Transferencia de genes a la oreja del ratón en desarrollo por el interior En Vivo La electroporación

Jane se transfirió al oído interno del ratón en desarrollo por electroporación in vivo Ling Wang, Han Jang y John Burgandy, Centro de Investigación Auditiva de Oregón, Universidad de Salud y Ciencia de Oregón. Mi nombre es John Burgandy. Mi laboratorio está en el Centro de Investigación Auditiva de Oregón en la Universidad de Salud y Ciencias de Oregón.

Mi nombre es Ang. Soy un póster en el laboratorio de Johns. También estoy en el laboratorio de Johns como asistente de investigación.

Nuestra presentación se divide en cuatro partes. La primera es la laparotomía ventral. Demostramos la pluma de sodio, la anestesia basada en barbital, cómo probar la idoneidad de la anestesia, la protección de la córnea, la preparación del sitio quirúrgico, la desinfección de la hoja de datos de la cirugía de supervivencia en ratones, la incisión de la línea media ventral de la suite quirúrgica a través de la piel y la pared abdominal y la externalización de los cuernos uterinos.

La segunda parte es la microinyección transuterina. Demostramos la iluminación trans del embrión, el embrión, la reorientación, la microinyección, la pipeta, la fabricación y la microinyección en el Otis en el día embrionario 11.5 y el día embrionario 12.5. La tercera parte es la electroporación in vivo.

Demostramos la colocación de electrodos estilo paleta y la electroporación de la asistencia de ratón O del día 11.5 embrionario. La cuarta parte son los resultados representativos. Mostramos la expresión de GFP en cócleas embrionarias tardías y postnatales tempranas.

Esto fue el resultado de la electroporación in vivo del plásmido Otis con expresión en la laparotomía ventral del día embrionario 11.5 parte uno. La madre se sujeta de forma segura agarrando la piel detrás del cuello, la cola y la extremidad trasera izquierda. Se administra una inyección intraperitoneal de anestésico a base de pentobarbital sódico después de frotar el abdomen con etanol al 70%.

El ratón se coloca dentro de su jaula doméstica durante cuatro o cinco minutos para permitir que el anestésico actúe. Se utilizan pinzamientos en el pie y la cola para evaluar la idoneidad de la anestesia. Esta presa se cierra en respuesta al pellizco de la cola y necesita dos minutos más antes de dejar de responder a los estímulos nocivos.

El ungüento oftálmico estéril se aplica a los ojos para proteger las córneas de la desecación. Preparamos el sitio quirúrgico en una campana de gases químicos para minimizar la propagación de pelo y caspa. El pelaje se afeita con una cuchilla fina para exponer la piel que cubre la pared abdominal.

La eliminación completa del pelo facilita la cicatrización de la incisión en el postoperatorio. La desinfección de la piel abdominal se logra alternando pases de etanol al 70% betadina y etanol al 70%. Siempre deslice el dedo de rostral a mimo y use una bola de algodón quirúrgico nueva o un aplicador con punta de algodón.

Para cada pasada, evaluamos la profundidad y la calidad de las respiraciones durante la desinfección para asegurarnos de que la presa no responda Después, después de la segunda pasada de etanol al 70%, colocamos inmediatamente la maldita superficie ventral sobre una cortina estéril y la colocamos en una almohadilla térmica durante dos o tres minutos para calentarla. Este es un momento conveniente para registrar los datos preoperatorios en la hoja de registro de cirugía de supervivencia del ratón. Tenemos adjunta nuestra ficha técnica de cirugía de supervivencia en ratones como información complementaria.

Considere incluir la hoja de datos y su protocolo de cuidado animal para que su comité institucional de cuidado y uso de animales pueda ver cómo controlará los datos preoperatorios, operativos y postoperatorios. Completamos una hoja de registro para cada sujeto quirúrgico. Preferimos realizar la cirugía en un entorno estéril, aunque esto generalmente no es necesario para los roedores.

La superficie de trabajo está separada del motor del soplador y de la carcasa del plenum, por lo que no se transmite ninguna vibración al usuario. Durante la microinyección, hemos agregado como información complementaria un esquema de las modificaciones que hicimos a nuestra campana de flujo laminar para facilitar la transferencia de genes en el útero, los cambios esenciales son el bajo desafío de wat y los recortes de iluminación de pista y los receptáculos ocultos para los cables de alimentación de los instrumentos, y una ruta de enrutamiento para los circuitos eléctricos accesorios. El quirófano consta de la bolsa intravenosa eléctrica de timbres lactatos, baño tibio, XY, manipulador Z, fluorescencia estereoscópica, microscopio de disección, fuente de luz de fibra óptica e instrumentos quirúrgicos.

Los pedales se utilizan para activar el micro inyector, electro perter entrar en el foco. Los instrumentos quirúrgicos del endoscopio se esterilizan en un autoclave. Los instrumentos deben volver a esterilizarse entre ratones utilizando un esterilizador de perlas de vidrio o volviendo a esterilizar en autoclave el destornillador de agujas.

Las tijeras, las pinzas de anillo y las pinzas vasculares de Balli son las herramientas esenciales. Incisión ventral en la línea media, agarre la piel con pinzas vasculares y extirpe el tegumento con las tijeras con punta de bola, extienda la incisión de 10 a 14 milímetros. Identifique la banda avascular blanca de tejido conectado llamada línea alba y la línea media ventral del abdomen, haga una incisión en la alba lineal con las tijeras con punta de bola.

Tener cuidado de no cortar el intestino o las almohadillas de grasa inguinal. Irrigar inmediatamente el abdomen con una solución estéril de ringer lactato precalentada. Evalúe los sitios de incisión en la piel y la pared abdominal para ver si hay sangrado.

La presión directa con pinzas romas detendrá el sangrado menor si está presente, exteriorice los cuernos uterinos derecho e izquierdo con pinzas con punta anular. Sujete suavemente el cuerno uterino derecho con un extremo anillado de la pinza y tire del útero hacia la incisión de la línea media. Use su mano libre para manipular suavemente el lado lateral de la presa para facilitar el enganche del útero.

Las pinzas nunca se usan para comprimir el útero y sacarlo. Dado que esto podría dañar la vasculatura uterina o los embriones, repita el procedimiento de externalización para el asta uterina izquierda. Irrigar inmediatamente los cuernos uterinos recién externalizados con una solución de ringer lactato precalentada, reinsertar suavemente las almohadillas de grasa inal o los intestinos en caso de que se exterioricen con el útero.

Esto no se encuentra a menudo. Segunda parte: microinyección uterina. La presa está dispuesta debajo del objetivo de larga distancia de trabajo y una luz de fibra óptica de cable suave se coloca contra la pared uterina.

El útero se presiona suavemente con un dedo de la mano libre. Facilitar la identificación de la orientación del embrión. La luz del cable de fibra óptica debe tener la intensidad más baja requerida para evaluar con precisión la orientación del embrión.

La luz intensa puede transmitir calor al útero que puede causar complicaciones. Sostenemos la luz de fibra óptica y el útero en una mano y usamos un dedo en nuestra mano libre para reposicionar el embrión mediante una palpación suave. Demostramos en los siguientes tres videos por microscopía clips de EC y las orientaciones embrionarias comunes observadas por el útero.

El espectador verá la vista microscópica que vemos durante la iluminación trans, aunque en blanco y negro la iluminación trans del útero permite la detección de la orientación del embrión in vivo. En este ejemplo, el embrión está en posición de cabeza con la superficie ventral mirando hacia el espectador. Al mover el útero hacia adelante y hacia atrás, podemos detectar las extremidades traseras derecha e izquierda, la cola y el céfalo del ojo izquierdo.

En este ejemplo, el embrión está de nuevo en la posición de parada de cabeza, pero girado unos 90 grados con respecto al eje anteroposterior. Al mover el útero suavemente hacia adelante y hacia atrás, podemos ver las formas de paleta que definen la extremidad trasera izquierda y la extremidad izquierda por extremidad. El cerebro posterior también es evidente.

El embrión está en posición vertical con su lado izquierdo mirando hacia el espectador. El naciente cuarto ventrículo es detectable como una mancha brillante en el cerebro posterior. También son evidentes el céfalo del ojo izquierdo, las cuatro extremidades izquierdas y las extremidades traseras izquierdas.

La presión suave sobre el útero reorienta ligeramente los embriones para permitir la detección del tronco principal de la vena principal primaria y sus ramas anterior y posterior, que están marcadas con asterisco blanco y negro respectivamente. Como veremos, el Otis se encuentra a medio camino entre las ramas anterior y posterior de la vena principal primaria. El Otis mismo no puede ser visto a través del útero por transiluminación.

Demostramos en dos clips de microscopía de vídeo sucesivos cómo reorientar el embrión para la microinyección en el Otis assist. El objetivo es identificar los puntos de referencia embrionarios que permitan interpolar la ubicación del otis en la cabeza lateral. Nuestro objetivo es reorientar el embrión de la posición dorsal a la lateral para poder identificar la vena principal de la cabeza.

El mesencéfalo, el cuarto ventrículo y el miembro izquierdo son evidentes en posición dorsal. Una suave presión sobre el útero cambia la orientación del embrión de dorsal a posterior. El céfalo del ojo izquierdo, el mesencéfalo y el cuarto ventrículo son evidentes.

La vena principal primaria y su rama posterior indicada por el asterisco también son obvias. La rama anterior de la vena principal primaria no se detecta claramente. Nuestro objetivo, de nuevo, es orientar el embrión para que pueda identificar la vena principal primaria, pero con un aumento más alto apropiado para la microinyección uterina.

Los vasos uterinos, la banda decidual y el ojo izquierdo se ven en esta perspectiva lateral. Una suave presión sobre el útero cambia la posición del embrión, por lo que podemos detectar el cuarto ventrículo izquierdo, el ojo. La vena principal de la cabeza y su rama posterior marcada con el asterisco, la vena principal primaria y sus ramas forman la forma de montantes de fútbol americano.

La vesícula ótica no se puede ver a través del útero, pero se encuentra en el centro de los montantes. Lynn ha iniciado una secuencia de inyección para un embrión. Ilumina el útero de forma trans, reorienta el embrión para una microinyección y lleva al campo la pipeta de microinyección llena de verde rápido.

La pipeta de microinyección está unida a un soporte de pipeta que se sostiene mediante un manipulador de micrómetros X, Y, z. El soporte magnético del manipulador está unido a una placa de acero con una base de teflón que permite el posicionamiento bruto sin esfuerzo de la pipeta de microinyección. La aguja avanza usando la perilla de control del micrómetro hacia adelante en el manipulador de manera adecuada.

Las pipetas fabricadas son esenciales para una microinyección traumática en el embrión de ratón en etapa temprana de Otis. Tiramos de tubos capilares de vidrio borosil de paredes gruesas con un extractor de pipetas horizontal. La pipeta resultante que se muestra en A se rompe manualmente con pinzas a aproximadamente la posición de diámetro exterior de 14 a 16 micras indicada por la punta de flecha en B. La rotura rugosa de la pipeta que se muestra en C es dentada y frágil.

Biselamos la pipeta a unos 20 grados para afilar la punta de la pipeta, como se ve en el Panel D, los parámetros para tirar y biselar las pipetas de microinyección se proporcionan en el texto adjunto. En los dos clips de microscopía de vídeo siguientes se muestra la microinyección en el ratón con asistencia ótica en los días embrionarios 11,5 y 12,5. Nuestro objetivo es demostrar la microinyección uterina en el día embrionario, 11,5 veces en ratones.

En primer lugar, inyectamos los óticos sin la presencia del útero para mostrar sin ambigüedades cómo aparece una inyección correctamente dirigida. A continuación, demostramos la auténtica microinyección transuterina. Para esta primera inyección, se realizó una incisión en el útero para permitir que el saco visceral extruyera la banda decidual que recubre el saco vitelino visceral.

La placenta permanece adherida al útero y el embrión está vivo. Con el útero extirpado focalmente, vemos el cuarto ventrículo, la vena primaria de la cabeza y sus ramas anterior y posterior, la pipeta y la ubicación aproximada del quiste en blanco. Al comienzo de esta secuencia de inyección, se detecta flujo sanguíneo en la vasculatura del saco vitelino visceral.

La pipeta se avanza a través del saco vitelino visceral y se inyecta dai en la nota de osis, el conducto endolinfático dorsalmente y la posición de los óticos en el centro de los montantes. La ótica se encuentra a medio camino entre las ramas anterior y posterior de la vena principal primaria, microinyección uterina en el día embrionario. 11.5 La ótica del ratón requiere la detección de la vena principal primaria y al menos una de sus ramas para estimar la ubicación de la asistencia ótica.

Nuestro objetivo en este ejemplo esquemático, tanto las ramas anterior como posterior de la vena principal primaria se detectan con el territorio OUC marcado en blanco. Una presentación más realista del embrión es aquella en la que se detecta el tronco principal de la vena principal principal junto con solo una de sus ramas y en el ejemplo mostrado solo se ve la rama posterior de la vena principal primaria, pero eso es suficiente para interpretar la ubicación de los óticos. El TP avanza a través del útero y se inyecta un tinte en los óticos.

Esperamos 30 segundos para permitir que el tinte se elimine de la cavidad amniótica, momento en el que podemos ver el conducto endolinfático dorsalmente y el vestíbulo. Concluimos con una vista de bajo aumento del embrión cuyo quiste acabamos de inyectar para proporcionar perspectiva anatómica, en esta vista se ven el cuarto ventrículo, el ojo izquierdo y la vasculatura uterina. Demostramos trans y microinyección en el quiste ótico embrionario del ratón del día 12 y microinyección en el cuarto ventrículo naciente del cerebro posterior.

La transiluminación nos permite detectar la vena principal de la cabeza en esta vista lateral izquierda, así como el ojo. La pipeta avanza a través del útero hasta la vesícula ótica y muere para llenar su luz. Para inyectar el cuarto ventrículo, giramos el embrión 90 grados para obtener una vista dorsal del cerebro posterior.

El quiste izquierdo inyectado ahora está en el lado izquierdo. La pipeta se avanza a través del útero y se mezcla rápidamente con lor. El dextrano conjugado se inyecta en el cuarto ventrículo.

Obsérvese que el volumen de colorante inyectado no entra en el mesencéfalo in vivo. La fluorescencia se evalúa después de la inyección para validar la localización del dextrano en el cuarto ventrículo. A continuación, el embrión se reorienta de la posición dorsal a la lateral.

El conducto endolinfático es justo ventral al cuarto ventrículo en esta vista lateral. La fluorescencia in vivo valida la localización del dextrano en el cuarto ventrículo. Al nacer, examinamos a las crías para detectar fluorescencia verde en el cuarto ventrículo utilizando una epifluorescencia.

Las crías de microscopio de disección con fluorescencia verde en sus cerebros posteriores poseen un oído interno que fue manipulado durante la embriogénesis en la tercera parte de la electroporación in vivo. Después de llenar el quiste con plásmido de expresión, el útero se irriga recién irrigado con una solución de ringer lactato precalentada. La transiluminación facilita el centrado del quiste ODU en el campo de electrodos.

La cabeza metálica de la luz de fibra óptica se retrae de la superficie uterina. Antes de iniciar el tren de pulsos de onda cuadrada, demostramos en el siguiente clip de microscopía de vídeo un ciclo completo de electroporación in vivo. La electroporación del día embrionario, el quiste ótico de ratón 11.5 requiere la colocación suave de los electrodos tipo paleta en el útero.

En este ejemplo, el quiste ótico izquierdo se ha llenado con plásmido de expresión y el útero se ha irrigado recientemente con ringers lactatos. El cátodo se coloca lateralmente con respecto al quiste ótico lleno y el y se coloca medialmente al comienzo de la secuencia de ación, el quiste ótico se centra en el campo de paleta. El útero se comprime suavemente y el tren de pulsos de onda cuadrada se inicia con un interruptor de pedal.

Lo ideal es que se entreguen de 60 a cien miliamperios de corriente por pulso. A continuación, se libera el útero y se irriga inmediatamente. El útero recién irrigado se devuelve a la cavidad abdominal mediante una suave presión con las pinzas anulares.

Una vez que el útero está internalizado, la cavidad abdominal se enjuaga con aproximadamente cuatro milésimas de pulgada de ringers lactatos, dejando aproximadamente una milésima de pulgada de ringers lactatos en la cavidad abdominal para ayudar a mantener la hidratación de la madre, que beberá menos agua de lo habitual inmediatamente después de la cirugía abdominal. La pared abdominal y luego la piel se cierran con una sutura reabsorbible con un destornillador de aguja. Nuestro destornillador de agujas tiene una tijera incorporada que simplifica el cierre.

Preferimos una puntada corrida tanto para la pared abdominal como para la piel. Bloqueamos cada dos puntos para proporcionar soporte adicional en el sitio de la incisión. Administramos un medicamento antiinflamatorio no esteroideo por vía subcutánea antes de colocar la madre en la jaula de recuperación.

Consulte con su personal veterinario sobre qué analgésicos profilácticos son los preferidos por su comité institucional de cuidado y uso de animales. La presa se encuentra en una cortina estéril y se coloca en el suelo de la jaula de recuperación calentada. La jaula de recuperación contiene material de anidación, un tubo rojo para cubrirse, comida de laboratorio y una botella de agua.

La jaula se vuelve a ensamblar con un bonete de filtro en la parte superior la mañana después de la cirugía. La madre está bellamente acicalada, deambulatoria y puede equilibrarse sobre sus extremidades traseras para preguntar sobre la parte superior de la jaula abierta. La línea de sutura en el abdomen está limpia, seca y no muestra evidencia de separación, enrojecimiento o hinchazón.

Hemos adjuntado un documento que discute el desarrollo de protocolos de cuidado animal para la transferencia de genes en el útero. El documento contiene un lenguaje que puede ser útil a medida que diseña un protocolo específico de la institución en consulta con su comité de cuidado y uso de animales. Cuarta parte, resultados representativos.

Los paneles de resultados representativos A y B muestran una cóclea representativa de una cría postnatal de sexto día a la que Otis se le inyectó un plásmido de expresión de proteína fluorescente verde mejorado en el día embrionario 11.5 y luego electro. La pared lateral coclear se extirpó desde la mitad del término y el ápice. Solo la expresión de GFP está presente desde la base hasta la mitad del término de la cóclea y sigue la distribución del marcador de células ciliadas, la miosina siete A, que se muestra en el panel B. El panel C muestra una proyección confocal de bajo aumento del día embrionario.

18.5 Órgano de ratón de Corde inmunoteñido con un anticuerpo de miosina siete A: Las células transfectadas se distribuyen por todo el órgano de Corde. El panel D muestra una proyección confocal de gran aumento del día embrionario. 18.5 Órgano de ratón de Corde teñido con cin. Siete.

Se detecta una expresión de GFP en las células ciliadas internas y externas, las células interfalángicas, las células pilares y las células TER. Transferencia génica mediada por electroporación al Otis en el día embrionario 11.5 Transfect progenitores que dan lugar a todos los tipos de células componentes dentro del órgano de corde.