El aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera

El objetivo de este protocolo es el aislamiento y expansión de células tumorales multiformes de glioblastoma humano utilizando el activo neuroesferas. Esto se logra primero picando el tejido tumoral recolectado, seguido de la disociación mecánica de la ización, y finalmente colocando las células resultantes para que crezcan en el cultivo de la neurosfera. En este vídeo, vamos a mostrar cómo aislar y expandir células madre de tejido tumoral de glioblastoma humano utilizando el método de cultivo de neurossphere.

Este método también se puede utilizar para cultivar células de otros tumores cerebrales, así como tumores sólidos como el de mama, próstata, hígado y pulmón. Bien, comencemos. Después de recibir el tejido tumoral GBM resecado de la cirugía, se extirpa el medio.

El tumor se lava dos o tres veces con PBS estéril para eliminar contaminantes como sangre y desechos. Después del lavado, coloque el tumor resecado en una placa de Petri estéril. Primero, corte el tumor en porciones más pequeñas, luego transfiera una porción de tejido tumoral a una placa de Petri separada, pique el tejido con un bisturí número 10 en pedazos pequeños.

Esto aumentará el área de superficie disponible para la disociación enzimática. El picado puede tardar de uno a tres minutos, dependiendo del tamaño del tumor. Ahora agregue de tres a cinco ml de tripsina precalentada al tejido de carne picada y transfiéralo a un tubo de halcón estéril de 15 ml.

Coloque el tubo de 15 ml en un baño de agua a 37 grados durante 10 a 15 minutos. Agite el tubo cada cinco minutos. Para asegurar una mejor digestión de los tejidos, agregue un volumen igual de inhibidor de tripsina para detener la reacción.

La tripsina en activación se asegura pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Centrifugar la suspensión a 800 RRP M o 110 G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante, luego vuelva a suspender la paleta en un ml de medio basal de células madre neuros, colocando la punta contra el fondo del tubo.

Pipetear hacia arriba y hacia abajo de tres a siete veces para romper los grumos hasta lograr una suspensión lechosa, el pipeteo podría resultar en la muerte celular. Coloque un filtro de 40 micras en un tubo de 50 ml. Ahora agregue de 10 a 15 ml de medio basal a la suspensión celular y mezcle suavemente, pase la suspensión celular a través del filtro de 40 micras para eliminar los desechos en grupos no asociados.

PT las células Y aspirar el supernat. Vuelva a suspender las células en uno o dos ml de medio completo. A continuación, pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la suspensión.

Mezclar 10 microlitros de suspensión celular en 90 microlitros de azul Trian. Mezcle bien la suspensión y transfiera 10 microlitros al hemo. Citómetro. Realice un recuento de células como se muestra aquí.

Se requiere una suspensión de una sola célula sin grumos para tener un recuento de células preciso. No incluya las células positivas de azul triano. Al contar para colocar las celdas en un matraz T 80.

Agregue 20 ml de medios completos de células madre neuronómicas a un tubo de 50 ml. Agregue la cantidad adecuada de suspensión celular para alcanzar una densidad de 200, 000 células por ml. Ahora agregue EGF para alcanzar una concentración final de 20 nanogramos por ml.

Añadir heparina al 0,2% a una concentración de un microlitro por ml. Finalmente, agregue BFGF para alcanzar una concentración final de 10 nanogramos por ml. Mezcle las células en medios completos suplementados con factores de crecimiento.

Bueno, entonces transfiera la suspensión a una etiqueta T 80. A continuación, el matraz se transfiere a la incubadora a 37 grados centígrados y 5% de CO2 durante siete a 10 días. Después de ocho días en cultivo, las esferas están completamente desarrolladas y listas para ser transitadas.

Recoja el contenido del matraz y transfiéralo a una centrífuga de dos cilindros de 50 ml. Las celdas a 800 RPM durante cinco minutos. Aspire el supernat y, a continuación, vuelva a suspender el palet en un ml de tripsina precalentada.

Incubar las células en baño de agua a 37 grados centígrados durante dos minutos. Agregue una cantidad igual de inhibidor de tripsina y mezcle bien para asegurar una activación. A continuación, granule las células.

Retire el supernat y vuelva a suspender las células en un ml de pipeta de medio completo hacia arriba y hacia abajo suavemente para homogeneizar la suspensión celular. Realice un recuento de células como se ha descrito anteriormente para colocar las células en un matraz T 80 a 20 ml de medio completo en un tubo de 50 ml. Añadir una cantidad adecuada de suspensión celular para alcanzar una densidad de 50.000 células por ml.

Ahora agregue factores de crecimiento que incluyen E-G-F-B-F-G-F y heparina en la concentración descrita anteriormente. Mezcle suavemente la suspensión celular resultante, luego transfiera la suspensión a un T 80 y colóquela en la incubadora durante siete a 10 días. A continuación, se muestra un ejemplo de la cultura GBM principal.

Después de cuatro días en esta etapa, se puede ver que las células están proliferando y comenzando a formar esferas. No debe observar grandes grupos esféricos de células en esta etapa. Esto habría sido el resultado de una preparación inadecuada del tejido.

Después de estar en cultivo de siete a 10 días, se han formado esferas de diferentes tamaños cuando las esferas han alcanzado un diámetro promedio de 150 a 200 micras, están listas para ser pasadas. Este es un ejemplo de paso de la cultura GBM después de ocho días. Una vez más, se puede ver que las esferas de diferentes tamaños, esferas sanas, exhiben micro picos en su periferia.

La preparación de una suspensión unicelular es un tema muy importante en cualquier cultivo de esferas. De lo contrario, es posible que termine observando agregados de células incluso el día después de la colocación de placas en las células. Estos agregados se asumen como esferas, pero debe tenerse en cuenta que se necesita al menos una semana para que las células perforantes formen verdaderas esferas.

La cantidad de residuos en el cultivo de la esfera tumoral primaria varía en función de muchos factores, como el origen del tejido y la precisión con la que se ha extraído el tejido, así como la técnica de procesamiento del tejido. Esperamos que este vídeo te sea útil y te deseamos mucha suerte con tus experimentos.