Anticuerpos, químicamente bloqueado Microarray de multiplexado de alto rendimiento de perfiles de glicosilación de proteínas específicas en muestras complejas

Este artículo de video describe un procedimiento para obtener perfiles de glicosilación de 20 glicoproteínas diferentes en una muestra de suero de un paciente con carcinoma hepatocelular utilizando un microarray de anticuerpos químicamente bloqueados: primera glicoproteína: Los anticuerpos específicos se imprimen directamente en portaobjetos de microarrays y los glicanos de anticuerpos se bloquean para evitar la unión de lectinas. Cuando se aplican muestras de suero del paciente, los anticuerpos capturan las glicoproteínas de la muestra. A continuación, se añaden proteínas de unión a glicanos biotinilados para detectar los glicanos y se añade neu travaína dijugada para marcar las lectinas biotiniladas.

A continuación, se escanea el portaobjetos del microarray para detectar la fluorescencia, el análisis de los datos resultantes revela los perfiles de glicosilación de las proteínas de la muestra. Esta técnica tiene varias ventajas sobre el método existente como la HPLC. Este método permite la detección de glicoproteínas individuales en su estado nativo.

Es más rápido y fácil detectar la alteración de la glicosilación para múltiples proteínas simultáneamente. Muy bien, descubrimos que los biomarcadores de la enfermedad, particularmente del cáncer y el cáncer de hígado, que hemos analizado con más cuidado, a menudo están glicosilados. Y la capacidad de detectar formas específicas de glico, encontramos mejora, en gran medida, el rendimiento de los biomarcadores en su sensibilidad y en su especificidad.

Por lo tanto, esta medida puede proporcionar información sobre las alteraciones de la glicosilación en múltiples proteínas séricas en el CHC. También se puede aplicar al estudio de patologías y al descubrimiento de biomarcadores en otros cánceres y enfermedades como el cáncer de páncreas, la diabetes y la enfermedad de Alzheimer. La demostración del procedimiento estará a cargo de Chen Lu, un técnico de mi laboratorio.

Comience este protocolo preparando el microarray de anticuerpos primero en tubos de micro centrífuga de 0,8 mililitros sobre hielo, diluya todos los anticuerpos que se utilizarán para la impresión de microarrays a una concentración de 0,5 miligramos por mililitro en un mínimo de 40 mililitros de PBS, aquí, se utilizarán 26 anticuerpos diferentes como control positivo. Prepare también la misma cantidad de 0,5 miligramos por mililitro de BSA biotinilado en PBS. Use un pipeteador para alícuota 40 mililitros de cada anticuerpo en la placa fuente de 384 pocillos en hielo.

Luego, en el software de control de microarrays, designe la ubicación de cada anticuerpo. A continuación, cargue la placa en el microarray como fuente. A continuación, cargue diapositivas de microarray de 20 rutas en el microarray como destino.

Configure el microarray para imprimir 48 arrays subar idénticos en los que 27 anticuerpos y proteínas de control se detectan por triplicado en un patrón de nueve por nueve. Inicie el microarray para imprimir los portaobjetos del microarray de anticuerpos. Recoja los portaobjetos de microarrays de anticuerpos y guárdelos en un casete de portaobjetos con desecante.

Selle el casete en una bolsa de plástico para evitar la desnaturalización de las proteínas y la humedad en los portaobjetos durante el almacenamiento. Guarde los portaobjetos de microarrays sellados a cuatro grados centígrados hasta que se utilicen. El aspecto más difícil e importante de este procedimiento es el paso de bloqueo químico.

Para garantizar el éxito, es fundamental que se imprima una cantidad suficiente de anticuerpos en la luz de micromatriz. Siempre prepare el IDE de sodio fresco y el hidrocito de agroácido inmediatamente antes del experimento. Y asegúrese de realizar el procedimiento de oxidación a cuatro grados evitando la luz.

Saque los portaobjetos de microarray del refrigerador y equilibre a temperatura ambiente durante 30 minutos. Retire una diapositiva de la caja de almacenamiento. Sumerja brevemente el portaobjetos en un recipiente de lavado que contenga PBS con 0.1%tween 20.

A continuación, sumerja el portaobjetos en un tampón de acetato de sodio de 15 milimolares con 0,1% de interpolación durante 10 minutos. A continuación, prepare 150 milimolares de sodio por yodato en tampón de acetato de sodio de 15 milimolares y transfiéralo a un lavabo deslizante Guárdelo en el refrigerador, evitando la luz hasta su uso. Retire el portaobjetos del tampón de acetato de sodio y colóquelo en el recipiente que contiene puriado de sodio fresco con el lado del anticuerpo hacia arriba.

Cubra el lavabo con papel de aluminio para evitar la luz. A continuación, coloque el recipiente deslizante a cuatro grados centígrados agitándolo suavemente durante dos horas. Retire el portaobjetos del recipiente y enjuáguelo brevemente en tampón de acetato de sodio tres veces durante cinco minutos.

Incubar el portaobjetos en 300 mililitros de solución bloqueante de ácido hidroglutámico de 10 milimolares recién preparada en una cámara de incubación durante dos horas a temperatura ambiente con una agitación suave. Retire los portaobjetos de la cámara y lávelos con PBS al 0,1% durante tres minutos. A continuación, en un recipiente de lavado de portaobjetos, incube el portaobjetos del microarray en 300 mililitros de 1%BSA en PBS con 0,5%tween durante una hora a temperatura ambiente con una agitación suave.

Enjuague los portaobjetos en PBS con 0.1%tween tres veces durante tres minutos. Coloque el portaobjetos en una rejilla de portaobjetos y gírelo a 1.200 veces G durante dos minutos para secar el portaobjetos del microarray. Para separar cada matriz subar, se imprime una rejilla de cera en la diapositiva.

Después de precalentar la impresora de cera a 70 grados centígrados durante cinco minutos, cargue el portaobjetos de microarray bloqueado en la impresora de cera con el lado del anticuerpo hacia la cera. Tire suavemente del mango para imprimir cera de manera uniforme en el portaobjetos. Este método se puede utilizar para realizar ensayos de perfiles de glicoglución para una sola muestra o para medir un solo epítopo de gliconucleosis en varias muestras.

Aquí demostraremos los ensayos de perfil glicológico. Comience diluyendo 40 microlitros de suero en 360 microlitros de PBS que contengan 0.1% entre 0.1% y 0.1% de 35 y 100 microgramos por mililitro, cada uno de IgG de ratón, rata, conejo, cabra y burro. Este volumen es suficiente para aplicar seis microlitros de solución de suero diluido en cada submatriz.

Aplique con cuidado seis microlitros de la muestra diluida o control a cada submatriz del portaobjetos. Incube el portaobjetos en un casete humidificado con toallas de papel húmedas a temperatura ambiente durante una hora. Enjuague el portaobjetos con PBS con 0.1%tween tres veces durante tres minutos.

A continuación, seque el portaobjetos girándolo a 1200 veces G durante dos minutos. Prepare 20 microlitros de las proteínas de unión a glicanos biotinilados a 10 miligramos por mililitro en PBS tween en un tubo de microfuga de 0,8 mililitros sobre hielo. Aplique seis microlitros de las lectinas biotiniladas diluidas a cada submatriz del portaobjetos e incube en la caja de portaobjetos humidificada con toallas de papel húmedas a temperatura ambiente durante una hora.

Después de enjuagar los portaobjetos con PBS al 0,1% tres veces como antes, seque el portaobjetos girándolo a 1200 veces G en una centrífuga durante dos minutos. Prepare 400 microlitros de 10 miligramos por mililitro DITE 5 49 etiquetado como neutro travaína en PBS 0.1%tween en un tubo de micro fuge de 0.8 mililitros en hielo. Utilice una pipeta de repetición para aplicar seis microlitros de travaína neutra etiquetada como DITE 5 49 en cada subarreglo e incube el portaobjetos en el casete de portaobjetos humidificado a temperatura ambiente durante una hora después de la incubación.

Enjuague el portaobjetos con PBS 0.1%tween tres veces durante tres minutos. Seque el portaobjetos haciéndolo girar a 1200 veces G en una centrífuga durante dos minutos. Escanee el portaobjetos utilizando un escáner de microarrays de fluorescencia con una resolución de 10 milímetros.

Los ajustes del láser y PMT deben ser lo más fuertes posible y asegurarse de que no se observe ninguna saturación. Abra la imagen en la matriz Pro 3.2. Configure la plantilla de matriz de acuerdo con el mapa de matriz que muestra las ubicaciones de los puntos de anticuerpos.

Alinee cuidadosamente cada círculo de plantilla en el punto correspondiente de la imagen, extraiga la intensidad de cada punto en un archivo de Excel para su posterior análisis. Un micro array de anticuerpos que contiene 48 arrays subares idénticos con 26 anticuerpos contra 20 glicoproteínas séricas y biotina. BSA fue diseñado y fabricado como se describe en este video para examinar la importancia del procedimiento de bloqueo.

En el análisis del perfil de glicoproteínas, se generaron dos portaobjetos de microarrays idénticos. Uno no se bloqueó químicamente, mientras que el otro fue la muestra de control se aplicó a las matrices subares en las columnas uno y tres, y se aplicó una muestra de suero de HCC agrupada a las matrices subares. En las columnas dos y 4 22.

A continuación, se aplicaron lectinas biotiniladas específicas para diferentes glicanos en cada submatriz, como se muestra en estas imágenes de las matrices subares. Las lectinas se unieron para capturar anticuerpos en las columnas de control, dando un fondo alto que era indistinguible de las columnas cargadas de suero en los microarrays no bloqueados. Sin embargo, cuando se realizó el mismo experimento en un portaobjetos de microarrays de anticuerpos bloqueados químicamente, no hubo o hubo una unión muy baja para capturar anticuerpos en las columnas de control y una alta unión de antígenos en las columnas cargadas de suero.

Estos resultados demuestran que el procedimiento de bloqueo químico es un paso crítico para la medición de glicanos en glicoproteínas capturadas por anticuerpos: siguiendo el protocolo, se pueden obtener perfiles de glicosilación de 22 glicoproteínas en suero de HCC una vez dominados. Esta técnica se puede realizar en ocho horas si se realiza correctamente. Los anticuerpos, cuando se modifican, pueden perder su afinidad por sus antígenos y otras propiedades.

Por lo tanto, es importante tener esto en cuenta y usar varios anticuerpos diferentes en diferentes fuentes de anticuerpos después de este procedimiento. Otras medidas, como la detección de cada concentración de proteína mediante el uso del mismo portaobjetos de microrrayos, se pueden realizar para responder a preguntas adicionales, como si la alteración de la glicosilación se debe al cambio de los niveles de expresión de la proteína o únicamente a la alteración de la glicosilación en cada proteína individual. No olvide que trabajar con muestras de suero que contienen patógenos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como guantes protectores al realizar este procedimiento.