining of Olfactory Bulb Slices
3:56
The Use of Fluorescence Intensity Measurements
