Métodos locales y globales de evaluación de nocicepción térmica en Drosophila Las larvas

El objetivo general del siguiente experimento es ensayar la nocicepción térmica en larvas de Drosophila. Esto se logra recolectando larvas de Drosophila para posteriormente exponerlas a estímulos térmicos nocivos como segundo paso opcional Las larvas pueden ser irradiadas con rayos UV, lo que causa daño tisular y sensibilización nociceptiva térmica. A continuación, la larva se puede sondear localmente con una sonda de calor o globalmente utilizando una placa de calor para provocar respuestas nociceptivas que se pueden medir cuantitativamente.

La sonda de calor muestra que las larvas tienen un techo para la respuesta nociceptiva al calor, y una relación sorprendente entre la temperatura de entrada y la amplitud de la respuesta provocada. El ensayo de la placa de calor muestra que las larvas exhiben una secuencia estereotipada de comportamientos nociceptivos que dependen de la temperatura del agua circundante y de la actividad de las neuronas sensoriales nociceptivas. Los métodos descritos aquí pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nocicepción térmica, como si los animales responden de manera diferente a los estímulos térmicos nocivos que se presentan local o globalmente.

Por lo general, las personas nuevas en el ensayo de la sonda de calor tendrán dificultades porque dominar el ensayo requiere práctica para minimizar la variación en la presión, la ubicación y el ángulo de conducción de la sonda aplicada. Como los comportamientos provocados con el aumento de la temperatura deben ser vistos para ser mejor apreciados. Para obtener suficientes larvas de progenie de un genotipo de interés definido, cultive el stock deseado directamente o coloque cruces en botellas que contengan alimento para moscas utilizando de 20 a 30 hembras vírgenes y 15 a 20 machos cinco días después de la puesta de huevos. Cosecha y limpia las larvas tempranas del tercer estadio sacando el alimento blando para moscas y colando con agua corriente suave a través de una malla de 630 micras del tamaño de poro, transfiera las larvas del tercer estadio temprano a Una almohadilla pequeña y húmeda de comida para evitar la inanición y la desecación.

Después de construir una cámara de autorización, use fórceps o un pincel para colocar suavemente 10 larvas de tercer estadio temprano a lo largo del interior del párpado y cerrar. Trabajando en una campana extractora, colocó la cámara de autorización dentro de un frasco de acoplamiento que contenía un vaso de precipitados de 10 mililitros que llevaba una bola de algodón empapada con 1,5 mililitros de éter datílico. Enrosque la tapa del frasco de coplan para exponer las larvas a los vapores del éter durante dos a 2,5 minutos.

Después de la autorización e, retire la cámara de autorización e del frasco Coplan y déjela unos segundos en la campana para que se disipen los vapores de éter residuales. Use una botella de agua para enjuagar suavemente las larvas de la cámara de autorización en una pequeña placa de Petri. Seque las larvas anestesiadas y luego fíjelas suavemente con el lado dorsal hacia arriba en una tira de cinta adhesiva de doble cara sujeta en un portaobjetos de microscopio de vidrio de tres pulgadas por una pulgada.

Coloque el portaobjetos en la superficie inferior de una cámara de irradiación UV y exponga las larvas a la luz ultravioleta durante seis segundos a una intensidad de 20 milijulios por centímetro cuadrado. Después de la irradiación, sumerja el portaobjetos en agua para que las larvas floten suavemente fuera de la cinta adhesiva de doble cara. Use pinzas o un pincel para colocar suavemente las larvas irradiadas en un tamaño de 15 por 45 milímetros.

Un frasco de cultivo de vidrio que contiene un mililitro de alimento para moscas para recuperarse durante ocho a 24 horas a 25 grados Celsius o la temperatura de cultivo deseada antes de volver a alojarlas. Para los ensayos de nocicepción térmica, primero preajuste la temperatura de la sonda térmica al punto de ajuste deseado. Use un pincel o pinzas para transferir suavemente una larva individual a una plataforma plana, asegurándose de que las larvas estén cubiertas por una película delgada de agua.

Con el fin de minimizar la variación de la presión, así como para garantizar la ubicación y el ángulo correctos de la sonda de calor, la práctica hace al maestro. Presione suavemente la punta de la sonda contra las larvas en el segmento A cuatro, aplicando una ligera presión con la punta en un ángulo de aproximadamente 45 grados entre la sonda y la superficie de las larvas. La presión debe causar una ligera hendidura en la superficie de las larvas y, por lo general, será suficiente para evitar la locomoción.

Continúe estimulando las larvas hasta que se muestre una respuesta de retirada o hasta que se alcance el punto de corte número 22. Las larvas que responden suelen mostrar primero un comportamiento preliminar de levantar la cabeza y la cola, seguido del comportamiento de retirada de rodar al menos 360 grados. Una vez que se inicia el comportamiento de retirada, libere el contacto con la sonda y registre la latencia o el tiempo necesario para la retirada.

Si no se observa ningún comportamiento de retirada en 20 segundos, entonces la larva no responde. Coloque las guías de luz de fibra óptica para asegurarse de que haya una iluminación adecuada de alto contraste. Para ver las larvas, coloque el bloque calefactor en la placa calefactora con la superficie plana hacia arriba y luego coloque la placa calefactora en la base del microscopio.

Encienda la placa térmica a la posición alta y espere aproximadamente 15 minutos para que la temperatura se estabilice a 95 grados centígrados. Mida 80 microlitros de agua destilada y coloque la gota de agua en el centro de una placa de Petri de poliestireno de 60 por 15 milímetros con un micropipeter. Use fórceps para colocar suavemente una larva limpia del tercer estadio medio en el centro de la gota de agua, introduciendo la menor cantidad de agua adicional posible.

Coloque suavemente la placa de Petri en el bloque calefactor sólido de la placa calefactora. Ajuste rápidamente la ubicación del plato para que todas las larvas y la gota de agua estén a la vista. Inicie el temporizador.

En este momento, la placa de Petri se coloca en el bloque calefactor sólido de la placa calefactora y registra el tiempo de inicio de cada comportamiento. Cinco. Se observan comportamientos locomotores estereotipados al transferir la larva sumergida en agua a la placa de calor. El comportamiento normal en ausencia de calor implica la locomoción de la sombrilla, acompañada de movimientos de la cabeza en búsqueda.

El comportamiento de golpeteo de la cabeza puede ocurrir a continuación, donde la larva mueve la cabeza rápidamente en un movimiento hacia adelante o lateral. Este movimiento es similar a su locomoción normal en el agua, pero se produce de forma más brusca y persistente. El comportamiento ocurre cuando las larvas ruedan lateralmente al menos 360 grados completos.

Esto puede ocurrir un número variable de veces y, a veces, implica tiradas incompletas. Con el fin de puntuar el comportamiento, solo cuente los giros completos de 360 grados. Este comportamiento es el más similar a esa escena con la aplicación local de la sonda de calor durante el comportamiento del látigo.

La larva exhibe movimientos rápidos de contracción y liberación a lo largo del eje antio posterior que acercan la cabeza muy brevemente a la cola. Finalmente, la larva exhibirá un comportamiento convulsivo a menudo seguido de parálisis. Durante el comportamiento convulsivo, la larva se estira a lo largo del eje posterior de interoperabilidad y exhibe un cuerpo entero de alta frecuencia.

El comportamiento de sacudida sin parálisis por flexión ocurre cuando las larvas cesan el movimiento En algunas larvas, esto es permanente, mientras que otras exhiben un movimiento de pulsación de baja frecuencia. En este gráfico del porcentaje de respondedores pertenecientes a cada categoría, hay un techo para la respuesta de nocicepción térmica de las larvas. En el ensayo de sonda de calor, el 100% de las larvas responden rápidamente hasta una temperatura de la sonda de 52 grados centígrados.

Sin embargo, a 54 grados Celsius o más, el 90% o más de las larvas no responden incluso después de 20 segundos de contacto. Aunque estas larvas continúan moviéndose después del 22º corte, también se puede medir y trazar el número de tiradas o el tiempo que pasan en el comportamiento de retirada de aversión. Sorprendentemente, parece haber una relación inversa entre la temperatura de entrada de la sonda y la robustez de la respuesta, ya que las temperaturas más bajas parecen provocar un mayor número de rodillos.

Se observan cinco comportamientos locomotoras estereotipados al transferir la larva sumergida en agua a la placa de calor. Aquí se muestran las latencias medias a las que se observan estos comportamientos, así como las temperaturas medias de las gotas de agua medidas para cada latencia en las condiciones óptimas de ensayo que se presentan aquí, el porcentaje de larvas que muestran cada comportamiento distinto oscila entre el 77 y el 100%, aunque ocasionalmente los comportamientos de balanceo y azote se omiten, se superponen o ocurren en orden inverso, Aquí se muestra el porcentaje de larvas que han sobrevivido después del inicio del comportamiento de parálisis en el ensayo de la placa de calor. Las larvas se calentaron hasta la parálisis y luego se retiraron a las condiciones estándar de cultivo para recuperarse.

Las larvas tratadas simuladamente recibieron un tratamiento equivalente, excepto por la exposición al calor, y la formación de EPP en adultos viables fue cuantitativa desde el día siete hasta el día 13. Aquí, MD G cuatro impulsa la expresión de transgenes regulados por UAS en las cuatro clases de neuronas sensoriales periféricas multidendríticas. UAS o un delta C expresa una versión modificada del canal de potasio rectificador abierto de Drosophila necesario para la transmisión sináptica y UAS orrc un delta NC expresa una versión modificada adicional del mismo canal que no interfiere con la transmisión sináptica.

Obsérvese que solo las larvas portadoras del transgén MD GALF cuatro y del transgén delta C UAS ORC uno muestran latencias aumentadas para cuatro de los cinco comportamientos observados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir las respuestas locales y globales de las larvas de despojos transgénicos a estímulos térmicos nocivos. Estos procedimientos se pueden combinar con otros métodos, como el análisis genético, para identificar los genes necesarios para la nocicepción térmica Al intentar el ensayo de la sonda de calor, es importante recordar minimizar la variación y la presión, la ubicación y el ángulo de contacto de la sonda.