Name: El aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-10-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Aprende a aislar y expandir células madre de glioblastoma humano mediante el ensayo de neuroesfera. Este protocolo detalla la preparación tisular, disociación enzimática y cultivo in vitro para estudiar biología tumoral.

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Este trabajo fue apoyado por becas del Centro de Florida para la Investigación de Tumores Cerebrales, Preston A. Wells Jr. Centro de Terapia tumor cerebral.

1. La acumulación de tejido GBM primaria <ol><li> Un glioblastoma mutliforme (GBM) del tumor se obtiene de un paciente diagnosticado con el cáncer y someterse a una cirugía. </li><li> Se deben hacer arreglos con el equipo de neurocirugía. El neurocirujano lugar del tumor resecado GBM en un tubo de tamaño adecuado que contiene células madre neurales (NSC) medio basal suplementado con antibióticos 10-15% (Peniciline / estreptomicina). Medio frío se debe proporcionar a la sala de operaciones de laboratorio. Por otra parte, el frío HEPES buffer medio esencial mínimo (HEM) o tampón fosfato salino (PBS) con alta concentración de antibióticos también se pueden utilizar para este propósito. </li><li> El tejido del tumor resecado se entrega al laboratorio en hielo y se coloca bajo el capó. </li></ol> 2. La disociación de un tumor primario en una sola suspensión celular <ol><li> El exceso del medio original / PBS se retira el tubo de halcón y la muestra se lava 2-3 veces con 5-10ml de PBS / NSC medio de base para extraer la sangre y los escombros. El PBS / medio se elimina y el tejido tumoral GBM se coloca en una placa de Petri. </li><li> El tejido se corta en trozos pequeños y picados con una hoja de bisturí N º 10 en pequeños pedazos para aumentar la superficie para el proceso de tripsina. Picado puede tomar de 1-3 minutos, dependiendo del tamaño del tumor. </li><li> El tejido picado se trypsinized en 3-5ml de pre-calentado 0,05% de tripsina-EDTA durante 10-15 minutos en un baño de agua a 37 ° C. Una pipeta electrónica se utiliza para transferir las piezas tumor pequeño y tripsina en un tubo de 15 ml Falcon. </li><li> Un volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se agrega para detener la reacción enzimática con tripsina después del período de incubación. </li><li> Inactivación de la tripsina se garantiza con la pipeta de la suspensión hacia arriba y abajo varias veces. Luego, la suspensión se sedimentan por centrifugación a 800rpm (110 g) durante 5 minutos. </li><li> El sobrenadante se descarta y las piezas de tejido se resuspendió en 1 ml de agua estéril NSC basal media. Los grupos se disocian pipeteando suavemente arriba y abajo (3-7 veces) hasta que una suave suspensión lechosa sola célula se logra. El número de pasos de pipeteo depende directamente del tamaño de las partículas en el tejido picado. Disociación mecánica prolongada y vigorosa se debe evitar, ya que podría resultar en la muerte celular y una reducción en la formación de la esfera. </li><li> Para eliminar sin disociar las piezas y los escombros, 10-15 ml de medio basal se añade al tubo y la suspensión celular se filtra a través de un colador 40 micras de células en un tubo de 50 ml. </li><li> Se filtró la suspensión se centrifuga a 800rpm (110 g) durante 5 minutos. El sobrenadante se descarta después. </li><li> Pastillas de células son luego resuspendido en 1-2 ml de medio completo NSC para el recuento de células. </li></ol> 3. Recuento de células y Revestimiento <ol><li> 10 l de la suspensión celular se añade a 90 L de Trypan 0,04% azul en un tubo eppendorf 1 ml. Nota: otras células apropiadas diluciónciones también se puede utilizar. </li><li> Pipeta de arriba y abajo para mezclar la suspensión. 10 l de las células / mezcla de azul tripán se transfiere a hemocitómetro con el fin de contar con la densidad celular. </li><li> Las células se sembraron en medio completo NSC (una mezcla de medio basal NSC NSC y complementar la proliferación en una proporción de 9:01), complementado con 20ng/ml EGF, bFGF 10ng/ml y 1μl/ml del 0,2% con heparina (2μg/ml) en apropiado vasos de cultivo de tejidos. 5 ml, 20 y 40 de medio se utiliza para frascos T25, T80 y T175, respectivamente. Los antibióticos pueden ser añadidos al medio a una concentración de 1:100 para disminuir la posibilidad de contaminación. </li><li> El matraz se coloca en una incubadora a 37 ° C y 5% CO 2. </li></ol> 4. Pases y ampliación de las esferas GBM derivados: <ol><li> Cuando las neuroesferas alcanzado un tamaño promedio de 150 a 200 micras de diámetro, la cultura está listo para la subcultura. El contenido de cada matraz se retira y se coloca en un TISS tamaño estéril apropiadatubo ue la cultura, y se centrifuga a 800 rpm (110 g) durante 5 min a temperatura ambiente. </li><li> Se elimina el sobrenadante y el sedimento se resuspende en 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA. </li><li> Para lograr un óptimo tripsinización, la suspensión de células se incubaron a 37 º C en un baño de agua durante 2-3 min. Para detener la actividad de la tripsina un volumen igual de inhibidor de tripsina de soja se añade a la suspensión celular y la suspensión celular es ligeramente pipeta hacia arriba y abajo. </li><li> La suspensión celular se centrifuga a 800 rpm (110 g) durante 5 min. Luego, se retira el sobrenadante y las células se resuspenden en 1 ml de medio de NSC. </li><li> El recuento celular se realizó como se describió anteriormente. </li><li> Las células se sembraron a una concentración de 5x10 4 células / ml en medio completo NSC complementado con factores de crecimiento y se colocaron en recipientes de tamaño apropiado de cultivo de tejidos como se describe en la parte anterior. </li><li> Neuroesferas secundaria se forman en 7-10 días cuando se incuban a 37 ° C en un ambiente húmedoficados incubadora con 5% de CO 2. </li></ol> 5. Los resultados representativos: Después de la siembra de las células individuales cosechados a partir de tejido del tumor GBM, tumor, como las células madre proliferan y se generan pequeños grupos de células compone de unas pocas células en 3-4 días (ver el video y la Figura 1). A medida que estos grupos crecen, adquieren una forma más esférica, para que por 7-8 días, propias esferas fase brillante, con un diámetro promedio de 150 a 200 micrones forma (Vea el video y la Figura 2). A mayor aumento, las esferas de salud por lo general demuestran microspikes en su periferia. Tener gran esfera como racimos de 1-2 días después del inicio de la cultura se debe a la existencia de grupos no disociada de la borrachera de la cultura y no debe ser confundido con las esferas verdad. La cantidad de desechos en cultivo primario esfera tumor varía en función de la fuente inicial de los tejidos y si es o no incluye cualquier tejido cerebral circundante. Técnicas adecuadas de preparación de tejidosincluyendo la disociación enzimática y mecánica, y la posterior filtración de la muestra con una cantidad suficiente de medio puede resultar en menos residuos en la cultura. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Cultivo primario esfera GBM cuatro días después de la siembra. Madre tumorales-como las células proliferan y generan pequeños grupos de células en 3-4 días. Original de ampliación; 20x. <img src="/files/ftp_upload/3633/3633fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Paso una cultura de ámbito GBM ocho días después de la siembra. Original de ampliación; 20x.

<ol><li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Siebzehnrubl, F. A., Vedam-Mai, V., Azari, H., Reynolds, B. A., Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Characterization+of+Adult+Neural+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22+Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and Characterization of Adult Neural Stem Cells.</a> Methods Mol Biol. 750, 61-77 (2011).</li>
<li>Azari, H., Rahman, M., Sharififar, S., Reynolds, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Expansion+of+the+Adult+Mouse+Neural+Stem+Cells+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and Expansion of the Adult Mouse Neural Stem Cells Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (45), e2393-e2393 (2010).</li>
<li>Azari, H., Sharififar, S., Rahman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+Embryonic+Mouse+Neural+Stem+Cell+Culture+Using+the+Neurosphere+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay.</a> J. Vis. Exp. (47), e2457-e2457 (2011).</li>
<li>Eramo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+expansion+of+the+tumorigenic+lung+cancer+stem+cell+population%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Identification and expansion of the tumorigenic lung cancer stem cell population.</a> Cell Death Differ. 15, 504-514 (2008).</li>
<li>Patrawala, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+purified+CD44%2B+prostate+cancer+cells+from+xenograft+human+tumors+are+enriched+in+tumorigenic+and+metastatic+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells.</a> Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).</li>
<li>Li, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl.+Cancer.+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl. Cancer. Inst. 100, 672-679 (2008).</li>
<li>Galli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+tumorigenic%2C+stem-like+neural+precursors+from+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of tumorigenic, stem-like neural precursors from human glioblastoma.</a> Cancer Res. 64, 7011-7021 (2004).</li>
<li>Deleyrolle, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+label-retaining+tumour-initiating+cells+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Evidence for label-retaining tumour-initiating cells in human glioblastoma.</a> Brain. 134, 1331-1343 (2011).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Para aislar madre neurales y células progenitoras de adulto normal y el cerebro fetal 1, 2, 3, 4 y también madre tumorales-como las células de cáncer de los tejidos como el pulmón 5, 6 de próstata, mama y cerebro 7 8 9, el ensayo ha sido neuroesfera utiliza con frecuencia como el método de elección. El uso de este ensayo simple y reproducible, se puede generar un número indefinido de las células del tejido del tumor resecado que muestran características similares a las células madre somáticas; multipotencia ex vivo, la capacidad de crear nuevos tumores tras la implantación, y auto-renovación. Estas células podrían utilizarse para estudiar la biología de las células cancerosas básicas, incluyendo las interacciones de célula a célula, y la diferenciación, la migración de la invasión, y la muerte celular. Además, tumorales aisladas como células madre constituyen una herramienta valiosa para estudiar cómo se forman los tumores, el progreso, y la recaída, y también para desentrañar los mecanismos celulares subyacentes derivados que eventualmente podría aportar información a la terapéuticaopciones.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Tipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> NeuroCult NSC medio base (Humana) </td><td> Medio </td><td> Madre Cell Technologies </td><td> 05750 </td><td></td></tr><tr><td> NeuroCult NSC proliferación Suplementos (Humana) </td><td> Suplemento de medio </td><td> Madre Cell Technologies </td><td> 05753 </td><td></td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA </td><td> Reactivo </td><td> Gibco </td><td> 25300-062 </td><td></td></tr><tr><td> * MEM </td><td> Reactivo </td><td> Gibco </td><td> 41500-018 </td><td> HEM componente </td></tr><tr><td> * HEPES </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> H4034 </td><td> HEM componente </td></tr><tr><td> * Agua destilada </td><td> Reactivo </td><td&gt; Gibco </td><td> 15230-147 </td><td></td></tr><tr><td> ** DNasa I </td><td> Reactivo </td><td> Roche </td><td> 104159 </td><td></td></tr><tr><td> ** Inhibidor de tripsina de soja </td><td> Reactivo </td><td> Sigma </td><td> T6522 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina / estreptomicina </td><td> Reactivo </td><td> Gibco </td><td> 15140-122 </td><td></td></tr><tr><td> N º 10 hoja de bisturí </td><td> Herramienta quirúrgica </td><td> BD </td><td> 371610 </td><td></td></tr><tr><td> Petri </td><td> Cultura software </td><td> BD Falcon </td><td> 353003 </td><td></td></tr><tr><td> Pequeñas pinzas </td><td> Los instrumentos quirúrgicos </td><td> Herramientas de Bellas Ciencia </td><td> 11050-10 </td><td></td></tr><tr><td> Células colador </td><td> Tamiz </td><td> BD Falcon </td><td> 352340 </td><td></td></tr><tr><td> T25 frasco </td><td> Cultura software </td><td> Nalge Nunc internacionales </td><td> 136196 </td><td></td></tr><tr><td> T80 frasco </td><td> Cultura software </td><td> Nalge Nunc internacional </td><td> 178905 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de 15 ml </td><td> Cultura software </td><td> BD Falcon </td><td> 352096 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos de 50 ml </td><td> Cultura software </td><td> BD Falcon </td><td> 352070 </td><td></td></tr><tr><td> FCE </td><td> Factor de crecimiento </td><td> I + D </td><td> 2028-EG </td><td></td></tr><tr><td> b-FGF </td><td> Factor de crecimiento </td><td> I + D </td><td> 3139-FB </td><td></td></tr><tr><td> Heparina </td><td> Factor de crecimiento </td><td> Sigma </td><td> H4784 </td><td> Reconstituido en PBS </td></tr></tbody></table> * Para hacer HEM, mezcla de paquetes 1x10L del MEM and160ml de HEPES 1M y obtener un volumen de 8,75 L con agua destilada. Ajuste el pH final de 7,4 unad se almacena a 4 º C. ** Para preparar la solución de inhibidor de tripsina, en primer lugar hacer 10 ml de DNasa solución I (100 mg DNasa disueltos en 100 ml de HEM) y luego añadir 0,14 g de inhibidor de tripsina a la solución de DNasa y, finalmente, completar el volumen hasta 1 litro con HEM. Mantener las alícuotas de los productos finales en el congelador a -20 ° C.

el aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera

Isolation and Expansion of Human Glioblastoma Multiforme Tumor Cells Using the Neurosphere Assay

Como las células madre han sido aislados en los tumores, como mama, pulmón, colon, próstata y cerebro. Una cuestión fundamental en todos estos tumores, especialmente en mutliforme glioblastoma (GBM), es el de identificar y aislar células tumorales de la población de iniciar (s) para investigar su papel en la formación del tumor, la progresión y la recurrencia. Tumor comprensión de iniciar las poblaciones de células proporcionará pistas para encontrar enfoques terapéuticos efectivos para estos tumores. El ensayo neuroesfera (NSA), debido a su sencillez y reproducibilidad ha sido utilizado como el método de elección para el aislamiento y la propagación de muchas de estas células tumorales. Este protocolo demuestra el método de cultivo neuroesfera para aislar y expandir madre-como las células en el tejido resecado quirúrgicamente de tumores humanos GBM. Los procedimientos incluyen una digestión química inicial y disociación mecánica del tejido del tumor y, posteriormente, chapado a la suspensión celular resultante único de la cultura NSA. Después de 7-10 días, primaria neuroesferas de 150-200 micras de diámetro pueden ser observados y están listos para más pases y expansión.

Este protocolo de vídeo se muestra el aislamiento y la expansión de las células madre como de mutliforme resecado quirúrgicamente de glioblastoma humano (GBM) del tejido tumoral usando el método de ensayo de cultivo neuroesfera.

El aislamiento y la expansión de las células de glioblastoma humano multiforme tumor mediante el ensayo de neuroesfera

Se han aislado células con características de células madre en tumores como los de mama, pulmón, colon, próstata y cerebro. Un problema crítico en todos estos tumores, especialmente en...

El objetivo de este protocolo es el aislamiento y la expansión de células tumorales de glioblastoma multiforme humano utilizando el método de neuroesferas. Esto se logra primero mediante la picadura del tejido tumoral obtenido, seguido por disociación mecánica, y finalmente por la siembra de las células resultantes para su crecimiento en cultivo de neuroesferas. En este video, vamos a mostrar cómo aislar y expandir células con características de células madre a partir de tejido tumoral de glioblastoma humano utilizando el método de cultivo de neuroesferas.Este método también puede utilizarse para cultivar células de otros tumores cerebrales, así como de tumores sólidos como los de mama, próstata, hígado y pulmón. Bien, comencemos. Después de recibir el tejido tumoral de GBM resecado procedente de la cirugía, se elimina el medio.El tumor se lava dos o tres veces utilizando PBS estéril para eliminar contaminantes como sangre y restos celulares. Después del lavado, coloque el tumor resecado en una placa de Petri estéril. Primero, corte el tumor en porciones más pequeñas, luego transfiera una porción del tejido tumoral a una placa de Petri separada y triture el tejido con un bisturí número 10 hasta obtener trozos diminutos.Esto aumentará el área de superficie disponible para la disociación enzimática. La picadura puede tardar de uno a tres minutos, dependiendo del tamaño del tumor. Ahora agregue de tres a cinco ml de tripsina precalentada al tejido picado y transfiera la mezcla a un tubo falcon estéril de 15 ml.Coloque el tubo de 15 ml en un baño de agua a 37 grados durante 10 a 15 minutos. Agite el tubo cada cinco minutos. Para asegurar una mejor digestión del tejido, agregue un volumen igual de inhibidor de tripsina para detener la reacción.La activación de la tripsina se asegura pipeteando hacia arriba y hacia abajo varias veces. Centrifugue la suspensión a 800 RRP M o 110 G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante, luego resuspenda el pellet en un ml de medio basal para células madre neurales, colocando la punta contra el fondo del tubo.Pipetee de tres a siete veces hacia arriba y hacia abajo para deshacer grumos hasta obtener una suspensión lechosa; pipetear en exceso podría provocar la muerte celular. Coloque un filtro de 40 micrones sobre un tubo de 50 ml. Añada ahora 10 a 15 ml de medio basal a la suspensión celular y mezcle suavemente; haga pasar la suspensión celular a través del filtro de 40 micrones para eliminar restos y grumos no asociados.PT las células y retire el sobrenadante al vacío. Reuspenda las células en uno o dos ml de medio completo. Luego pipetee suavemente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la suspensión.Mezcle 10 microlitros de suspensión celular en 90 microlitros de azul de tripano. Mezcle bien la suspensión y transfiera 10 microlitros al hemocitómetro. Realice un recuento celular como se muestra aquí.Se requiere una suspensión de células individuales sin agregados para obtener un recuento celular preciso. No incluya células positivas para azul de trian. Al contar para sembrar las células en un matraz T 80.Añada 20 ml de medio completo para células madre neurales a un tubo de 50 ml. Añada la cantidad adecuada de suspensión celular para alcanzar una densidad de 200.000 células por ml. A continuación, añada EGF para obtener una concentración final de 20 nanogramos por ml.Añada heparina al 0,2 % en una concentración de un microlitro por ml. Finalmente, añada BFGF para alcanzar una concentración final de 10 nanogramos por ml. Mezcle las células en medio completo suplementado con factores de crecimiento.Luego transfiera la suspensión a un matraz T 80. Incube el matraz a 37 grados Celsius y 5 %CO2 durante siete a 10 días. Después de ocho días en cultivo, las esferas están completamente desarrolladas y listas para ser pasajeadas.Recolecte el contenido del matraz y transfiéralo a una centrífuga de 50 ml. Centrifugue las células a 800 RPM durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante, luego resuspenda el pellet en 1 ml de tripsina precalentada.Incube las células en baño de agua a 37 grados Celsius durante dos minutos. Añada una cantidad igual de inhibidor de tripsina y mezcle bien para asegurar una activación. Luego, pelete las células.Elimine el sobrenadante y resuspenda las células en un ml de medio completo, pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para homogeneizar la suspensión celular. Realice un recuento celular como se describió anteriormente para sembrar las células en un frasco T80 con 20 ml de medio completo en un tubo de 50 ml. Añada una cantidad adecuada de suspensión celular para alcanzar una densidad de 50.000 células por ml.Ahora agregue factores de crecimiento, incluyendo E-G-F-B-F-G-F, y heparina a la concentración descrita anteriormente. Mezcle suavemente la suspensión celular resultante, luego transfiera la suspensión a una botella T 80 y colóquela en el incubador durante siete a 10 días. Este es un ejemplo de cultivo primario de GBM.Después de cuatro días en esta etapa, puede observarse que las células se están proliferando y comenzando a formar esferas. No debe observar grandes agrupaciones esféricas de células en esta etapa. Esto habría resultado de una preparación inadecuada del tejido.Después de estar en cultivo durante siete a 10 días, se han formado esferas de diferentes tamaños; cuando las esferas alcanzan un diámetro promedio de 150 a 200 micrones, están listas para ser pasajeadas. Este es un ejemplo de un cultivo de GBM en pase después de ocho días. Nuevamente, se pueden observar esferas de distintos tamaños; las esferas sanas presentan microespículas en su periferia.La preparación de una suspensión de células individuales es un aspecto muy importante en cualquier cultivo de esferoides. De lo contrario, podría terminar observando agregados celulares incluso al día siguiente de sembrar las células. Estos agregados podrían asumirse como esferas, pero debe tenerse en cuenta que los células perforantes necesitan al menos una semana para formar esferas verdaderas.La cantidad de desechos en el cultivo de esferas de tumor primario varía según muchos factores, como el origen del tejido, la precisión con la que se ha extirpado el tejido y la técnica de procesamiento del tejido. Esperamos que este video sea útil y le deseamos buena suerte en sus experimentos.

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Investigación

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Neurociencia

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