El aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera
30 de octubre de 2011
Este protocolo de vídeo se muestra el aislamiento y la expansión de las células madre como de mutliforme resecado quirúrgicamente de glioblastoma humano (GBM) del tejido tumoral usando el método de ensayo de cultivo neuroesfera.
El objetivo de este protocolo es el aislamiento y la expansión de células tumorales de glioblastoma multiforme humano utilizando el método de neuroesferas. Esto se logra primero mediante la picadura del tejido tumoral obtenido, seguido por disociación mecánica, y finalmente por la siembra de las células resultantes para su crecimiento en cultivo de neuroesferas. En este video, vamos a mostrar cómo aislar y expandir células con características de células madre a partir de tejido tumoral de glioblastoma humano utilizando el método de cultivo de neuroesferas.
Este método también puede utilizarse para cultivar células de otros tumores cerebrales, así como de tumores sólidos como los de mama, próstata, hígado y pulmón. Bien, comencemos. Después de recibir el tejido tumoral de GBM resecado procedente de la cirugía, se elimina el medio.
El tumor se lava dos o tres veces utilizando PBS estéril para eliminar contaminantes como sangre y restos celulares. Después del lavado, coloque el tumor resecado en una placa de Petri estéril. Primero, corte el tumor en porciones más pequeñas, luego transfiera una porción del tejido tumoral a una placa de Petri separada y triture el tejido con un bisturí número 10 hasta obtener trozos diminutos.
Esto aumentará el área de superficie disponible para la disociación enzimática. La picadura puede tardar de uno a tres minutos, dependiendo del tamaño del tumor. Ahora agregue de tres a cinco ml de tripsina precalentada al tejido picado y transfiera la mezcla a un tubo falcon estéril de 15 ml.
Coloque el tubo de 15 ml en un baño de agua a 37 grados durante 10 a 15 minutos. Agite el tubo cada cinco minutos. Para asegurar una mejor digestión del tejido, agregue un volumen igual de inhibidor de tripsina para detener la reacción.
La activación de la tripsina se asegura pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Centrifugue la suspensión a 800 RRP M o 110 G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante, luego resuspenda el pellet en un ml de medio basal para células madre neurales, colocando la punta contra el fondo del tubo.
Pipetee de tres a siete veces hacia arriba y hacia abajo para deshacer grumos hasta obtener una suspensión lechosa; pipetear en exceso podría provocar la muerte celular. Coloque un filtro de 40 micrones sobre un tubo de 50 ml. Añada ahora 10 a 15 ml de medio basal a la suspensión celular y mezcle suavemente; haga pasar la suspensión celular a través del filtro de 40 micrones para eliminar restos y grumos no asociados.
PT las células y retire el sobrenadante al vacío. Reuspenda las células en uno o dos ml de medio completo. Luego pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la suspensión.
Mezcle 10 microlitros de suspensión celular en 90 microlitros de azul de tripano. Mezcle bien la suspensión y transfiera 10 microlitros al hemocitómetro. Realice un recuento celular como se muestra aquí.
Se requiere una suspensión de células individuales sin agregados para obtener un recuento celular preciso. No incluya células positivas para azul de trian. Al contar para sembrar las células en un matraz T 80.
Añada 20 ml de medio completo para células madre neurales a un tubo de 50 ml. Añada la cantidad adecuada de suspensión celular para alcanzar una densidad de 200.000 células por ml. A continuación, añada EGF para obtener una concentración final de 20 nanogramos por ml.
Añada heparina al 0,2 % en una concentración de un microlitro por ml. Finalmente, añada BFGF para alcanzar una concentración final de 10 nanogramos por ml. Mezcle las células en medio completo suplementado con factores de crecimiento.
Luego transfiera la suspensión a un matraz T 80. Incube el matraz a 37 grados Celsius y 5 %CO2 durante siete a 10 días. Después de ocho días en cultivo, las esferas están completamente desarrolladas y listas para ser pasajeadas.
Recolecte el contenido del matraz y transfiéralo a una centrífuga de 50 ml. Centrifugue las células a 800 RPM durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante, luego resuspenda el pellet en 1 ml de tripsina precalentada.
Incube las células en baño de agua a 37 grados Celsius durante dos minutos. Añada una cantidad igual de inhibidor de tripsina y mezcle bien para asegurar una activación. Luego, pelete las células.
Elimine el sobrenadante y resuspenda las células en un ml de medio completo, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la suspensión celular. Realice un recuento celular como se describió anteriormente para sembrar las células en un frasco T80 con 20 ml de medio completo en un tubo de 50 ml. Añada una cantidad adecuada de suspensión celular para alcanzar una densidad de 50.000 células por ml.
Ahora agregue factores de crecimiento, incluyendo E-G-F-B-F-G-F, y heparina a la concentración descrita anteriormente. Mezcle suavemente la suspensión celular resultante, luego transfiera la suspensión a una botella T 80 y colóquela en el incubador durante siete a 10 días. Este es un ejemplo de cultivo primario de GBM.
Después de cuatro días en esta etapa, puede observarse que las células se están proliferando y comenzando a formar esferas. No debe observar grandes agrupaciones esféricas de células en esta etapa. Esto habría resultado de una preparación inadecuada del tejido.
Después de estar en cultivo durante siete a 10 días, se han formado esferas de diferentes tamaños; cuando las esferas alcanzan un diámetro promedio de 150 a 200 micrones, están listas para ser pasajeadas. Este es un ejemplo de un cultivo de GBM en pase después de ocho días. Nuevamente, se pueden observar esferas de distintos tamaños; las esferas sanas presentan microespículas en su periferia.
La preparación de una suspensión de células individuales es un aspecto muy importante en cualquier cultivo de esferoides. De lo contrario, podría terminar observando agregados celulares incluso al día siguiente de sembrar las células. Estos agregados podrían asumirse como esferas, pero debe tenerse en cuenta que los células perforantes necesitan al menos una semana para formar esferas verdaderas.
La cantidad de desechos en el cultivo de esferas de tumor primario varía según muchos factores, como el origen del tejido, la precisión con la que se ha extirpado el tejido y la técnica de procesamiento del tejido. Esperamos que este video sea útil y le deseamos buena suerte en sus experimentos.
Descripción general
Este protocolo en video demuestra el aislamiento y la expansión de células con características de células madre a partir de tejido tumoral de glioblastoma multiforme humano (GBM) resecado quirúrgicamente, utilizando el método de cultivo por ensayo de neuroesferas. El protocolo describe los pasos desde la preparación del tejido hasta el cultivo celular, proporcionando información sobre las técnicas empleadas para lograr una expansión celular exitosa.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Oncología
Antecedentes
- El glioblastoma multiforme (GBM) es un tumor cerebral altamente agresivo.
- El aislamiento de células con fenotipo de células madre es fundamental para estudiar la biología tumoral.
- Los métodos de cultivo de neuroesferas permiten el crecimiento de estas células in vitro.
- Este protocolo también puede aplicarse a otros tumores cerebrales y sólidos.
Objetivo del estudio
- Aislar y expandir células con características de células madre a partir de tejido de GBM.
- Proporcionar un método confiable para estudiar la biología del glioblastoma.
- Facilitar la investigación sobre posibles dianas terapéuticas.
Métodos Utilizados
- Recolección y lavado del tejido tumoral.
- Fragmentación y disociación enzimática del tejido.
- Recuento de células y siembra en cultivo de neuroesferas.
- Suplementación con factores de crecimiento para la expansión celular.
Resultados Principales
- Aislamiento exitoso de células con fenotipo de células madre a partir de tejido de GBM.
- Formación de neuroesferas que indican un crecimiento celular saludable.
- Demuestra la importancia de la suspensión individual de células para el cultivo.
- Observación de la morfología de las esferas como indicador de la salud del cultivo.
Conclusiones
- El ensayo de neuroesferas es efectivo para el cultivo de células similares a células madre de GBM.
- La preparación adecuada del tejido es fundamental para obtener resultados exitosos.
- Este método puede ayudar a comprender el GBM y a desarrollar tratamientos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El ensayo de neuroesferas permite el aislamiento y la expansión de células semejantes a células madre del glioblastoma, proporcionando un sistema relevante para la enfermedad que sirve para la validación de dianas y la reducción mecanicista de riesgos en el descubrimiento de fármacos oncológicos. Este enfoque respalda la confianza predictiva al modelar poblaciones de células iniciadoras de tumores fundamentales para comprender la progresión del GBM y la resistencia terapéutica. Facilita los flujos de trabajo de descubrimiento temprano al generar modelos celulares escalables y reproducibles para el desarrollo de ensayos y la identificación de compuestos líderes.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar poblaciones de células iniciadoras de tumores para aclarar hipótesis terapéuticas y dependencias de vías en el GBM.
- Valor operativo: Proporciona un método reproducible para aislar células con características de células madre a partir de tejido humano resecado quirúrgicamente, destinado a la validación funcional de dianas.
- Valor predictivo: Apoya la reducción de riesgos en la fase preclínica mediante la modelización de la autorrenovación y el potencial tumorigénico de las células madre cancerosas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera cultivos uniformes de neuroesferas adecuados para ensayos de alto contenido de compuestos que dirigen las vías de pluripotencialidad.
- Valor operativo: Establece condiciones estandarizadas de cultivo con suplementación definida de factores de crecimiento (EGF, bFGF, heparina) para la reproducibilidad del ensayo.
- Escalabilidad: Permite el subcultivo y la expansión de cultivos primarios, lo que posibilita estudios longitudinales de respuesta a fármacos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia de la enfermedad al preservar las características genómicas y fenotípicas de los tumores primarios de GBM in vitro.
- Valor operativo: Facilita la alineación de biomarcadores mediante métricas de morfología y tamaño de esferas (150-200 µm) como indicadores de salud del cultivo.
- Reducción de riesgos: Permite evaluar el impacto terapéutico sobre la autorrenovación de células con características de células madre, informando decisiones de avance o no en la etapa preclínica.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
El ensayo de neuroesferas se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la validación de dianas mediante ensayos funcionales en modelos de células con características de células madre antes de la identificación de compuestos líderes y las pruebas de eficacia preclínicas.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis al permitir el aislamiento de células iniciadoras de tumores para investigar los factores que impulsan la progresión y recurrencia del GBM.
- Selección: Proporciona la formación cuantitativa y reproducible de neuroesferas como lectura funcional para la selección de compuestos y la modulación de vías.
- Análisis: Ofrece resultados medibles, incluyendo el diámetro, el número y la morfología de las esferas, para evaluar la integridad del cultivo y la respuesta a fármacos.
- Investigación Translacional: Conecta el descubrimiento con trabajos preclínicos al mantener las propiedades de células con características de células madre, esenciales para modelar la heterogeneidad tumoral.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudiar múltiples tumores sólidos, incluyendo cánceres de mama, próstata, hígado y pulmón, como se indica en el protocolo.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza en el blanco al modelar la subpoblación celular responsable de la iniciación, progresión y recurrencia del tumor.
- Valor operativo: Asegura la reproducibilidad mediante pasos estandarizados de disociación, filtración y siembra para obtener suspensiones de células individuales.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en blancos mediante ensayos funcionales de células madre.
- Impacto en la cartera: Orienta la priorización ajustada al riesgo al identificar compuestos que modulan la autorrenovación y diferenciación de las células madre cancerosas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el manejo estéril de tejidos, disociación enzimática y técnicas de cultivo de neuroesferas.
- Depende del acceso a incubadoras de cultivo celular estériles, centrífugas y hemocitómetros para el conteo celular y la evaluación de viabilidad.
- Necesita protocolos estandarizados para el procesamiento de tejidos a fin de minimizar la formación de restos celulares y agregados que comprometan la calidad de las esferas.
- Requiere adaptar las concentraciones de factores de crecimiento según el origen del tumor y la calidad del tejido, ya que la variabilidad afecta la formación de neuroesferas.
- Limitado por la necesidad de tejido tumoral fresco o adecuadamente conservado para asegurar el aislamiento y la expansión de células con características de células madre viables.
