Name: La cuantificación de la colonización por hongos, esporogenesis y producción de micotoxinas mediante bioensayos del núcleo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Aprende a cuantificar micotoxinas y crecimiento fúngico en semillas mediante bioensayos del núcleo. Este método estandarizado facilita el estudio de interacciones planta-patógeno entre laboratorios.

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Nos gustaría dar las gracias a Brandon Hassett y Carlos Ortiz por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por la NSF subvenciones IOB-0544428, el IOS-0951272, 0925561 y IOS-con el Dr. Michael Kolomiets, y por el Instituto Nacional del USDA de Alimentos y Agricultura (NIFA), Mejoramiento Vegetal y AFRI Educación Grant # 2010-85117 -20539 a los Dres. Seth Murray, Isakeit Thomas y Michael Kolomiets.

1. Bioensayo grano de maíz <ol><li> Dos semanas antes, la cultura de los hongos patógenos en Agar Papa Dextrosa (PDA) a 28 ° C. </li><li> Seleccione granos con un tamaño y forma similar, preferentemente plana por lo que estaba a nivel con la parte inferior de los viales de bioensayo, y el lugar en 50 ml tubos Falcon. Granos seleccionados deben haber sido producidos simultáneamente en un mismo entorno para asegurarse de edad de la semilla o composición similar metabolito. </li><li> Surface esterilizar núcleos agitando los tubos a temperatura ambiente durante 5 minutos con 70% de etanol, 1 minuto con agua estéril, y 10 minutos con hipoclorito de sodio al 6%. Enjuague tres veces, durante 5 minutos cada vez, con agua estéril y agitando continua. Séquelos con toallas esterilizadas de granos. </li><li> Para facilitar la infección de Aspergillus flavus, crear una pequeña herida en el embrión del lado con una aguja de 18 G a la profundidad de 0,5 cm. Sin embargo, en nuestra experiencia una herida más grande es necesario para la infección por Fusarium verticillioides. Therefore, utilizar una hoja de afeitar para cortar en el embrión del lado a una profundidad de 0,5 mm. </li><li> Preparar suspensión del inóculo raspando placas cultivadas en aproximadamente 5 ml de autoclave 0,01% de Tween-20 solución para liberar las esporas y eliminar micelio por filtración a través de la gravedad por lo menos 4 capas de gasa autoclave. Calcular la concentración de esporas con hemocitómetro y ajustar a 10 6 esporas / ml para A. flavus o F. verticillioides. Si se utiliza otra especie de patógeno o huésped, es importante para evaluar las concentraciones de inóculo para la infección apropiado. </li><li> Crear una cámara de humedad en un recipiente de plástico (29,2 cm X 18,7 cm X 8,3 cm) forrada con cinco hojas de toallas de papel y 100 ml de agua estéril. Sala no es de agua o hermético y el agua se debe agregar todo experimento para mantener las toallas de papel húmedo. </li><li> Coloque los cuatro núcleos en un autoclave 20 ml vial de centelleo de vidrio y registrar su masa. Se inoculan con 200 l suspensión de esporas,la tapa, y agitar a los huesos de cubrir bien con la suspensión. Afloje las tapas para permitir el libre intercambio de aire y el lugar en la cámara de humedad. </li></ol> Nota: Para las semillas u hongos distintos de los descritos en estos métodos, la cantidad de inóculo requerida puede ser diferente y debe ser establecido de forma experimental. <ol start="8"><li> Incubar los granos bajo un fotoperíodo 12-h-light/12-h-dark a 28 ° C durante 7 días o hasta que se desee. </li></ol> 2. Enumeración conidios <ol><li> Después del período de infección, añadir 5 ml de autoclave 0,01% de Tween-20 a viales de centelleo que contienen granos infectados y mezclar bien durante 1 minuto. </li><li> Usando una punta de gran calibre pipeta, inmediatamente diluir mediante la transferencia de dos separadas 200 ml de alícuotas de la suspensión de esporas en 2,0 ml tubos Eppendorf conteniendo 1,8 ml de 0,01% de Tween-20 (o diluir como sea necesario dependiendo de la infección). </li><li> Enumerar cada una alícuota de 200 l dos veces con un hemocitómetro 4y comparar los niveles de conidios entre los tratamientos. </li></ol> 3. La cuantificación de aflatoxinas <ol><li> Añadir núcleos a partir de 1 muestra a 50 ml de taza mezcladora con 20 ml de 80% de metanol y 0,05 g de NaCl, la cubierta y la mezcla a alta velocidad durante 1 minuto. </li><li> Colocar un filtro plegado sobre un recipiente de recogida limpia y se vierte en extracto de filtro. </li><li> Transferir 10 ml de filtrado a un recipiente limpio y añadir 20 ml de H 2 O destilada y mezclar bien. </li><li> Filtro de la muestra a través de un filtro de microfibra de vidrio de 1,5 m en una taza limpia. </li><li> Aplicar 1 ml de extracto se filtró a la columna de prueba Afla y, utilizando aire comprimido, forzar el extracto se filtró a través de la columna a una velocidad de 1-2 gotas por segundo hasta vaciados. </li><li> Lavar la columna dos veces con 1 ml de H 2 O destilada y pasar a través de la columna a 1.2 gotas / segundo hasta que el aire llega a través de. </li><li> La columna se eluye con 1 ml de metanol al 100% grado HPLC en una caída de 2.1 / segunda tasa recogida en una cubeta de vidrio. </li><li> Añadir1 ml de desarrollador de pruebas Afla de eluido y mezclar bien. Coloque la cubeta en fluorómetro calibrado y leído en 60 seg. </li></ol> Nota: Cuando se utiliza el protocolo de Aflatest FGIS, la medición de la fluorómetro se calcula en base a un período inicial de 50 gramos de muestra extraída en 100 ml. Si se tiene en cuenta la dilución de la muestra con agua, 1 ml de la aplica a una columna representa 0,166 gramos de muestra. Por lo tanto, al modificar el protocolo, es necesario tener en cuenta las diferencias en el tamaño de la muestra y la solución de extracción inicial. Por ejemplo, 2 gramos de granos se extraen en 20 ml de metanol 80%. Esto es de 0,1 gramos por ml. Cuando 1 ml de esta muestra se mezcló con 2 ml de agua, la proporción de la muestra en el líquido es ahora 0,033 gramos por ml. Si esta muestra da una lectura fluorómetro de 100 ppb, la concentración real se basa en la proporción de la muestra a 0,166, es decir, ppb = (0,166 gramos X 100 ppb) / gramo 0,1), o ppb 166. Para las aflatoxinas alternativa cuantificaciónmétodos de cationes, véase la referencia 7. 4. Fumonisina B1 (FB1) Análisis <ol><li> Cuando hongo se cultiva en granos de maíz, extraer muestras durante la noche con 10 ml de acetonitrilo / agua (50/50, v / v) a temperatura ambiente sin agitación. Posteriormente, mezclar el extracto (2 ml) con agua desionizada (6 ml), y aplicar esta mezcla (8 ml) directamente a la extracción en fase sólida C-18. </li><li> Antes de cargar la muestra, la columna condición de extracción en fase sólida C-18 de un enjuague con 2 ml de acetonitrilo seguido por 2 ml de agua. </li><li> Después de cargar la muestra, la columna se lavó con 2 ml de agua seguido por 2 ml de acetonitrilo / agua (15/85, v / v). Muestra para análisis por HPLC (que contenía FB1) se eluyó con 2 ml de acetonitrilo / agua (70/30, v / v). </li><li> Derivatizar FB1 con o-ftaldehído (OPA) mediante la transferencia de 0,1 ml de eluato de la columna a un vial que contiene 0,1 ml de tampón borato (0,05 M bórico acid/0.05 M de borato de sodio [50/50, v / v], pH 8,5) y 0,1 OPA ml (0,1 mg / ml en acetonaitrile con 0,5% - mercaptoetanol). </li><li> Se detiene la reacción después de 10 minutos mediante la adición de 0,5 ml de acetonitrile/0.01 M de ácido bórico (40/60, v / v). </li><li> Analizar FB1 en un HPLC Shimadzu LC-20AT sistema equipado con una columna analítica Zorbax ODS (4,6 150 mm) y una longitud de onda variable Shimatzu RF-10Axl detector de fluorescencia (excitación 335 nm / emisión 440 nm). </li><li> Un gradiente lineal se utiliza (disolvente A: acetonitrile/0.1 M de fosfato sódico (40/60), pH 3,3; disolvente B: acetonitrilo / fosfato sódico 0,1 M (60/40), pH 3,3) y el programa de gradiente es como sigue: 100% de A. a 100% de B en 10 min, B 100% durante 5 min </li><li> Analizar FB1 estándares por HPLC, y las mediciones de área de los picos se utilizan para generar la curva estándar. Posteriormente, cuantificar FB1 nivel en una muestra mediante la comparación de áreas de los picos con FB1 curva estándar. </li></ol> 5. Análisis de ergosterol <ol><li> Cultura del hongo en los granos de maíz durante 7-14 días. </li><li> Después de que el período de incubación, agregar 10 ml de cloroformo: methanol (2:1, v / v) en cada vial. Una vez añadido, agitar bien y luego las muestras se incuban los frascos en la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas. </li><li> Después de 24 horas, centrifugar las muestras, y recoger el sobrenadante y filtrar a través de una membrana de nylon 0,45 um. </li><li> Inyectar la muestra directamente en un HPLC Shimadzu LC-20AT sistema equipado con un 4,6 U SAO columna C18 (200 A y 250 ± 4,6 mm) y un Shimadzu SPD-20A detector UV / VIS configurado para monitorear a 282 nm. </li><li> El uso de metanol (100%) a un caudal de 1,5 ml / min como fase móvil. Determinar la cuantificación de ergosterol en las muestras mediante la comparación de áreas de los picos de las muestras a una curva estándar generada a partir de grado HPLC ergosterol. </li></ol> 6. Los resultados representativos Después de la inoculación y la incubación en una cámara de humedad durante dos a tres días, el crecimiento de hongos debe comenzar a aparecer en los granos. Siete días después del tratamiento, el crecimiento vegetativo en las plantas tratadas deben ser claramente visibles, rodeado pocontroles electrónicos falsos que no está infectada (Figura 1B, arriba). Los períodos de incubación más largo son propicias para el crecimiento vegetativo más abundante (Figura 1B, abajo). En las condiciones descritas en este documento (Figura 2G), A. flavus de tipo salvaje NRRL 3357 se muestran los valores máximos de la colonización, la acumulación de aflatoxina, y la producción de conidios a las 8, 6 y 8 días, respectivamente (Figura 2, CA). Sin embargo, cuando la contaminación por micotoxinas y la formación de conidios fueron comparados por unidad de ergosterol, los mayores niveles se observaron a las 4 y 6 días, respectivamente (Figura 2, DE). Figura 2F resumen de estos hongos que dependen de la biomasa de valor máximo de las observaciones. Curiosamente, entre los 4-6 días después de la inoculación, los granos sufren una degradación de ácidos nucleicos, como se ve por el ARN total de muestras en el tiempo de duración (Figura 2H, abajo). Varios estudios, incluyendo la nuestra, tienen exaed F. verticilliodies infección en granos de maíz y utilizado con éxito 2,8,9,10,11,12 7-13 días como los puntos de tiempo para las observaciones. Utilizando los métodos descritos en este documento, las fumonisinas niveles van de 3,500-8,000 ng / g de gama kernel 4,13 y los niveles de ergosterol de 5.000-10.000 ng / g del núcleo 14,13. La Figura 3 muestra los picos representativos de las fumonisinas (arriba) y el ergosterol (parte inferior ) de cromatogramas de HPLC. Medición de ergosterol también puede llevarse a cabo a través de espectros de absorbancia 15. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama de flujo para la cuantificación de la biomasa de hongos, esporogenesis, y la producción de micotoxinas y los resultados representativos para el crecimiento vegetativo de los bioensayos del kernel. A) Diagrama de flujo esbozar el método descrito para la cuantificación de los parámetros biológicos fundamentales utilizados para evaluar la patogénesis de hongos en los granos de maíz. B) Representanteresultados de los bioensayos del kernel. Arriba, A. flavus (NRRL3357) el crecimiento vegetativo de los granos de maíz en el fondo B73 genética. Las semillas se inocularon con 200 l de 10 6 esporas / ml y se tomaron fotografías 7 días post inoculación. En pocas palabras, F. verticillioides inocularon granos en el fondo de la infección por B73 13 días después. Los granos se inocularon con 200 l de 10 6 esporas / ml. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig2.jpg" /> Figura 2. Aspergillus flavus bioensayo sistema de tiempo-por supuesto. B73 granos fueron inoculados con 200 l de 10 6 esporas / ml Aspergillus flavus suspensión de conidios y se incubaron durante 2-8 días (G). Todos los valores se determinaron a partir de la media de peso en seco de 4 núcleos (n = 3-4, con una media ± DE). A) La colonización (basado en ergosterol), aflatoxinas (B), y conidiación (C) se cuantificaron utilizando métodos descritos anteriormente. E) La aflatoxina y la formación de conidios (F) se muestrancomo una función de la biomasa fúngica, medido a través de ergosterol h. F) Los valores máximos de ergosterol, la acumulación de aflatoxina, y conidios en función de la biomasa de hongos: los valores máximos para cada cantidad se observó a 100%. (H) 1 g por carril de RNA total de tiempo-curso. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/3727/3727fig3.jpg" /> Figura 3. Alto Representante cromatografía líquida (HPLC) cromatogramas de las fumonisinas B1 (arriba) y el ergosterol (abajo) aisladas a partir de granos infectados con Fusarium verticillioides (M3125).

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</ol>

<p class="jove_content"&gt; No tengo nada que revelar.</p

<p class="jove_content"&gt; Los métodos descritos aquí se ha probado extensamente y ha demostrado ser robusta en la generación de resultados cuantificables para la colonización por hongos, esporogenesis, y la producción de micotoxinas. Por otra parte, estos métodos deben ser aplicables a las semillas de otras especies de plantas que son susceptibles a la contaminación con hongos micotoxigénicos (por ejemplo, los cacahuetes, trigo, algodón, pistachos, etc.) Para competentes los análisis de interacción planta-patógeno, es imperativo que las semil...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Catálogo # </td></tr><tr><td> Agar Patata Dextrosa </td><td> Fisher científico se </td><td> S71659A </td></tr><tr><td> Tween-20 al </td><td> Fisher científico se </td><td> BP337-100 </td></tr><tr><td> Recipiente de incubación de plástico </td><td> Sterilite </td><td> 1713LAB06 </td></tr><tr><td> Licuadora </td><td> Vicam </td><td> 20200 </td></tr><tr><td> 24 cm filtro plegado documentos </td><td> Vicam </td><td> 31240 </td></tr><tr><td> 1,5 m de microfibra de vidrio </td><td> Vicam </td><td> 31955 </td></tr><tr><td> Afla columna de prueba </td><td> Vicam </td><td> G1024 </td></tr><tr><td> Afrla prueba para desarrolladores </td><td> Vicam </td><td> 32010 </td></tr><tr><td> El metanol </td><td> Vicam </td><td> 35016 </td></tr><tr><td> Acetonitrilo </td><td> Fisher científico se </td><td> AC14952-0025 </td></tr><tr><td> Etanol </td><td> Fisher Scientifc </td><td> AC39769-0025 </td></tr><tr><td> C-18 de fase sólida columna de extracción (Prep septiembre Columna SPE C18) </td><td> Fisher científico se </td><td> 60108-304 </td></tr><tr><td> O-ftalaldehído (OPA) </td><td> Sigma Chemical Co </td><td> 79760-5g </td></tr><tr><td> El ácido bórico </td><td> Fisher científico se </td><td> BP168-500 </td></tr><tr><td> Borato de sodio </td><td> Fisher científico se </td><td> RDCS0330500 </td></tr><tr><td> Mercaptoetanol </td><td> Fisher científico se </td><td> 45-000-231 </td></tr><tr><td> HPLC Shimadzu LC-20AT (bomba) </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc. </td><td> LC-20AT </td></tr><tr><td> Zorbax ODS columna (4.6x150mm) </td><td> Agilent Technologies </td><td> 443905-902 </td></tr><tr><td> Shimatzu RF-10Axl detector de fluorescencia </td><td> Shimadzu Scientific Instruments, Inc. </td><td> RF-10AXL </td></tr><tr><td> Fosfato sódico </td><td> Fisher científico se </td><td> AC38987-0010 </td></tr><tr><td> FB1 normas </td><td> Sigma Chemical Co. </td><td> F1147-1mg </td></tr><tr><td> Cloroformo </td><td> VWR </td><td> MK444410 </td></tr><tr><td> 13 mm de filtro jeringa con membrana de nylon 0,45 um (HPLC) </td><td> Pall Life Science </td><td> 4426 </td></tr><tr><td> Ergosterol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 45480-50G-F </td></tr><tr><td> Centelleo viales </td><td> VWR </td><td> 66021-602 </td></tr><tr><td> Cloruro de Sodio </td><td> Vicam </td><td> G1124 </td></tr></tbody></table>

la cuantificación de la colonización por hongos, esporogenesis y producción de micotoxinas mediante bioensayos del núcleo

Quantification of Fungal Colonization, Sporogenesis, and Production of Mycotoxins Using Kernel Bioassays

La descomposición de granos por semilla-hongos que infectan plantea uno de los mayores desafíos económicos a la producción de cereales en todo el mundo, por no hablar de los riesgos graves para la salud humana y animal. Entre la producción de cereales, el maíz es sin duda el cultivo más afectado, debido a patógenos inducida por pérdidas en la integridad del grano y la contaminación de las semillas de micotoxinas. Los dos micotoxinas más comunes y problemáticas de los productores de maíz y de alimentos y procesadores de alimentos son las aflatoxinas y las fumonisinas, producida por Aspergillus flavus y Fusarium verticillioides, respectivamente. Recientes estudios moleculares de las interacciones planta-patógeno han demostrado promesa en la comprensión de los mecanismos específicos asociados con la respuesta de las plantas a la infección por hongos y la contaminación por micotoxinas 1,2,3,4,5,6. Debido a que muchos laboratorios están utilizando ensayos del núcleo para estudiar patógenos de plantas interacciones, existe una necesidad de un método normalizado para la cuantificación de diferentes parámetros biológicos, asíresultados de distintos laboratorios se puede interrogar a interpretar. Para un método eficaz y reproducible para el análisis cuantitativo de las semillas, se han desarrollado ensayos de laboratorio en el núcleo y los métodos siguientes para cuantificar el crecimiento de hongos, la biomasa y la contaminación por micotoxinas. Cuatro esterilizados granos de maíz se inoculan en viales de vidrio con una suspensión fúngica (10 6) y se incubaron durante un período predeterminado. Viales de muestras se seleccionan entonces para la enumeración de los conidios por análisis de biomasa hemocitómetro, ergosterol basada por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), la cuantificación de aflatoxinas utilizando un método AflaTest fluorómetro, y cuantificación fumonisina por HPLC.

La devastación de los cultivos de cereales de semillas por los hongos que infectan ha llevado a los numerosos esfuerzos de investigación para comprender mejor las interacciones planta-patógeno. Para estudiar las interacciones entre las semillas de hongos en un entorno de laboratorio, hemos desarrollado un método robusto para la cuantificación de reproducción de los hongos, la biomasa y la contaminación por micotoxinas mediante bioensayos del kernel.

La cuantificación de la colonización por hongos, esporogenesis y producción de micotoxinas mediante bioensayos del núcleo

La pudrición de los granos causada por hongos que infectan las semillas representa uno de los mayores desafíos económicos para la producción de cereales a nivel mundial, sin mencionar los graves riesgos...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar con precisión la biosíntesis de micotoxinas, la deterioración y el crecimiento, con el fin de estudiar las interacciones moleculares entre semillas y hongos. Esto se logra primero mediante el establecimiento de un bioensayo con granos. A continuación, se realiza la enumeración de kedia y posteriormente se cuantifican las micotoxinas.Finalmente, se mide la biomasa fúngica. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran los efectos de la fisiología de las semillas en el desarrollo reproductivo y el metabolismo secundario de los hongos micotoxigénicos mediante la cuantificación de la biomasa de kedia y de metabolitos secundarios, utilizando técnicas de enumeración de esporas acopladas a cromatografía líquida de alta resolución. La principal ventaja de propagar esta técnica es estandarizar los métodos en múltiples laboratorios para que los resultados de diferentes laboratorios puedan interpretarse comparativamente.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las interacciones moleculares entre microorganismos y semillas, como el modo mediante el cual los hongos patógenos secuestran el metabolismo de lípidos de las plantas como una estrategia de virulencia. En general, las personas nuevas en este método pueden tener dificultades porque diferentes cepas de angi presentan patrones distintos de crecimiento y desarrollo. Por ello, es fundamental que optimice las condiciones para su interacción preferida entre hongos y semillas dos semanas antes de realizar el laberinto.Cultivo de bioensayo con granos. Los patógenos fúngicos en agar de papa dextrosa o PDA a 28 grados Celsius. Cuando esté listo para comenzar, seleccione granos similares en edad, forma y tamaño, y colóquelos en tubos de 50 mililitros. Superficie.Sterilice los granos añadiendo etanol al 70% y agitando los tubos a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, agite con agua estéril durante un minuto y con hipoclorito de sodio al 6% durante 10 minutos. Enjuague con agua estéril tres veces, agitando durante cinco minutos cada vez.Luego seque los granos sobre toallas para autoclave para infectarlos con Aspergillus flavus. Utilice una aguja de calibre 18 para crear una pequeña herida de 0,5 centímetros de profundidad en el lado del embrión de cada grano. Para una infección con Fusarium verticillioides, haga un corte de 0,5 milímetros de profundidad con una hoja de afeitar.Prepare la suspensión del inóculo añadiendo cinco mililitros de solución autoclavada de Tween 20 al 0,1 % a las placas cultivadas y use un espátula para microorganismos para raspar las esporas. Elimine el micelio por gravedad, filtrando la solución a través de al menos cuatro capas de gasa autoclavada. Utilice un hemocitómetro para calcular la concentración de esporas y ajuste a 10⁶ esporas por mililitro.Para ambas especies fúngicas. Cree una cámara de humedad en un recipiente de plástico forrándolo con cinco hojas de toallas de papel y agregando 100 mililitros de agua estéril. Luego coloque cuatro granos en cada autoclave.Vial de vidrio de 20 mililitros en instalación. Péselos y registre su masa. Añada 200 microlitros de suspensión de esporas a cada tapa del vial y vortexee para recubrir uniformemente los granos con la suspensión.Luego, afloje las tapas para permitir libremente el intercambio de aire y coloque los viales en la cámara de humedad. Incube los granos bajo un fotoperíodo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad a 28 grados Celsius durante siete días o hasta el tiempo deseado. Después del período de infección, agregue cinco milímetros de autoclave 0.01% entre 20 y los viales de simulación que contienen granos infectados y vortexe durante un minuto. Utilizando una punta de pipeta de gran apertura VRE, diluya inmediatamente la suspensión de esporas transfiriendo dos alícuotas separadas de 200 microlitros a dos tubos einor de 1.8 mililitros que contienen 1.8 mililitros de Tween 20 al 0.01%.Utilice un citómetro de hemocitómetro para contar cada alícuota dos veces. Para cuantificar la aflatoxina, agregue los granos de una muestra individual a una copa de licuadora de 50 mililitros con 20 mililitros de metanol al 80 % y 0,05 gramos de cloruro de sodio. Tape y licúe a alta velocidad durante un minuto.Coloque un papel de filtro empapado sobre un recipiente limpio de recolección y vierta el extracto en el filtro. Transfiera 10 mililitros de filtrado a un recipiente limpio. Añada 20 mililitros de agua destilada y mezcle bien.Filtre la muestra a través de un filtro de microfibra de vidrio de 1,5 micrones en un vaso limpio. Aplique un mililitro del extracto filtrado a una columna de prueba ALE y, utilizando aire comprimido, haga pasar el extracto filtrado a través de la columna a una velocidad de una a dos gotas por segundo. Lave la columna dos veces con un mililitro de agua destilada, pasándola a través de la columna a una velocidad de una a dos gotas por segundo, hasta que pase aire.Eluir la columna con un mililitro de metanol grado HPLC al 100 % a una velocidad de una a dos gotas por segundo, recogiéndolo en un Q VET de vidrio. Añadir un mililitro del revelador de prueba ale al EIT y mezclar bien. Colocar el Q VET en un fluorímetro calibrado y leer a los 60 segundos. Para el análisis de acin B uno o FB uno, añadir 10 mililitros de una solución 50:50 de acetonitrilo en agua a cada muestra de bioensayo de grano y extraer durante la noche a temperatura ambiente sin agitación.Mezcle el extracto con seis mililitros de agua desionizada y aplíquelo a una columna de fase sólida C18 que haya sido acondicionada previamente con dos mililitros de acetonitrilo, seguidos de dos mililitros de agua. Tras cargar la muestra, lave la columna con dos mililitros de agua, seguidos de dos mililitros de acetonitrilo en agua. Eluya la muestra que contiene FB1 para análisis por HPLC con dos mililitros de acetonitrilo en agua.Derivar el FB uno transfiriendo un mililitro de la columna EIT a un vial que contiene 0,1 mililitros de tampón borato y 0,1 mililitros de aldehído, e incubar durante 10 minutos. Detener la reacción añadiendo 0,5 mililitros de una solución de acetonitrilo y ácido bórico 0,01 molar. Analizar el FB uno mediante HPLC utilizando un gradiente lineal de acetonitrilo y fosfato sódico 0,1 molar.Compare las muestras con una curva patrón de FB para analizar el cultivo de esteroles, el hongo en maíz durante siete a 14 días. Después del período de incubación, agregue 10 mililitros de cloroformo-metanol a cada vial. Agite bien las muestras y luego incube los viales en la oscuridad a temperatura ambiente durante 24 horas.Centrifugar las muestras a 5.000 RPM durante tres minutos. Luego, filtrar el sobrenadante a través de una membrana de nailon de 0,45 micrones. Inyectar la muestra directamente en una columna HBLC y eluir con metanol al 100 % a un flujo de 1,5 mililitros por minuto.Cuantifique las muestras comparando las áreas de los picos con una curva patrón generada a partir de grado HPLC o goole. Tras la inoculación y la incubación en una cámara de humedad durante dos o tres días, debería comenzar a observarse el crecimiento fúngico en los granos como se muestra aquí.El crecimiento vegetativo setenta días después del tratamiento en los granos inoculados debe ser claramente visible, mientras que los controles simulados deben permanecer no infectados; períodos de incubación más largos favorecen un crecimiento vegetativo más abundante. Esta figura muestra que una cepa silvestre de flavus NR RL 3 3 5 7 presentó valores máximos de colonización, acumulación de aflatoxina y producción de kedia a los cuatro, seis y ocho días, respectivamente. Sin embargo, cuando se comparó la contaminación por micotoxinas y la colonización por unidad de crecimiento vegetativo, los niveles más altos se observaron a los cuatro y seis días, respectivamente.Se muestran aquí los cromatogramas representativos de fumonisina y rol mediante HPLC, utilizando los métodos demostrados en este video. Los niveles de fumonisina oscilan entre 3.500 y 8.000 nanogramos por gramo de grano, y los niveles de rol varían entre 5.000 y 10.000 nanogramos por gramo de grano. Una vez finalizados los bioensayos en granos, la acción, las micotoxinas y la biomasa fúngica pueden medirse todas en un período de dos a cuatro días, dependiendo del número de muestras experimentales.Al intentar este procedimiento, es importante recordar realizar los métodos en un campo lo más estéril posible siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos como fito, armónicos, lipidómica y proteómica, transcriptómica u otras interatómicas para responder preguntas adicionales, como qué genes, proteínas y vías hormonales están involucrados en estas importantes interacciones entre reinos.

quantification-fungal-colonization-sporogenesis-production-mycotoxins

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Para estudiar los procesos de desarrollo de ascosporas en Gibberella zeae, un procedimiento para la recolección en condiciones estériles se filmó con el fin de generar el mayor nivel de información para la descripción del protocolo. Esto debería facilitar la reproducibilidad del experimento, un aspecto crucial en el genoma completo del perfil de expresión de las pruebas de cumplimiento.

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Aquí se describe un protocolo para determinar la carga micótica pulmonar en ratones con aspergilosis invasiva por cuantificación de la coloración en cortes histológicos de plata de methanamine modificado de Gomori. Uso de este método dio lugar a resultados comparables con menos animales en comparación con evaluación de la carga de hongos por PCR cuantitativa de ADN fúngico de pulmón.

Cuantificación histológica para determinar la carga micótica pulmonar en aspergilosis Experimental

Aquí presentamos un protocolo para analizar el crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxinas en granos de maíz expresando una proteína antifúngica.  Utilizando una cepa de expresión de GFP de a. flavus supervisamos la infección y la propagación del hongo en granos maduros en tiempo real. El ensayo es rápido, fiable y reproducible.

Inhibición del crecimiento de Aspergillus flavus y la producción de aflatoxina en transgénicos maíz expresando el inhibidor de la α-amilasa de Lablab purpureus L.

Describimos un método modificado basado en agar diseñado para cuantificar los efectos antifúngicos de los productos derivados de plantas. Las contribuciones volátiles y no volátiles a la actividad antifúngica se pueden evaluar a través de este protocolo. Además, la eficacia contra hongos se puede medir en etapas clave del desarrollo en una sola configuración experimental.

Medición de la actividad antifúngica volátil y no volátil de los productos biocontrol

Presentamos un protocolo de imágenes en vivo sin etiquetas que utiliza técnicas de microscopía de luz transmitida para capturar imágenes, analizar y cuantificar la cinética de crecimiento del hongo filamentoso A. nidulans tanto en cultivos sumergidos como en medios sólidos. Este protocolo se puede utilizar junto con la microscopía de fluorescencia.

Análisis cuantitativo de la tasa de crecimiento de Aspergillus nidulans utilizando microscopía en vivo y software de código abierto

Aquí presentamos un protocolo basado en el sistema de cebo del gusano de la harina (Tenebrio molitor) que se utilizó para aislar y seleccionar hongos entomopatógenos (EPF) a partir de muestras de suelo. Se utiliza una fórmula efectiva de número de conidios (ECN) para seleccionar EPF altamente tolerante al estrés en función de las características fisiológicas para el control microbiano de plagas en el campo.

Aislamiento y selección de hongos entomopatógenos a partir de muestras de suelo y evaluación de la virulencia fúngica contra plagas de insectos

Este protocolo tiene como objetivo proporcionar procedimientos detallados para recolectar, fijar y mantener muestras de plantas micoheterótrofas, aplicando diferentes técnicas de microscopía como microscopía electrónica de barrido y transmisión, microscopía de luz, confocal y fluorescencia para estudiar la colonización fúngica en tejidos vegetales y semillas germinadas con hongos micorrícicos.

Técnicas de microscopía para interpretar la colonización fúngica en tejidos de plantas micoheterótrofas y germinación simbiótica de semillas

En este manuscrito se detalla un protocolo de inoculación optimizado que utiliza vainas de hojas de maíz desprendidas para estudios citológicos, fisiológicos y moleculares reproducibles de las interacciones del maíz con los patógenos fúngicos de las plantas. Las vainas de las hojas facilitan la observación en tiempo real de las interacciones celulares entre la planta viva y el hongo en tejidos no fijados.

Vainas de maíz desprendidas para la obtención de imágenes de células vivas de la infección por patógenos fúngicos foliares del maíz

Aprende a cuantificar micotoxinas y crecimiento fúngico en semillas mediante bioensayos del núcleo. Este método estandarizado facilita el estudio de interacciones planta-patógeno entre laboratorios.

La cuantificación de la colonización por hongos, esporogenesis y producción de micotoxinas mediante bioensayos del núcleo

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