Métodos locales y globales de evaluación de nocicepción térmica en Drosophila Las larvas

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la nocicepción térmica en larvas de drosófila. Esto se logra recolectando larvas de drosófila para exponerlas posteriormente a estímulos térmicos nocivos como un segundo paso opcional. Las larvas pueden irradiarse con luz ultravioleta, lo que provoca daño tisular y sensibilización nociceptiva térmica. A continuación, se puede explorar cada larva localmente con una sonda térmica o de forma global mediante una placa calefactora, con el fin de provocar respuestas nociceptivas que puedan medirse cuantitativamente.

La sonda térmica muestra que las larvas tienen un límite máximo en la respuesta nociceptiva al calor, y una relación sorprendente entre la temperatura de entrada y la amplitud de la respuesta provocada. El ensayo con placa térmica muestra que las larvas exhiben una secuencia estereotipada de comportamientos nociceptivos que dependen de la temperatura del agua circundante y de la actividad de las neuronas sensoriales nociceptivas. Los métodos descritos aquí pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nocicepción térmica, como si los animales responden de manera diferente a estímulos térmicos nocivos presentados de forma local o global.

Generalmente, las personas nuevas en el ensayo con sonda térmica tendrán dificultades porque dominar este ensayo requiere práctica para minimizar la variación en la presión, la ubicación y el ángulo de aplicación de la sonda. La demostración visual del ensayo con placa caliente es fundamental, ya que los comportamientos inducidos por el aumento de temperatura deben observarse para ser plenamente comprendidos. Para obtener larvas suficientes de una genética definida de interés, críe directamente el acervo deseado o realice cruces en frascos que contengan alimento para moscas, utilizando 20 a 30 hembras vírgenes y 15 a 20 machos. Cinco días después de la puesta de huevos, coseche y limpie larvas de tercer estadio temprano retirando el alimento blando y colándolas con agua corriente suave a través de una malla con poro de 630 micrones. Transfiera las larvas de tercer estadio temprano a una pequeña almohadilla húmeda de alimento para prevenir el hambre y la desecación.

Después de construir una cámara de autorización, use pinzas o un pincel para colocar suavemente 10 larvas de tercer estadio temprano a lo largo del interior de la tapa y ciérrela. Trabajando en una campana extractora, coloque la cámara de autorización dentro de un frasco de acoplamiento que contenga un vaso de precipitados de 10 mililitros con una bola de algodón empapada con 1,5 mililitros de éter de dathyl. Enrosque la tapa del frasco de acoplamiento para exponer a las larvas a los vapores de éter durante dos a 2,5 minutos.

Tras la autorización, retire la cámara de autorización e del frasco Coplan y déjela unos segundos en la campana para que se disipen los vapores residuales de éter. Utilice una botella de agua con pulverizador para enjuagar suavemente las larvas de la cámara de autorización y transferirlas a una pequeña placa de Petri. Seque ligeramente las larvas anestesiadas y luego fíjelas suavemente con el lado dorsal hacia arriba sobre una tira de cinta adhesiva doble cara sujeta a una portaobjetos de vidrio de tres pulgadas por una pulgada.

Coloque el portaobjetos sobre la superficie inferior de una cámara de irradiación UV y exponga las larvas a la luz UV durante seis segundos con una intensidad de 20 milijoules por centímetro cuadrado. Tras la irradiación, sumerja el portaobjetos en agua para hacer flotar suavemente las larvas fuera de la cinta adhesiva doble cara. Utilice pinzas o un pincel para colocar cuidadosamente las larvas irradiadas en un recipiente de 15 por 45 milímetros.

Vial de cultivo de vidrio de un dram que contiene un mililitro de alimento para moscas, para recuperar durante ocho a 24 horas a 25 grados Celsius o a la temperatura de cultivo deseada antes de volver a alojarlos. Para los ensayos de nocicepción térmica, primero ajuste la temperatura de la sonda térmica al punto deseado. Utilice un pincel o pinzas para transferir suavemente una larva individual a una plataforma plana, asegurándose de que la larva quede cubierta por una película delgada de agua.

Para minimizar la variación de presión y asegurar la ubicación y el ángulo correctos del sensor térmico, la práctica hace al maestro. Presione suavemente la punta del sensor contra las larvas en el segmento A4, aplicando una ligera presión con la punta a un ángulo de aproximadamente 45 grados entre el sensor y la superficie de las larvas. La presión debe causar una ligera indentación en la superficie de las larvas y generalmente será suficiente para impedir la locomoción.

Continúe estimulando las larvas hasta que exhiban una respuesta de retirada o hasta que se alcance el corte en el segundo 22. Las larvas que responden típicamente muestran primero un comportamiento preliminar de elevación de la cabeza y la cola, seguido por el comportamiento de retirada consistente en una voltereta de al menos 360 grados. Una vez iniciado el comportamiento de retirada, suelte el contacto con la sonda y registre la latencia o el tiempo transcurrido hasta la retirada.

Si no se observa un comportamiento de retirada dentro de los 20 segundos, entonces la larva es una no respondedora. Coloque las guías de luz de fibra óptica para asegurar una iluminación con alto contraste adecuada. Para observar las larvas, coloque el bloque calefactor sobre la placa calefactora con la superficie plana hacia arriba y luego coloque la placa calefactora sobre la base del microscopio.

Encienda la placa calefactora en la configuración alta y espere aproximadamente 15 minutos para que la temperatura se estabilice a 95 grados Celsius. Mida 80 microlitros de agua destilada y coloque la gota de agua en el centro de una placa de Petri de poliestireno de 60 por 15 milímetros con una micropipeta. Utilice pinzas para colocar suavemente una larva limpia de tercer estadio medio en el centro de la gota de agua, introduciendo la menor cantidad adicional de agua posible.

Coloque suavemente la placa de Petri sobre el bloque calefactor sólido de la placa térmica. Ajuste rápidamente la posición del recipiente para que las larvas completas y la gota de agua queden visibles. Inicie el cronómetro.

En este momento, coloque la placa de Petri sobre el bloque calefactor sólido de la placa térmica y registre el tiempo de inicio de cada comportamiento. Cinco. Se observan comportamientos locomotores estereotipados al transferir la larva sumergida en agua a la placa térmica. El comportamiento normal en ausencia de calor implica una locomoción en forma de paraguas, acompañada de movimientos de búsqueda con la cabeza.

El comportamiento de sacudida de cabeza puede ocurrir cuando la larva mueve rápidamente su cabeza en una dirección hacia adelante o lateral. Este movimiento es similar a su locomoción normal en el agua, pero ocurre de manera más brusca y con un movimiento giratorio persistente. El comportamiento se presenta cuando la larva gira lateralmente al menos 360 grados completos.

Esto puede ocurrir un número variable de veces y a veces implica giros incompletos. A efectos de puntuar el comportamiento, solo cuente giros completos de 360 grados. Este comportamiento es el más similar a la escena con aplicación local de la sonda térmica durante el comportamiento de látigo.

La larva exhibe movimientos rápidos de contracción y relajación a lo largo del eje anteroposterior que acercan brevemente la cabeza a la cola. A menudo se observa el movimiento de sacudida en rápida sucesión, ya sea dos veces o simultáneamente con el enrollamiento. Finalmente, la larva exhibirá comportamiento convulsivo, seguido frecuentemente por parálisis. Durante el comportamiento convulsivo, la larva se estira a lo largo del eje interoposterior y presenta una frecuencia alta de contracciones en todo el cuerpo.

El comportamiento de temblor sin parálisis por flexión ocurre cuando las larvas dejan de moverse. En algunas larvas, esto es permanente, mientras que otras luego exhiben un movimiento pulsátil de baja frecuencia. En esta gráfica del porcentaje de respondedoras pertenecientes a cada categoría, existe un límite máximo en la respuesta larval a la nocicepción térmica. En el ensayo con sonda térmica, el 100 % de las larvas son respondedoras rápidas hasta una temperatura de la sonda de 52 grados Celsius.

Sin embargo, a 54 grados Celsius o más, el 90 % o más de las larvas no responden incluso después de 20 segundos de contacto. Aunque estas larvas continúan moviéndose tras el corte 22, también se puede medir y graficar el número de giros o el tiempo dedicado al comportamiento de retirada de aversión. Sorprendentemente, parece existir una relación inversa entre la temperatura de entrada de la sonda y la robustez de la respuesta, ya que temperaturas más bajas parecen provocar un mayor número de giros.

Se observan cinco comportamientos locomotores estereotipados al transferir la larva sumergida en agua a la placa calefactora. Aquí se muestran las latencias promedio a las que se observan estos comportamientos, así como las temperaturas promedio de la gota de agua medidas para cada latencia bajo las condiciones óptimas del ensayo presentadas aquí; el porcentaje de larvas que exhiben cada comportamiento distinto osciló entre el 77 y el 100 %. Aunque ocasionalmente los comportamientos de giro y sacudida se omiten, se superponen o ocurren en orden inverso, aquí se muestra el porcentaje de larvas que sobrevivieron tras el inicio del comportamiento de parálisis en el ensayo con la placa calefactora. Las larvas se calentaron hasta la parálisis y luego se retiraron a condiciones estándar de cultivo para su recuperación.

A las larvas tratadas con control se les aplicó un tratamiento equivalente, excepto la exposición al calor, y la formación de PPE en adultos viables fue cuantitativa entre el día siete y el trece. Aquí, MD G cuatro dirige la expresión de transgenes regulados por UAS en las cuatro clases de neuronas sensoriales periféricas multidentríticas. UAS o uno delta C expresa una versión modificada del canal de potasio rectificador abierto de Drosophila necesario para la transmisión sináptica, y UAS orrc uno delta NC expresa una versión aún más modificada del mismo canal que no interfiere con la transmisión sináptica.

Téngase en cuenta que solo las larvas que portan tanto el conductor MD GAL4 como el transgén UAS ORC1ΔC muestran latencias aumentadas en cuatro de los cinco comportamientos observados. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir las respuestas locales y globales de larvas de GEs a estímulos térmicos nocivos. Estos procedimientos pueden combinarse con otros métodos, como el análisis genético, para identificar los genes necesarios para la nocicepción térmica. Al intentar el ensayo con la sonda de calor, es importante recordar minimizar la variación en la presión, la ubicación y el ángulo de contacto de la sonda.