Una tecnología de microarrays de péptidos para el perfil de especificidad de los anticuerpos

Tome un portaobjetos de microarrays que contenga péptidos histonas con modificaciones postraduccionales o PTM objetivo y no objetivo.

Los péptidos se inmovilizan a través de biotina conjugada en puntos específicos del portaobjetos de vidrio funcionalizado con estreptavidina.

Las manchas también contienen un fluoróforo verde conjugado con biotina inmovilizado, lo que facilita la identificación de las manchas.

Introducir un tampón de bloqueo, evitando la interacción de anticuerpos no específicos.

Retire el tampón y centrifugue para secar el portaobjetos.

Dentro de una impresora de cera, bordee la matriz con cera.

Equilibre la matriz con un búfer de hibridación.

Incubar con los anticuerpos primarios específicos para un PTM objetivo.

Introducir anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo rojo que se unan a los anticuerpos primarios.

Retire los anticuerpos no unidos y centrifugue para secar el portaobjetos.

Toma una imagen del portaobjetos con un escáner de microarrays. La fluorescencia verde ayuda a identificar las manchas, mientras que la fluorescencia roja indica la interacción PTM-anticuerpo, lo que demuestra la especificidad de los anticuerpos.

El reconocimiento del PTM objetivo demuestra la especificidad de los anticuerpos, mientras que el reconocimiento de los PTM no objetivo indica la reactividad cruzada de anticuerpos.

Guiado por el mapa de placas de origen, cargue de 1 a 2 microlitros de cada característica peptídica en los pocillos designados de una o más placas de pequeño volumen de 384 pocillos. Diluya cada característica diez veces con 1x tampón de impresión de microarrays de proteínas, complementado con albúmina de suero bovino al 1% y 5 microgramos por microlitro de biotina marcada con fluoresceína. Luego, centrifugar las placas a 500 veces g a temperatura ambiente durante 2 minutos. A continuación, vacíe el contenedor de residuos de la impresora de microarrays. Llene la solución de lavado en recipientes humidificadores con agua destilada estéril. Introduzca los parámetros de la diapositiva de matriz en el software de la impresora de micromatrices.

Establezca el procedimiento de lavado en un lavado de 1 segundo con una sola inmersión, el poslavado en redip los pines cinco veces y la humedad al 60%. Luego, inserte portaobjetos de vidrio recubiertos de estreptavidina en las placas del sustrato. Cargue las placas en el elevador de platina. Inserte las placas fuente en los soportes de la placa y cargue los soportes en el elevador de la placa fuente. Ejecute el proceso de impresión.

Luego, retire las placas de sustrato del instrumento. Bloquee los portaobjetos impresos con 1x tampón de bloqueo de microarrays de proteínas durante 30 minutos mientras agita. Luego, lave los portaobjetos en solución salina tamponada con fosfato de pH 7.6 a temperatura ambiente durante 10 minutos. Repita el lavado con un nuevo lote de PBS. Seque los portaobjetos por centrifugación durante 30 segundos a temperatura ambiente.

Luego, precaliente una impresora de cera de microarrays a 85 grados Celsius durante 30 minutos, o hasta que la cera se derrita. Luego, inserte una corredera, con el lado impreso hacia abajo, en el soporte y alinee el soporte con el molde de la impresora. Ponga el molde en contacto con el portaobjetos y manténgalo presionado durante dos segundos. Luego, retire rápidamente el portaobjetos del soporte e inspeccione los bordes de cera para verificar que las matrices estén correctamente cerradas. Guarde los portaobjetos particionados a 4 grados centígrados en un área seca y oscura.

Para comenzar el procedimiento de hibridación, coloque un portaobjetos de matriz particionada en un plato de plástico y cubra el portaobjetos con tampón de hibridación. Equilibre el portaobjetos durante 30 minutos a 4 grados centígrados mientras agita a baja velocidad. Seque el portaobjetos girando en una centrífuga de portaobjetos de microarrays a temperatura ambiente. Luego, agregue 5 microlitros de cada solución de anticuerpos PTM de histonas a al menos dos pocillos de la matriz e incube a 4 grados Celsius durante una hora.

Después de la incubación, retire la solución de anticuerpos y lave la matriz con PBS frío tres veces, durante 5 minutos cada una, a 4 grados centígrados. A continuación, incube la matriz en una solución de anticuerpos secundarios conjugados con colorante fluorescente durante 30 minutos a 4 grados centígrados, en ausencia de luz. Lave el portaobjetos tres veces con PBS frío como antes.

Sumerja la matriz a temperatura ambiente 0,1 veces PBS para eliminar el exceso de sales y seque el portaobjetos mediante una breve centrifugación a temperatura ambiente. Obtenga imágenes del portaobjetos con un escáner de microarrays con una resolución de al menos 25 micras.