Imagen de calcio funcionales en el desarrollo de redes corticales

El objetivo general de esta película es demostrar cómo medir la actividad de la red a partir de cortes corticales de cerebro en desarrollo utilizando un indicador fluorescente sensible al calcio. Los cortes de cerebro DY se hacen a partir de la corteza enteral en desarrollo de un ratón joven. Tanto las neuronas como los astrocitos están cargados de marcadores dependientes del calcio.

Los cambios en la fluorescencia de los colorantes dependientes del calcio reflejan cambios en la actividad celular. Las células no neuronales, incluidos los astrocitos, la microglía y las células endoteliales, se pueden teñir con colorantes marcadores específicos. La actividad de la red cortical se registra utilizando células de imágenes multifotónicas de lapso de tiempo que se detectan dentro de la red creando una pila de imágenes en 3D a través de la región de interés.

Los cambios en la fluorescencia celular a través de múltiples células se pueden analizar para leer la actividad de la red cortical en desarrollo. Un patrón distintivo de actividad en el sistema nervioso en desarrollo es la actividad espontánea y sincronizada de la red. Se ha observado actividad sincronizada en muchas regiones neuronales en desarrollo diferentes, incluida la corteza de la médula espinal intacta y las preparaciones de cultivo neuronal disociadas durante períodos de actividad espontánea de las neuronas, despolarizadas al fuego, picos individuales o ráfagas de potenciales de acción que activan muchos canales de hierro, incluidos los canales de calcio dependientes de voltaje que conducen a la afluencia de calcio.

La actividad altamente sincronizada se ha medido desde redes locales utilizando electrodos de campo o matrices de electrodos múltiples. Estos permiten altas velocidades de muestreo temporal, pero proporcionan una resolución espacial más baja debido a la lectura integrada de la actividad de la celda. La resolución de la actividad neuronal de una sola célula es posible utilizando la electrofisiología de pinza de parche de neuronas individuales para medir las tasas de disparo.

Sin embargo, la capacidad de medir desde una red está limitada al número de neuronas conectadas simultáneamente y, por lo general, es de solo una o dos neuronas. El uso de colorantes indicadores fluorescentes dependientes del calcio ha permitido la medición de la actividad sincronizada a través de una red de células. Esta técnica proporciona una alta resolución espacial y un muestreo temporal suficiente para registrar la actividad espontánea de la red en desarrollo.

Los indicadores fluorescentes sensibles al calcio, como el éster URA 2:00 AM, contienen grupos de ácido carboxílico que son capaces de unirse a las minas de calcio. Estos tintes fluorescentes se activan por longitudes de onda de luz específicas, ya sea utilizando una microscopía de fotones o de dos fotones. El número de fotones emitidos por el colorante se altera transitoriamente al unirse al calcio.

Este cambio en el número de fotones o fluorescencia se informa como la señal delta FF y corresponde a un cambio en el nivel de calcio dentro de la neurona. La medición de los cambios en los indicadores sensibles al calcio es una lectura útil de los patrones de actividad de la red en las células en desarrollo. Hola, soy Rianna Morty, y mi nombre es Julie Abbots.

Somos del Departamento de Neurofisiología Interpretativa y de la universidad de Ámsterdam. Hemos estado utilizando imágenes de calcio para estudiar la actividad funcional en el tejido en desarrollo en la corteza del ratón utilizando indicadores sensibles al calcio en imágenes multifocales. El objetivo de este cortometraje es demostrar cómo se pueden utilizar estos métodos para medir patrones de actividad espontáneos y evocadores en redes en desarrollo en el sistema nervioso.

Extraer el cerebro rápidamente del cráneo de un ratón joven para reducir el daño a los circuitos neuronales. Disecciona el cerebro en una solución de rodajas helada. La solución de corte contiene cloruro de colina en lugar del sodio comúnmente utilizado en A TSF para registros neuronales.

En estos experimentos, estamos haciendo cortes de cerebro a partir de la corteza enteral del cerebro de ratón en desarrollo. Coloque un trozo de papel de filtro encima de una placa de Petro y humedezca con unos mililitros de A TSF. Transfiere el cerebro a la hoja de papel de filtro.

Divide los hemisferios con una cuchilla de afeitar de un solo filo. Separa los dos hemisferios. Vuelva a colocar uno en la solución de rodajas heladas con el hemisferio restante.

Retira el cerebelo con la cuchilla de afeitar. Voltea un hemisferio sobre su línea media y haz un corte de aproximadamente un milímetro desde la superficie dorsal con un ligero ángulo de la hoja hacia el extremo rostral. Dale la vuelta al cerebro.

Su superficie recién cortada con un pájaro de algodón y una espátula de metal. Transfiere el cerebro al bloque de corte de metal. Empuje suavemente el cerebro de la espátula con un pájaro de algodón sobre la superficie pegada.

Se cortan cortes de cerebro de 300 micrómetros para tejido joven, las velocidades de corte y la frecuencia de las cuchillas suelen ser más lentas que las utilizadas para tejido más maduro. Una vez cortado, transfiera cada rebanada con una pipeta de vidrio Las rodajas se transfieren a la cámara de retención, que contiene A TSF oxigenado a temperatura ambiente. El líquido cefalorraquídeo A contiene una mayor proporción de magnesio y calcio que la solución de líquido cefalorraquídeo A.

Se utiliza para grabar los cortes que se dejan durante una hora para que se recuperen. Para cargar las células con un indicador dependiente del calcio o un marcador específico de la célula, es necesario transferir cortes a una cámara para el procedimiento de tinción. Aunque hay cámaras comerciales disponibles, una se puede ensamblar fácilmente a partir de un equipo de laboratorio estándar por muy poco costo.

Para hacer una cámara de tinción, necesitará el siguiente equipo básico de laboratorio, dos placas de Petri de plástico, una jeringa de 10 mililitros, una sección de tubo de sílice, un inserto de cultivo celular con un superpegamento de membrana semipermeable, tres conectores de tubo pequeños y una aguja fina. Tome la placa de Petri grande y haga un pequeño agujero con una varilla calentada a través de la pared lateral. Tome la placa de Petri pequeña y haga un agujero de diámetro de tamaño similar lo suficientemente grande como para que pase el tubo de silicona.

Pase una sección de tubo de silicona a través del orificio y forme un lazo dentro del plato pequeño. Usa superpegamento para sellar el extremo abierto del tubo. A continuación, pega el resto del tubo a la pared interior de la pequeña placa de Petri.

Coloque la placa de Petri pequeña en el centro de la grande y péguela en su lugar. Tome el extremo restante del tubo de silicona y páselo a través del pequeño orificio en la pared lateral de la placa de Petri. Tome una aguja fina y haga pequeños agujeros en el tubo de silicona dentro de la placa de Petri.

Haga los agujeros a intervalos espaciados uniformemente para una fusión uniforme de gas. Tome bien un cultivo celular con una membrana semipermeable usando un bisturí caliente. Corta los centímetros superiores del pozo para dejar un plato poco profundo para contener las rodajas durante la incubación.

Coloque el plato poco profundo en el centro del plato pequeño rodeado por el tubo de silicona poroso. Haz un agujero de aproximadamente medio a un centímetro de diámetro en la tapa del plato grande. Tome una jeringa de plástico de 10 mililitros con un bisturí caliente.

Haz un corte en ángulo para quitar el extremo de la jeringa. Aplique superpegamento a la superficie cortada del tubo de la jeringa. Pégalo directamente sobre el agujero de la tapa grande de la placa de Petri.

Conecte un conector de tubo al extremo de la punta de la jeringa. Coloque el plato poco profundo en el centro de la placa de Petri pequeña, asegurándose de que el tubo de gas poroso quede alrededor del plato. A continuación, este tubo se conecta a un suministro de gas carbógeno para oxigenar las rodajas.

Durante la incubación, vuelva a colocar la tapa de la placa grande, que también está conectada directamente al suministro de gas a través de la punta de la jeringa. Esto traerá un suministro de automóvil y gas sobre las rodajas durante la incubación para evitar el blanqueo del tinte. Todos los procedimientos se llevan a cabo con la menor cantidad de luz posible, y tanto el tinte como las rodajas se mantienen en la oscuridad.

Llene la cámara de tinción con aproximadamente un mililitro y medio de A TSF del portarebanadas. Coloque la cámara de interfaz dentro y llénela con otro mililitro de A TSF. Es importante mantener un buen suministro de oxígeno para mantener el tejido sano y para una buena carga de la loncha.

La tinción se produce alrededor de los 35 grados C para facilitar la absorción del tinte en las neuronas mientras la cámara de tinción se calienta. Prepara el tinte indicador para fira 2:00 AM Ester. Agregue nueve microlitros de DMSO con un microlitro de ácido ónico a un vial de 50 microgramos.

DMSO y ácido ónico. Actúan como agentes permanentes para permitir que el tinte sea absorbido a través de la membrana lipídica. Agite el vial durante 15 minutos para asegurarse de que el tinte se disuelva por completo.

Para teñir, transfiera cada rodaja a la interfaz. Insertar en la cámara de tinción. Acaricie el tinte directamente sobre la región de interés sobre las rodajas, cierre la tapa de la cámara de tinción.

Deje las rodajas incubadas en la oscuridad durante 20 a 40 minutos dependiendo de la edad de los maus utilizados. Después de la incubación, transfiera las rodajas nuevamente al soporte de rebanadas para lavar el exceso de tinte restante. Los protocolos de tinción para las imágenes de calcio también se pueden adaptar para tejidos más viejos.

Esto requiere un paso adicional de preincubación. Transfiera las rodajas viejas a una placa de preincubación poco profunda llena de tres mililitros de líquido cefalorraquídeo y ocho microlitros de solución de crema cuatro al 0,5% Caliente a 35 grados C durante tres minutos. A continuación, transfiera las rodajas a la interfaz, insértelas en la cámara de tinción y siga los procedimientos normales de tinción.

También es posible teñir estos cortes para células no neuronales, a saber, astrocitos, microglía y células endoteliales. El azufre rumine 1 0 1 se puede utilizar para teñir los astrocitos en busca de azufre domine. Hacer una solución de 10 micromolares pipetear el tinte morado sobre la región de interés en las rodajas.

Dejar incubar durante un periodo de 15 minutos. Transfiera las rodajas nuevamente a la cámara de retención para eliminar el exceso de tinte. El conjugado FSE de la lectina del tomate puede teñir la microglía y las células endoteliales.

Para la lectina de tomate, prepare una solución de 20 microgramos por mililitro. Acaricia el tinte sobre la región de interés en las rodajas. Deje incubar las rodajas durante un período de 45 minutos.

A continuación, vuelva a colocar las rodajas en la cámara de retención. Durante la obtención de imágenes, los cortes deben ser estables bajo el microscopio. Por lo general, se coloca un arpa de metal para sujetar el tejido, sin embargo, puede distorsionar de manera desigual la superficie del corte, lo que brinda solo un campo de visión limitado para evitar la obtención de imágenes.

Estos cortes se adhieren a la cámara de registro con una solución de POLIETILINA o PEI. El PEI es un polímero que se utiliza para mejorar la adhesión de las células a una superficie durante al menos una hora. Antes de colocar los cortes en las cámaras de registro, llene estas cámaras con unos mililitros de solución de PEI para cubrir el piso de la cámara.

En primer lugar, enjuague el PEI de la cámara con agua destilada, seguido de una solución de LCR trans. Transfiera una rebanada a la cámara de registro y elimine el exceso de solución de LCR A. Coloque la rebanada en el centro de la cámara con un pincel fino.

Retire todo el líquido cefalorraquídeo A con pequeños trozos de papel de filtro absorbente. Tenga cuidado de asegurarse de que la rebanada no tenga más CSF A alrededor de sus bordes. Por último, frote medio mililitro de líquido cefalorraquídeo suavemente sobre la rodaja sin soltarla de la cámara.

Coloque las cámaras en un recipiente de interfaz oxigenado grande y déjelas durante una hora más en la oscuridad. Los cambios en los tintes indicadores sensibles al calcio se pueden registrar con una o dos microscopías de fotones. Utilizamos un láser de zafiro de titanio acoplado a un microscopio Olympus para permitir la obtención de imágenes de dos fotones en nuestras redes neuronales.

Además, hacemos uso de un sistema de visor de corte de biotecnología L Vision con una cámara EM CCD hammer MATSU para aumentar las tasas de escaneo de fotogramas. Coloque la cámara de corte bajo el microscopio con un flujo estable de A-T-S-F-A-T-S-F oxigenado que contenga 1,6 milimolares de calcio y 1,5 milimolares. El magnesio se calienta a aproximadamente 30 grados C en la configuración con luz blanca.

Localice la región de interés en el sector y concéntrese en la superficie. Apague las luces y cierre la puerta del gabinete de grabación. Para reducir los niveles de luz de fondo.

Hay muchos paquetes de software comerciales o abiertos diferentes disponibles para registrar y analizar imágenes En nuestro laboratorio, utilizamos software de inspección para la adquisición de Lavis Biotech. Para comenzar la toma de imágenes, seleccione el modo de cámara CCD para la detección. Establezca la longitud de onda relevante para su indicador.

Para fira 2:00 AM Ester, ajustamos la excitación a 820 nanómetros en el software del visor de ajuste. Seleccione el modo de escaneo 64 B. Elija el tamaño, el campo de visión y la resolución de píxeles óptimos para su región de interés.

Seleccione una velocidad de fotogramas y un giro de píxeles adecuados si es necesario para el muestreo de imágenes. Abra el obturador láser listo para imágenes continuas. Uso del modo de imagen continua.

Ajuste la ganancia y la intensidad del láser y concéntrese en la red neuronal que desea obtener una imagen. Detenga el escaneo. Seleccione los ajustes de lapso de tiempo para la velocidad de fotogramas y la duración de la secuencia.

Después de las imágenes de lapso de tiempo, haga una pila Z de imágenes marcando 20 micras por encima y 20 micras por debajo en pasos de una micra. Esta pila Z se utiliza para la detección de células durante el análisis. Exporte los archivos grabados como una pila de imágenes TIFF.

Para concluir, hemos demostrado el uso de indicadores de calcio para medir la actividad sincrónica espontánea de la red en la corteza en desarrollo. Puede encontrar más detalles sobre la metodología y los reactivos en las hojas de datos que acompañan a esta película para que pueda configurar la técnica en su propio laboratorio.