La cuantificación de la colonización por hongos, esporogenesis y producción de micotoxinas mediante bioensayos del núcleo

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar con precisión la biosíntesis, el deterioro y el crecimiento de micotoxinas con el fin de estudiar las interacciones moleculares entre los hongos de las semillas. Esto se logra configurando primero un bioensayo de kernel. A continuación, se enumeran las cedia, luego se cuantifican las micotoxinas.

Por último, se mide la biomasa fúngica. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran los efectos de la fisiología de la semilla en el desarrollo de la reproducción y el metabolismo secundario de hongos micotoxigénicos mediante la cuantificación de biomasa de kedia y metabolitos secundarios utilizando técnicas de enumeración de esporas acopladas a cromatografía líquida de alta resolución. La principal ventaja de propagar esta técnica es estandarizar los métodos en varios laboratorios para que los resultados de diferentes laboratorios se puedan interpretar de forma cruzada.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones moleculares de los microbios de las semillas, como el modo en que los hongos patógenos secuestran el metabolismo de los lípidos de las plantas como una estrategia virulenta. Por lo general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque las diferentes cepas de angi exhiben diferentes crecimientos y patrones de desarrollo. Por lo tanto, es imperativo que optimice las condiciones para la interacción de su semilla de hongo favorita dos semanas antes de realizar el laberinto.

Cultivo de bioensayo de kernel. Los patógenos fúngicos en agar papa dextrosa o PDA a 28 grados centígrados. Cuando esté listo para comenzar, seleccione granos similares en edad, forma y tamaño, y colóquelos en tubos de 50 mililitros. Superficie.

Esterilizar los granos añadiendo etanol al 70% y agitando los tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agitar con agua estéril durante un minuto y con hipoclorito de sodio al 6% durante 10 minutos. Enjuague con agua estéril tres veces y agite durante cinco minutos cada una.

Luego, seque los granos con toallas de autoclave para infectarlos con aspergillus flavus. Use una aguja de calibre 18 para crear una pequeña herida de 0,5 centímetros de profundidad en el lado del embrión de cada grano. Para una infección por vértices de fusarium, usa una cuchilla de afeitar para hacer un corte de 0,5 milímetros de profundidad.

Prepare la suspensión de inóculo añadiendo cinco mililitros de solución de autoclave al 0,1% de 20 a las placas cultivadas y utilice un esparcidor de células para raspar las esporas. Retire el micelio por gravedad, filtrando la solución a través de al menos cuatro capas de gasa de autoclave. Use un hemocitómetro para calcular la concentración de esporas y ajústela para atender las seis esporas por mililitro.

Para ambas especies fúngicas. Crea una cámara de humedad en un recipiente de plástico forrándola con cinco hojas de toallas de papel y agregando 100 mililitros de agua estéril. A continuación, coloque cuatro granos en cada autoclave.

Vaso de 20 mililitros en vial de instalación. Péselos y anote su masa. Agregue 200 microlitros de suspensión de esporas a cada tapa de vial y vórtice para cubrir uniformemente los granos con la suspensión.

A continuación, afloje los tapones para permitir libremente el intercambio de aire y coloque los viales en la cámara de humedad. Incubar los granos bajo un período de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad a 28 grados centígrados durante siete días o hasta que se desee Después del período de infección, agregue cinco milímetros de autoclave 0.01% entre 20 a los viales de simulación que contienen granos infectados y vórtice a fondo durante un minuto. Con una punta de pipeta VRE ancha, diluya inmediatamente la suspensión de esporas transfiriendo dos alícuotas separadas de 200 microlitros a dos tubos de einor de mililitros que contengan 1,8 mililitros de 0,01%Tween 20.

Use un hemocitómetro para contar cada alícuota dos veces. Para cuantificar la aflatoxina, agregue los granos de una sola muestra en una taza de licuadora de 50 mililitros con 20 mililitros de metanol al 80% y 0,05 gramos de cloruro de sodio. Cubra y mezcle a alta velocidad durante un minuto.

Coloque un papel de filtro fluido sobre un recipiente de recolección limpio y vierta el extracto en el filtro. Transfiera 10 mililitros de filtrado a un recipiente limpio. Agrega 20 mililitros de agua destilada y mezcla bien.

Filtre la muestra a través de un filtro de microfibra de vidrio de 1,5 micras en una taza limpia. Aplique un mililitro de extracto filtrado a una columna de prueba de ALE y, con aire comprimido, fuerce el extracto filtrado a través de la columna a una velocidad de una a dos gotas por segundo. Lave la columna dos veces con un mililitro de agua destilada pasándola a través de la columna a una o dos gotas por segundo hasta que salga aire.

Eluir la columna con un mililitro de metanol 100% de grado HPLC a una tasa de una a dos gotas por segundo recolectadas en un Glass Q Vet. Agregue un mililitro de revelador de prueba de cerveza al EIT y mezcle bien. Coloque el Q VET en un fluorímetro calibrado y léalo a los 60 segundos Para el análisis de acina B uno o FB uno, agregue 10 mililitros de una solución 50-50 de ensayo de acetónido en agua a cada muestra de bioensayo de grano y extráigalo durante la noche a temperatura ambiente sin agitación.

Mezclar el extracto con seis mililitros de agua desionizada y aplicarlo a una columna de fase sólida C 18 que ha sido precondicionada con dos mililitros de nitrilo de acetilo, seguidos de dos mililitros de agua. Después de cargar la muestra, lavar la columna con dos mililitros de agua, seguidos de dos mililitros de nitrilo acetil en agua. Eluir la muestra que contiene FB para análisis por HPLC con dos mililitros de nitrilo acetil en agua.

Derivatizar el FB transfiriendo un mililitro de la columna EIT a un vial que contenga 0,1 mililitros de tampón de borato y 0,1 mililitros de aldehído e incubar durante 10 minutos. Detenga la reacción agregando 0,5 mililitros de una solución de nitrilo de acetilo y ácido bórico 0,01 molar. Analice FB uno por HPLC utilizando un gradiente lineal de acetil nitrilo 0,1 molar de fosfato sódico.

Compare las muestras con una curva estándar FB para analizar el cultivo de esteroles, el hongo en el maíz durante siete a 14 días. Después del período de incubación, agregue 10 mililitros de metanol de cloroformo a cada vial. Agite bien las muestras y luego incube los viales en la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas.

Centrifugar las muestras a 5.000 rpm durante tres minutos. A continuación, filtre el sobrenadante a través de una membrana de nailon de 0,45 micras. Inyecte la muestra directamente en una columna de HBLC y eluda con metanol al 100% a un caudal de 1,5 mililitros por minuto.

Cuantifique las muestras comparando las áreas de los picos con una curva estándar generada a partir de grado de HPLC o goole. Después de la inoculación e incubación en una cámara de humedad durante dos o tres días. El crecimiento de hongos debería comenzar a aparecer en los granos como se muestra aquí.

El crecimiento vegetativo posterior al tratamiento de los años setenta en los granos inoculados debe ser claramente visible, mientras que los controles simulados deben estar no infectados, los períodos de incubación más largos son propicios para un crecimiento vegetativo más copioso. Esta figura muestra que un flavus tipo silvestre NR RL 3 3 5 7 mostró valores máximos de colonización, aflatoxina, acumulación y producción de kedia a los cuatro, seis y ocho días respectivamente. Sin embargo, cuando se comparó la contaminación por micotoxinas y la ción por unidad de rol, los niveles más altos se observaron a los cuatro y seis días respectivamente.

Aquí se muestra el representante de la fumonisina y el rol de los cromatogramas de HPLC utilizando los métodos que se muestran en este video. Los niveles de fumonisina oscilan entre 3.500 y 8.000 nanogramos por gramo de grano y los niveles de ROL oscilan entre 5.000 y 10.000 nanogramos por gramo de grano. Una vez realizados los bioensayos del grano, la biomasa fúngica, las micotoxinas y la biomasa fúngica pueden medirse en un plazo de dos a cuatro días, dependiendo del número de muestras experimentales.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar llevar a cabo los métodos en un campo lo más estéril posible después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como fito, armónicos, lipidómica y proteómica, transcriptómica u otros métodos interatómicos para responder preguntas adicionales como qué genes, proteínas y vías hormonales están involucradas en estas importantes interacciones entre reinos.