Name: Métodos locales y globales de evaluación de nocicepción térmica en Drosophila Las larvas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Aprende métodos locales y globales para evaluar nocicepción térmica en larvas de Drosophila. Estas técnicas permiten cuantificar respuestas comportamentales y estudiar el procesamiento sensorial nociceptivo.

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Damos las gracias a Christian Landry para el calor diseño de la sonda, Daniel Babcock para el desarrollo de la prueba de fuego de la sonda de larvas, Sean Sweeney, por sugerir el ensayo de calor de placas, el Bloomington Drosophila Stock Center para las poblaciones de mosca, y los miembros Galko de laboratorio para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por el NIH R01 NS069828 de MJG y un NIH MARC U-STAR Training Grant (T34GM079088 a la Universidad de Houston-Downtown Los eruditos de la Academia) para acceso de las minorías a las carreras de investigación (AVG).

<ol><li>Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokine+signaling+mediates+UV-induced+nociceptive+sensitization+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae.</a> Curr. Biol. 19, 799-806 (2009).</li>
<li>Tracey, W. D., Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((painless%2C+a+Drosophila+gene+essential+for+nociception%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">painless, a Drosophila gene essential for nociception.</a> Cell. 113, 261-273 (2003).</li>
<li>Oswald, M., Rymarczyk, B., Chatters, A., Sweeney, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+thermosensitive+escape+behavior+in+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Fly+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">A novel thermosensitive escape behavior in Drosophila larvae.</a> Fly (Austin). 5, 17810(2011).</li>
<li>Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tiling+of+the+Drosophila+epidermis+by+multidendritic+sensory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons.</a> Development. 129, 2867-2878 (2002).</li>
<li>Moore, A. W., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((hamlet%2C+a+binary+genetic+switch+between+single-+and+multiple-+dendrite+neuron+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">hamlet, a binary genetic switch between single- and multiple- dendrite neuron morphology.</a> Science. 297, 1355-1358 (2002).</li>
<li>Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+regulating+dendritic+outgrowth%2C+branching%2C+and+routing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila.</a> Genes Dev. 13, 2549-2561 (1999).</li>
<li>Walters, E. T., Illich, P. A., Weeks, J. C., Lewin, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defensive+responses+of+larval+Manduca+sexta+and+their+sensitization+by+noxious+stimuli+in+the+laboratory+and+field%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Defensive responses of larval Manduca sexta and their sensitization by noxious stimuli in the laboratory and field.</a> J. Exp. Biol. 204, 457-469 (2001).</li>
<li>Woolf, C. J., Ma, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors--noxious+stimulus+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Nociceptors--noxious stimulus detectors.</a> Neuron. 55, 353-364 (2007).</li>
<li>Hwang, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptive+neurons+protect+Drosophila+larvae+from+parasitoid+wasps%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps.</a> Curr. Biol. 17, 2105-2116 (2007).</li>
<li>Xiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-avoidance-mediating+photoreceptors+tile+the+Drosophila+larval+body+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall.</a> Nature. 468, 921-926 (2010).</li>
<li>Grueber, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+Drosophila+multidendritic+neurons+in+the+central+nervous+system%3A+links+with+peripheral+dendrite+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology.</a> Development. 134, 55-64 (2007).</li>
<li>Sweeney, N. T., Li, W., Gao, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+single+neurons+in+vivo+reveals+specific+roles+of+flamingo+in+neuronal+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of single neurons in vivo reveals specific roles of flamingo in neuronal morphogenesis.</a> Dev. Biol. 247, 76-88 (2002).</li>
<li>Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+dissection+of+mechanosensory+transduction%3A+mechanoreception-defective+mutations+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila.</a> Neuron. 12, 1195-1206 (1994).</li>
<li>Nitabach, M. N., Blau, J., Holmes, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrical+silencing+of+Drosophila+pacemaker+neurons+stops+the+free-running+circadian+clock%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Electrical silencing of Drosophila pacemaker neurons stops the free-running circadian clock.</a> Cell. 109, 485-495 (2002).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

Los ensayos descritos aquí se pueden utilizar para evaluar cualitativa y cuantitativamente las larvas de los diferentes genotipos de respuesta a los estímulos nocivos térmicos. Una característica principal de la sonda de ensayo de calor es que el estímulo se da sólo en un solo locus. Se supone que esto da lugar a tiro de sólo un pequeño subconjunto de la clase IV de las neuronas en el segmento de contacto de la sonda y tal vez los de los segmentos adyacentes de inmediato 11. Debido a la estimulación local, el ensayo de la sonda de calor imita la experiencia común sensorial de la detección de un estímulo nocivo que se localiza en un cuerpo en particular la región, como una mano en contacto con una estufa caliente. Una desventaja del ensayo de sonda de calor es que tiene alguna variabilidad de usuario a usuario que probablemente se puede atribuir a tres factores: i) la presión con la que el usuario aplica la sonda a la larva, ii) la ubicación exacta de la sonda en la larva relativa a las neuronas subyacentes nociceptivos, y iii) la precisa angLe en el que la sonda contacto con la superficie de la larva. Hemos informado anteriormente de una estrategia cuantitativa de las larvas de la categorización en los no respondedores, los respondedores lentos, y personal de respuesta rápida en base a su latencia de retirada a una temperatura determinada 1. Aquí nos informe sobre la capacidad de respuesta de larvas a temperaturas aún más altas. Curiosamente, nos encontramos con que hay un techo para las larvas las respuestas nociceptivas térmicas y que este límite máximo se encuentra entre 52 y 54 ° C. Esto puede indicar que las larvas no poseen un potencial de receptor transitorio (TRP) de canal capaz de compuerta a temperaturas superiores a 52 º C. Alternativamente, se podría sugerir que las neuronas o los músculos utilizados para iniciar o llevar a cabo la respuesta del motor se daña antes de que puedan funcionar en la retirada aversivo. También presenta un análisis diferente de la amplitud de la retirada de respuesta usando ya sea el número de rollos como un indicador de la &quot;robustez&quot; de la respuesta. Ingenuamente, unoCabría esperar que estos parámetros se incrementaría con el aumento de temperatura o tiempo de estimulación. Sorprendentemente, se encuentra que este no es el caso. Las larvas se estimularon durante un tiempo más largo a una temperatura en el extremo inferior del rango nocivo (42 ° C) muestran más rollos y más tiempo dedicado rodadura que las larvas probaron a altas temperaturas (48-52 ° C). Esto sugiere que, dentro de la ventana de temperatura nociva es principalmente la duración de la exposición que determina la amplitud de la respuesta. Dado que las larvas se exponen a temperaturas altamente nocivas (48-52 ° C) responden en promedio muy rápidamente, no exhiben como muchos rollos como larvas expuestas a una temperatura de menos nocivo para una longitud de tiempo más largo. El análisis de la amplitud de la respuesta que aquí añade una nueva dimensión cuantitativa a lo largo de la cual los diferentes genotipos o manipulaciones ambientales se pueden comparar. Una característica principal de la placa de ensayo de calor es que implica una exposición global a la nocivacalor. Como tal, es más parecido al animal sentado en un caldero de calefacción que tocar una estufa caliente. Aunque no está claro cuando una larva puede experimentar un estímulo nocivo a nivel mundial en la naturaleza, en el laboratorio de las respuestas de comportamiento a esta exposición mundial son más complejas que las observadas después de la estimulación local. Una fuerza de la placa de ensayo de calor, también señalado por otros 3, es que tiene poco de usuario a usuario variabilidad desde tocar la larva no es un componente del protocolo. La única variación importante parece estar en la definición de cuándo comienza cada comportamiento, y esto puede ser minimizado con visión repetida / familiaridad. Una diferencia interesante entre los ensayos son las temperaturas a las que las conductas aversivas comenzar. Estos son mucho más baja en el ensayo de calor de placas que con la sonda de calor. El comportamiento exhibido por las larvas preliminar en contacto con la sonda de calor (cabeza y cola de subida) puede ser un correlato de la cabeza del movimiento de piernas observa en ~ 27 ° C en la plataforma de calore ensayo. Es posible que esta respuesta refleja el &quot;malestar&quot; más que &quot;el dolor&quot;. No hemos observado una correlación de los azotes, la confiscación, y la parálisis, incluso a alta (hasta 48 ° C) las temperaturas en el ensayo de la sonda de calor y puede ser que una masa crítica de las neuronas sensoriales disparando desde más de una región del cuerpo es necesaria para que en esos comportamientos. Interesantemente, los comportamientos convulsivos y parálisis se observan a temperaturas (~ 34 a 37 ° C) por debajo del extremo inferior del umbral nociceptivo observado con la sonda de calor que indica que la estimulación global puede implicar suma de las respuestas neuronales que son insuficientes para provocar un comportamiento con locales aplicación de la sonda de calor. Que estas temperaturas son en realidad percibida como nociva para las larvas se apoya en la observación de que las larvas que comienzan el comportamiento parálisis y posteriormente se dejaron recuperar en alimentos mosca no en la mayoría de los casos sobrevivir (Figura 5C). Más apoyo a la tesis de que el calor de la plensayo comió está leyendo las respuestas nociceptivas es el hecho de que el bloqueo de la transmisión sináptica en las neuronas sensoriales nociceptivas conocidos aumenta la latencia de la mayoría de los comportamientos observados (Figura 6). La observación de que no hay aumento en la latencia para el comportamiento de mayor temperatura para batir sugiere que otros neuronas sensoriales que no expresan MD-Gal4 puede ser requerido para este comportamiento. En suma, los dos ensayos implican la exposición de una larva de individuo a un estímulo nocivo térmica de la temperatura se define - la punta caliente de una pequeña sonda de metal en el ensayo local y la inmersión en una gota de agua rápidamente el calentamiento en el ensayo mundial. Las respuestas de comportamiento de las larvas de Drosophila de diferentes orígenes genéticos y / o expuestos a diferentes condiciones ambientales (por ejemplo, más o menos daño a los tejidos), se puede estudiar y cuantificar el uso de estos ensayos. En última instancia, los resultados de estos ensayos nos ayudará a comprender mejor las redes genéticas que controlan nociception en Drosophila y otras especies relacionadas.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nombre del reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Sonda térmica </td><td> Pro-Dev Ingeniería </td><td> Custom-construido sobre la demanda </td><td> La información de contacto puede ser proporcionada en la solicitud de </td></tr><tr><td> Baño seco Incubadora </td><td> Fisher Scientific </td><td> 11-718 </td><td> Un bloque de calentamiento sólido y un bloque de calentamiento con los pozos de 16 mm </td></tr><tr><td> Leica DFC290 12v/400mA Cámara en color </td><td> Leica Microsystems </td><td> 12730080 </td><td> Cualquier equivalente cámara hará. </td></tr><tr><td> Leica MZ6 microscopio </td><td> Leica Microsystems </td><td> El número de parte para el cuerpo de zoom MZ6 (portadora óptica) es 10445614 </td><td></td></tr><tr><td> Schott Ace Modulamp Unidad </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> A20500 </td><td></td></tr><tr><td> Schott doble cuello de cisne de 23 pulgadas de fibra óptica de guía de luz </td><td> Schott North America, Inc. </td><td> Schott A08575 </td><td></td></tr><tr><td> Unidad de control térmico </td><td> TSCI corp. </td><td> Custom Built </td><td> Los detalles pueden ser disponibles bajo petición </td></tr><tr><td> Zeiss Stemi 2000 microscopio </td><td> Zeiss </td><td> NT55-605 </td><td> Cualquier equivalente microscopiova a hacer. </td></tr><tr><td> Fórceps </td><td> FST </td><td> FS-1670 </td><td></td></tr><tr><td> Malla de 1 mm </td><td> Genesee Científico </td><td> 57-101 </td><td></td></tr><tr><td> Pincel </td><td> Dick Blick Art Materials </td><td> 06762-1002 </td><td></td></tr><tr><td> Reticulante UV </td><td> Fisher Scientific </td><td> 1199289 </td><td></td></tr><tr><td> Recipientes </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-816 </td><td></td></tr><tr><td> Vaso de precipitados de 10 ml </td><td> Fisher Scientific </td><td> 02-540C </td><td></td></tr><tr><td> Éter dietílico </td><td> Fisher Scientific </td><td> E138-500 </td><td></td></tr><tr><td> 35 x 10 mm de poliestireno Petri </td><td> Halcón </td><td> 351008 </td><td> No hemos probado platos alternativos. </td></tr><tr><td> Portaobjetos del microscopio </td><td> Corning </td><td> 26003 </td><td></td></tr><tr><td> Termopar </td><td> Omega Engineering, Inc. </td><td> HH802U </td><td></td></tr><tr><td> Pedazo de vinilo </td><td> Office Depot </td><td> 480009 </td><td></td></tr><tr><td> Microcentrífuga tubo </td><td> Denville CientíficoInc. </td><td> C-2170 </td><td></td></tr></tbody></table>

métodos locales y globales de evaluación de nocicepción térmica en<em&gt; drosophila</em&gt; las larvas

Local and Global Methods of Assessing Thermal Nociception in Drosophila Larvae

En este artículo, nos demuestran los ensayos para estudiar la nocicepción térmica en larvas de Drosophila. Un ensayo consiste en la estimulación espacialmente restringido (local) de 1,2 nociceptores térmicos, mientras que la segunda implica una mayor (mundial) la activación de la mayoría o todas las neuronas tipo 3. En conjunto, estas técnicas permiten la visualización y cuantificación de las funciones de comportamiento de Drosophila neuronas sensoriales nociceptivas. La larva de Drosophila es un modelo de sistema establecido para estudiar la nocicepción térmica, una respuesta sensorial a temperaturas potencialmente dañinos que es evolutivamente conservados a través de 1,2 especies. Las ventajas de Drosophila para estos estudios son la relativa simplicidad de su sistema nervioso y la sofisticación de las técnicas genéticas que se pueden utilizar para diseccionar las bases moleculares de la biología subyacente 6.4 En Drosophila, como en todos los metazoos, los response para estímulos nocivos térmicos en general, implica un &quot;nocifensive&quot; retirada de aversión al estímulo presentado 7. Tales estímulos son detectados a través de las terminaciones nerviosas libres o nociceptores y la amplitud de la respuesta organísmica depende del número de nociceptores que reciben el estímulo nocivo 8. En Drosophila, es la clase IV de las neuronas sensoriales arborización dendríticas que detectan los estímulos nocivos térmicos y mecánicos 9, además de su papel recientemente descubierto como fotorreceptores 10. Estas neuronas, las cuales han sido muy bien estudiados en el nivel de desarrollo, se ramifican en la hoja de la barrera epidérmica y hacer contactos con casi todas las células de la epidermis 11,12. El solo axón de cada neurona proyectos de clase IV en el cordón nervioso ventral del sistema nervioso central 11 donde pueden conectarse a las neuronas de segundo orden que se proyectan hacia el cerebro. En condiciones basales, neuro sensorial nociceptivons no se disparará hasta un umbral relativamente alto que se alcanza. Los ensayos descritos aquí permiten que el investigador cuantificar las respuestas de comportamiento o de referencia, presumiblemente, la sensibilización que sobreviene el daño tisular siguiente. Cada ensayo provoca distintas pero relacionadas las respuestas de comportamiento locomotor de estímulos nocivos térmicos y permite al investigador para visualizar y cuantificar distintos aspectos de la nocicepción térmica en larvas de Drosophila. Los ensayos se pueden aplicar a las larvas de los genotipos deseados o de larvas criadas en diferentes condiciones ambientales que puedan afectar la nocicepción. Dado que la nocicepción térmica se conserva en todas las especies, los resultados recogidos de la disección genética en Drosophila es probable que nuestra comprensión de la nocicepción térmica en otras especies, incluyendo los vertebrados.

En este artículo, nos demuestran los ensayos para estudiar la nocicepción térmica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas. Un ensayo consiste en la estimulación espacialmente restringido (local) de los nociceptores térmicos<sup&gt; 1,2</sup&gt; Mientras que el segundo implica una mayor (mundial) la activación de la mayoría o todas estas neuronas<sup&gt; 3</sup&gt;. En conjunto, estas técnicas permiten la visualización y cuantificación de las funciones de comportamiento de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las neuronas sensoriales nociceptivas.

Métodos locales y globales de evaluación de nocicepción térmica en<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

En este artículo, demostramos ensayos para estudiar la nocicepción térmica en larvas de Drosophila. Un ensayo consiste en la estimulación espacialmente restringida (local) de ...

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la nocicepción térmica en larvas de drosófila. Esto se logra recolectando larvas de drosófila para exponerlas posteriormente a estímulos térmicos nocivos como un segundo paso opcional. Las larvas pueden irradiarse con luz ultravioleta, lo que provoca daño tisular y sensibilización nociceptiva térmica. A continuación, se puede explorar a cada larva localmente con una sonda térmica o de forma global utilizando una placa caliente, con el fin de provocar respuestas nociceptivas que pueden medirse cuantitativamente.La sonda térmica muestra que las larvas tienen un límite en la respuesta nociceptiva al calor, y una relación sorprendente entre la temperatura de entrada y la amplitud de la respuesta provocada. El ensayo con placa térmica muestra que las larvas exhiben una secuencia estereotipada de comportamientos nociceptivos que dependen de la temperatura del agua circundante y de la actividad de las neuronas sensoriales nociceptivas. Los métodos descritos aquí pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nocicepción térmica, como si los animales responden de manera diferente a estímulos térmicos nocivos presentados de forma local o global.Generalmente, las personas nuevas en el ensayo con sonda térmica tendrán dificultades porque dominar este ensayo requiere práctica para minimizar la variación en la presión, la ubicación y el ángulo de aplicación de la sonda. La demostración visual del ensayo con placa calefactora es fundamental, ya que los comportamientos provocados por el aumento de temperatura deben observarse para ser plenamente comprendidos. Para obtener suficientes larvas progenitoras de un genotipo definido de interés, cultive el stock deseado directamente o realice cruces en frascos que contengan alimento para moscas, utilizando 20 a 30 hembras vírgenes y 15 a 20 machos. Cinco días después de la puesta de huevos, recolecte y limpie larvas de tercer estadio temprano extrayendo el alimento blando y colándolas con agua corriente suave a través de una malla con poros de 630 micrones. Transfiera las larvas de tercer estadio temprano a una pequeña almohadilla húmeda de alimento para prevenir el hambre y la desecación.Después de construir una cámara de anestesia, utilice pinzas o un pincel para colocar suavemente 10 larvas de tercer estadio temprano a lo largo del interior de la tapa y ciérrela. Trabajando en una campana extractora, coloque la cámara de anestesia dentro de un frasco de acoplamiento que contenga un vaso de precipitados de 10 mililitros con una bola de algodón empapada con 1,5 mililitros de éter dietílico. Coloque la tapa del frasco de acopl游戏副本Tras la autorización, retire la cámara de autorización del frasco Coplan y déjela unos segundos en la campana extractora para que se disipen los vapores residuales de éter. Utilice una botella con agua para enjuagar suavemente las larvas de la cámara de autorización hacia una pequeña placa de Petri. Seque las larvas anestesiadas y luego fíjelas suavemente con el lado dorsal hacia arriba sobre una tira de cinta adhesiva doble cara sujeta a una portaobjetos de vidrio de tres pulgadas por una pulgada.Coloque el portaobjetos sobre la superficie inferior de una cámara de irradiación UV y exponga las larvas a la luz UV durante seis segundos con una intensidad de 20 milijoules por centímetro cuadrado. Después de la irradiación, sumerja el portaobjetos en agua para hacer flotar suavemente las larvas fuera de la cinta adhesiva doble cara. Utilice pinzas o un pincel para colocar cuidadosamente las larvas irradiadas en un recipiente de 15 por 45 milímetros.Un vial de vidrio de un dram que contiene un mililitro de alimento para moscas para recuperar durante ocho a 24 horas a 25 grados Celsius o a la temperatura de cultivo deseada antes de volver a alojarlos. Para los ensayos de nocicepción térmica, primero ajuste la temperatura de la sonda térmica al punto deseado. Utilice un pincel o pinzas para transferir suavemente una larva individual a una plataforma plana, asegurándose de que la larva quede cubierta por una película delgada de agua.Para minimizar la variación de presión y asegurar la ubicación y el ángulo correctos del sensor térmico, la práctica hace al maestro. Presione suavemente la punta del sensor contra las larvas en el segmento A4, aplicando una ligera presión con la punta a un ángulo de aproximadamente 45 grados entre el sensor y la superficie de la larva. La presión debe causar una leve indentación en la superficie de la larva y generalmente será suficiente para evitar la locomoción.Continúe estimulando las larvas hasta que exhiban una respuesta de retirada o hasta que se alcance el corte de 22 s. Las larvas que responden típicamente primero muestran un comportamiento preliminar de elevación de la cabeza y la cola, seguido por el comportamiento de retirada consistente en una rotación de al menos 360 grados. Una vez iniciado el comportamiento de retirada, retire el contacto con la sonda y registre la latencia o el tiempo transcurrido hasta la retirada.Si no se observa un comportamiento de retirada dentro de los 20 segundos, entonces la larva es una no respondedora. Coloque las guías de luz de fibra óptica para asegurar una iluminación con alto contraste adecuada. Para observar las larvas, coloque el bloque calefactor en la placa calefactora con la superficie plana hacia arriba y luego coloque la placa calefactora sobre la base del microscopio.Encienda la placa calefactora en la configuración alta y espere aproximadamente 15 minutos para que la temperatura se estabilice a 95 grados Celsius. Mida 80 microlitros de agua destilada y coloque la gota de agua en el centro de una placa de Petri de poliestireno de 60 por 15 milímetros con una micropipeta. Utilice pinzas para colocar suavemente una larva limpia del tercer estadio medio en el centro de la gota de agua, introduciendo la menor cantidad adicional de agua posible.Coloque suavemente la placa de Petri sobre el bloque calefactor sólido en la placa calefactora. Ajuste rápidamente la posición de la placa para que las larvas completas y la gota de agua queden dentro del campo de visión. Inicie el cronómetro.En este momento, coloque la placa de Petri sobre el bloque calefactor sólido de la placa térmica y registre el tiempo de inicio de cada comportamiento. Cinco. Se observan comportamientos locomotores estereotipados tras la transferencia de la larva sumergida en agua a la placa térmica. El comportamiento normal en ausencia de calor implica una locomoción en forma de paraguas, acompañada de movimientos exploratorios de la cabeza.El comportamiento de sacudida de cabeza puede ocurrir a continuación, cuando la larva mueve rápidamente su cabeza en un movimiento hacia adelante o lateral. Este movimiento es similar a su locomoción normal en el agua, pero ocurre de manera más brusca y con un giro persistente. El comportamiento se presenta cuando la larva gira lateralmente al menos 360 grados completos.Esto puede ocurrir un número variable de veces y a veces implica giros incompletos. A efectos de puntuar el comportamiento, solo cuente giros completos de 360 grados. Este comportamiento es el más similar a esa escena con aplicación local de la sonda térmica durante el comportamiento tipo látigo.La larva exhibe movimientos rápidos de contracción y relajación a lo largo del eje anteroposterior que acercan brevemente la cabeza a la cola. A menudo se observa el movimiento de sacudida en rápida sucesión, ya sea dos veces o simultáneamente con la rotación. Finalmente, la larva exhibirá comportamiento de convulsión, seguido frecuentemente por parálisis. Durante el comportamiento de convulsión, la larva se estira a lo largo del eje interoposterior y presenta una contracción de alta frecuencia en todo el cuerpo.El comportamiento de sacudida sin parálisis por flexión ocurre cuando las larvas dejan de moverse. En algunas larvas, esto es permanente, mientras que otras luego exhiben un movimiento pulsátil de baja frecuencia. En esta gráfica del porcentaje de respondedoras pertenecientes a cada categoría, existe un límite máximo en la respuesta larval de nocicepción térmica. En el ensayo con sonda térmica, el 100 % de las larvas son respondedoras rápidas hasta una temperatura de la sonda de 52 grados Celsius.Sin embargo, a 54 grados Celsius y temperaturas superiores, el 90 % o más de las larvas no responden incluso tras 20 segundos de contacto. Aunque estas larvas continúan moviéndose tras el corte número 22, también se puede medir y representar gráficamente el número de giros o el tiempo empleado en el comportamiento de retirada de aversión. Sorprendentemente, parece existir una relación inversa entre la temperatura de entrada de la sonda y la robustez de la respuesta, ya que temperaturas más bajas parecen provocar un mayor número de giros.Se observan cinco comportamientos locomotores estereotipados al transferir la larva sumergida en agua a la placa calefactora. Aquí se muestran las latencias promedio a las que se observan estos comportamientos, así como las temperaturas promedio de la gota de agua medidas para cada latencia bajo las condiciones óptimas del ensayo presentadas aquí; el porcentaje de larvas que exhiben cada comportamiento distinto osciló entre el 77 y el 100 %. Aunque ocasionalmente los comportamientos de giro y sacudida se omiten, se superponen o ocurren en orden inverso, aquí se muestra el porcentaje de larvas que sobrevivieron tras el inicio del comportamiento de parálisis en el ensayo con la placa calefactora. Las larvas se calentaron hasta la parálisis y luego se retiraron a condiciones estándar de cultivo para su recuperación.Las larvas tratadas con control ficticio recibieron un tratamiento equivalente, excepto por la exposición al calor, y la formación de PPE en adultos viables fue cuantitativa entre el día siete y el trece. Aquí, MD G cuatro induce la expresión de transgenes regulados por UAS en las cuatro clases de neuronas sensoriales periféricas multidendríticas. UAS o uno delta C expresa una versión modificada del canal de potasio rectificador abierto de Drosophila, necesario para la transmisión sináptica, y UAS orrc uno delta NC expresa una versión aún más modificada del mismo canal que no interfiere con la transmisión sináptica.Téngase en cuenta que solo las larvas que portan tanto el conductor MD GAL4 como el transgén UAS ORC1ΔC muestran latencias aumentadas en cuatro de los cinco comportamientos observados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir las respuestas locales y globales de larvas de GEs a estímulos térmicos nocivos. Estos procedimientos pueden combinarse con otros métodos, como el análisis genético, para identificar los genes necesarios para la nocicepción térmica. Al realizar el ensayo con la sonda de calor, es importante recordar minimizar la variación en la presión, la ubicación y el ángulo de contacto de la sonda.

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Investigación

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Neurociencia

A continuación, describimos un procedimiento rápido fiable y sencillo para determinar la temperatura más baja en la que las ratas o ratones muestran un comportamiento...

Determinación rápida del umbral nociceptivo térmico en ratas diabéticas

Las larvas de Drosophila tienen neuronas sensoriales dedicadas, nociceptores, cuya respuesta a estímulos térmicos potencialmente dañinos desencadena comportamientos aversivos, o los llamados "nocifensivos", en el animal. Este video describe un método para evaluar la nocicepción térmica mediante el registro del comportamiento de las larvas en respuesta a la aplicación local de una sonda de calor en la cutícula. Por lo tanto, este método se denomina ensayo de sonda de calor local.

Ensayo de sonda de calor local: un método para evaluar la nocicepción de altas temperaturas en larvas de Drosophila

Los estudios de la morfogénesis neuronal utilizando Drosophila arborización dendrítica larval (DA) se benefician de las neuronas en la visualización in situ de las proteínas neuronales y epidérmicas por inmunofluorescencia. Se describe un procedimiento que mejora el análisis de inmunofluorescencia de DA neuronas y las células epidérmicas que rodean mediante la eliminación de tejido muscular de la pared del cuerpo de la larva.

Eliminación de<em&gt; Drosophila</em&gt; Tejido muscular de larvas Filetes para el análisis de inmunofluorescencia de las neuronas sensoriales y las células epidérmicas

Aquí se demuestra un nuevo ensayo para estudiar la nocicepción frío en larvas de Drosophila. Este ensayo utiliza una sonda Peltier hecha a la medida capaz de aplicar un estímulo frío nocivo focal y da lugar a comportamientos específicos de frío cuantificables. Esta técnica permitirá además disección celular y molecular de la nocicepción frío.

Ensayo novedoso para la nocicepción en frío<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Aquí, presentamos un protocolo para determinar la temperatura ambiente preferida de larvas de Drosophila usando un gradiente térmico continuo.

Un análisis de gradiente de temperatura para determinar las preferencias térmicas de larvas de Drosophila

Aquí presentamos un protocolo para determinar automáticamente el funcionamiento locomotor de Drosophila en cambios de temperatura con un campo de control de temperatura programable que produce cambios de temperatura rápida y precisa en tiempo y espacio.

Un método automatizado para determinar el rendimiento de Drosophila en respuesta a cambios de temperatura en el espacio y el tiempo

Los límites térmicos pueden predecir los ambientes que toleran los organismos, que es información valiosa frente al rápido cambio climático. Aquí se describen protocolos de alto rendimiento para evaluar el mínimo térmico crítico y el tiempo de derribo del calor en los insectos. Ambos protocolos maximizan el rendimiento y minimizan el costo de los ensayos.

Ensayos de alto rendimiento de límites térmicos críticos en insectos

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo realizar un ensayo mejorado para la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila. Utilizamos el ensayo aquí para demostrar que la hipersensibilidad mecánica (alodinia e hiperalgesia) existe en las larvas de Drosophila.

Un ensayo mejorado y herramientas para medir la nocicepción mecánica en larvas de Drosophila

La evaluación y el tratamiento del dolor en los niños es difícil porque los niños no verbales pueden informar de sus experiencias. En este vídeo se describen los métodos cuantitativos de electrofisiología y técnicas de análisis que se pueden utilizar para medir la respuesta a eventos nocivos en el sistema nervioso infantil.

Las mediciones electrofisiológicas y Análisis de la nocicepción en los bebés humanos

Drosophila melanogaster es un sistema de genética y de comportamiento modelo manejable que se ha utilizado para entender las bases moleculares y celulares de muchos procesos biológicos importantes para más de un siglo 1. Drosophila ha sido bien aprovechado para hacerse una idea de la base genética del comportamiento de las moscas.

Métodos de ensayo a Drosophila Comportamiento

Aprende métodos locales y globales para evaluar nocicepción térmica en larvas de Drosophila. Estas técnicas permiten cuantificar respuestas comportamentales y estudiar el procesamiento sensorial nociceptivo.

Métodos locales y globales de evaluación de nocicepción térmica en

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