Name: Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprende a realizar imágenes de alta resolución del comportamiento celular en el neuroepitelio embrionario de pollo usando microscopía de campo amplio. Esta técnica permite observar células individuales durante períodos prolongados con resolución espacial y temporal óptima.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Preparación de los platos <ol><li> Los platos utilizados para el cultivo rebanada son de vidrio de fondo (con un cubreobjetos como la base) (platos Willco). Estos se colocan en el tejido objetivo en un plato de cultivo de tejidos de 6 cm para mantener el fondo de vidrio limpio. </li><li> En el día antes del experimento, se añaden 2 ml de 0,1% de poli-L-lisina solución al plato de vidrio de fondo y se incuba durante 5 minutos a temperatura ambiente para permitir que el de poli-L-lisina cubrir el fondo de vidrio. </li><li> Quitar poli-L-lisina solución y enjuagar tres veces en agua desionizada, y luego una vez en 70% de etanol. </li><li> Dejar secar durante la noche. Los platos también puede ser secado mediante calentamiento suave en un horno de microondas a baja potencia durante 30-45 segundos. </li></ol> 2. La electroporación de embriones <ol><li> Incubar los huevos a 37 ° C a Hamburger-Hamilton (HH) la etapa 10 (~ 36 horas) (o de otra etapa se desea). </li><li> Antes de comenzar la preparación agujas de vidrio (se utiliza un Flaming / el modelo de Brown p87 extractor microcapilar) y romper la punta de la Needle con una pinza fina bajo un microscopio de disección. El extremo de la aguja debe ser lo suficientemente afilada para perforar el embrión si bien no es tan estrecho que impide la inyección de la solución de ADN. </li><li> Huevos de ventana y electrodos lugar (5 mm de separación) a cada lado del embrión </li><li> Inyectar ADN (~ 0,025 a 0,5 mg / l en agua desionizada coloreada con una pequeña cantidad de verde rápido) en el tubo neural. </li><li> Aplique corriente - 17.12 V tres veces, la longitud de pulso de 50 ms a 950 ms entre pulsos. </li><li> Usamos bajas concentraciones de ADN y los voltajes bajos de electroporación para lograr la expresión del mosaico de modo que puede seguir las células individuales. </li><li> Cubra ventana en la cáscara del huevo con cellotape y asegúrese de que está sellado. </li><li> Permita que los embriones para recuperar durante 3-4 horas o toda la noche a 37 ° C. </li></ol> 3. El colágeno y la rebanada preparación Cultura Medio <ol><li> Prepare la mezcla de colágeno y la rebanada de medio de cultivo alrededor de una hora antes de rebanar. </li><li> Para 300 t lipo de un colágeno añadir 100 ml de solución al 0,1% de ácido acético y 100 l 5 x L15. Mezclar bien después de cada adición. La solución debe tornarse amarilla. </li><li> Ahora agregue 15-20 l de bicarbonato de sodio al 7,5% y mezclar bien. La solución debe ser ligeramente rosa, y el volumen de bicarbonato de sodio requerida para este puede variar. Mantenga en hielo y se forman de nuevo cada vez. </li><li> A 10 ml de medio neurobasal añadir B-27 y suplemento Glutamax, a una concentración de 1 x 10 solución final y gentamicina l. </li><li> Colocar en medio de una incubadora a 37 ° C tamponada con un 5% de CO 2. Dejar la parte superior del contenedor suelta para permitir que se equilibre con el CO 2. </li></ol> 4. Slice Cultura <ol><li> Eliminar embriones de huevo y se lava en medio L15. </li><li> Colocar en un plato de cultivo de tejidos con una capa de Sylgard en la parte inferior y el pin a través de los alrededores de extraembrionarios membranas de manera que se tensa. </li><li> El uso de un micrófonoroknife, embrión de corte lo más recto posible a través de la región de interés. Para la médula espinal, lonchas han de ser entre 1-2 somitas de espesor. Agregar las rebanadas unidas al embrión, mientras que se mire otros embriones para que no perderlos. </li><li> Preparar una punta de micropipeta 200 l cortando aproximadamente 1 mm de la punta y colocar esto a un P2 o P10. Esta punta se utiliza para transferir las rebanadas de la médula espinal a la placa inferior de vidrio. Una propina de 10 l no es lo suficientemente amplio como para recoger las rebanadas. </li><li> Cubra el interior de la punta con el colágeno con la pipeta una mezcla de colágeno l preparado con anterioridad. Dejar reposar 1-2 minutos y luego enjuague con medio L15. Esto evitará que el tejido se adhiera a la parte interior de la punta. </li><li> Separar sector a partir de embriones utilizando un microknife y retirar de la cápsula, utilizando un P2 o P10 equipada con una punta de 200 l, y pone a 1 l. Trate de tomar como medio lo menos posible. </li><li> Vortex la mezcla de colágeno y caída de 5-8 l de esto en el plato revestido de poli-l-lisina. </li><li> Immediatamente puesto rebanada de embrión en el colágeno y la posición en el lugar con un par de pinzas finas. Las rebanadas deben colocarse de modo que la cara que se visualiza está a ras con el cubreobjetos. El tejido debe adherirse a la capa de poli-l-lisina en el cubreobjetos. </li><li> Repita esto hasta que tenga varios cortes en el cubreobjetos. Por lo general, se puede colocar 6-9 rebanadas en un plato. </li><li> Una vez que todas las rebanadas están en su lugar, cubrir el plato y permitir que el colágeno para establecer durante 20 minutos. Algunos de los primeros colágeno puesto que ya puede haber comenzado a secarse. Para evitar esto añadir una pequeña cantidad de L15 a éstos antes de cubrir. </li><li> Una vez configurado, añadir con cuidado medio de la cultura 2ml sector que ha sido equilibrada en el 5% de CO 2 a 37 ° C durante al menos una hora. Se debe tener cuidado de no desconectar el colágeno de la cubreobjetos. </li><li> Colocar en un 37 ° / 5% de CO 2 incubadora y permitir rebanadas para recuperar por lo menos 3 horas antes de imágenes. Si no hay humedad, plato lugar en una caja de plexiglás ingenioha poco de pañuelo de papel humedecido en una esquina. </li></ol> 5. Rebanadas de imágenes de embriones <ol><li> Nosotros utilizamos un procesador Core DeltaVision de campo amplio microscopio equipado con una cámara de WeatherStation ambiental a sectores de la imagen. La cámara se mantiene constantemente a 37 ° C, con un aparato de perfusión de CO 2 para mantener la platina del microscopio a 5% de CO 2/95% aire. </li><li> Imagen se lleva a cabo normalmente utilizando un 40 x / 1,30 aceite de NA lente de inmersión y las imágenes son capturadas con una HQ2 CoolSnap enfrió cámara CCD. </li><li> Z-secciones son capturados cada 1,5 micras a través del tejido 45 micras. El tiempo de exposición debe mantenerse tan bajo como sea posible. Normalmente, para exponer 5-50 ms para cada sección Z. Las imágenes se capturan cada 7 minutos y un máximo de nueve cortes se pueden visitar mediante un punto preciso del sistema DeltaVision de visitar la función. </li></ol> 6. Los resultados representativos Un ejemplo de lapso de tiempo la secuencia de una célula de la médula espinal es progenitorse muestra en la fig. 2a y una película correspondiente. Imágenes se inició en una rebanada de la médula espinal de una de dos días de edad (estadio HH 12) embrión. Esta célula se transfectó con un constructo que expresa GFP-αTubulin. Durante esta primera etapa, las células progenitoras neurales progenitoras sufren predominantemente progenitora-divisiones del modo en que las células se multiplican para generar dos células progenitoras más en bicicleta. La figura. Película 2b y la correspondiente figura 2 muestra una célula transfectadas con GFP-GPI (GPI de anclaje GFP), que marca la membrana celular. Esta célula se somete a una división durante el cual el proceso basal se divide en dos y está igualmente heredado por las células hijas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig1.jpg" /> Figura 1. Slice protocolo de cultivo para el time-lapse. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/3920/3920fig2.jpg" /> Figura 2. B célulaehavior durante el desarrollo normal de la médula espinal. (a) los marcos seleccionados de la película 1. La célula que expresa GFP-tubulina divide con un plano de escisión que es perpendicular a la superficie apical (2 h 20 min), generando dos células hijas que dividen una vez más (24 h 23 min y 25 min h 54). (B) los marcos seleccionados de la película 2. Celulares transfectadas con GFP-IPG se somete a la división celular durante el cual se divide el proceso basal (flechas blancas) y también heredado por las células hijas. Película 1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> . Película 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3920/3920movie1.mov" target="_blank">Haga clic aquí para ver la película</a> .

<ol><li>Ulloa, F., Briscoe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogens+and+the+Control+of+Cell+Proliferation+and+Patterning+in+the+Spinal+Cord%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Morphogens and the Control of Cell Proliferation and Patterning in the Spinal Cord.</a> Cell Cycle. 6, 2640-2649 (2007).</li>
<li>Briscoe, J., Novitch, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+pathways+linking+progenitor+patterning%2C+cell+fates+and+neurogenesis+in+the+ventral+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Philosophical+Transactions+of+the+Royal+Society+B%3A+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Regulatory pathways linking progenitor patterning, cell fates and neurogenesis in the ventral neural tube.</a> Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 363, 57-70 (2008).</li>
<li>Shiau, C., Das, R., Storey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+effective+assay+for+high+cellular+resolution+time-lapse+imaging+of+sensory+placode+formation+and+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An effective assay for high cellular resolution time-lapse imaging of sensory placode formation and morphogenesis.</a> BMC Neuroscience. 12, 37(2011).</li>
<li>Wilcock, A. C., Swedlow, J. R., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitotic+spindle+orientation+distinguishes+stem+cell+and+terminal+modes+of+neuron+production+in+the+early+spinal+cord%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mitotic spindle orientation distinguishes stem cell and terminal modes of neuron production in the early spinal cord.</a> Development. 134, 1943-1954 (2007).</li>
<li>Vilas-Boas, F., Fior, R., Swedlow, J. R., Storey, K. G., Henrique, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+reporter+of+notch+signalling+indicates+regulated+and+random+notch+activation+during+Vertebrate+neurogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">A novel reporter of notch signalling indicates regulated and random notch activation during Vertebrate neurogenesis.</a> BMC Biology. 9, 58(2011).</li>
<li>Herman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Bios+Scientific+Publishers%22%5BJournal%5D)">Fluorescence microscopy.</a> Bios Scientific Publishers. , (1998).</li>
<li>Conchello, J. -A., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Meth%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning microscopy.</a> Nat. Meth. 2, 920-931 (2005).</li>
<li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+JB+%22Fundamental+Limits+in+Confocal+Microscopy+Handbook+Of+Biological+Confocal%22">Fundamental Limits in Confocal Microscopy Handbook Of Biological Confocal</a>. Pawley, J. B. , Springer US. (2006).</li>
<li>Swedlow, J. R., Hu, K., Andrews, P. D., Roos, D. S., Murray, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+tubulin+content+in+Toxoplasma+gondii%3A+A+comparison+of+laser-scanning+confocal+and+wide-field+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Measuring tubulin content in Toxoplasma gondii: A comparison of laser-scanning confocal and wide-field fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 99, 2014-2019 (2002).</li>
<li>Murray, J. M., Appleton, P. L., Swedlow, J. R., Waters, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+performance+in+three-dimensional+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Evaluating performance in three-dimensional fluorescence microscopy.</a> Journal of Microscopy. 228, 390-405 (2007).</li>
<li>Biggs, D. S. C. 3D Deconvolution Microscopy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBiggs%2C+DSC+%22Current+Protocols+in+Cytometry%22">Current Protocols in Cytometry</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W., Prasher, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Wiedenmann, J., Oswald, F., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+proteins+for+live+cell+imaging%3A+Opportunities%2C+limitations%2C+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Fluorescent proteins for live cell imaging: Opportunities, limitations, and challenges.</a> IUBMB Life. 61, 1029-1042 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Presentamos aquí una novela de lapso de tiempo de ensayo de imágenes para vigilar el comportamiento de células en cultivo rebanada de embriones de pollo. Este ensayo permite imágenes de alta resolución del tejido vivo para un máximo de 70 horas, aunque los plazos entre las 24-48 horas son más fáciles de capturar. El uso de un objetivo de aceite de NA y los intervalos relativamente cortos entre los puntos de tiempo permite la adquisición de imágenes en alta resolución, así como lo que nos permite monitorear el comportamiento de células, que a menudo se produce rápidamente, y puede ser fácilmente perdido durante el tiempo convencional de imágenes a intervalos utilizando confocal microscopía. La principal ventaja de este ensayo es la capacidad de las células de la imagen durante largos períodos de tiempo. El uso de gran campo 6 en vez de láser confocal de barrido microscopio 7 es fundamental para esto. La microscopía confocal tradicionalmente ha ofrecido una serie de ventajas sobre todo la microscopía de campo, incluyendo la capacidad de tomar secciones ópticas y eliminar la información de atención directa <sup&gt; 7, pero el uso de un agujero conduce a una pérdida de la luz al detector 8, excluyendo una cantidad significativa de información, y que requiere largos tiempos de exposición. Wide microscopía de campo, por el contrario, utiliza iluminación de campo completo y toda la luz que pasa a través del objetivo se envía al detector. Esto, junto con una alta eficiencia cuántica se enfrió (CCD) de la cámara garantiza imágenes con una elevada relación señal-ruido en comparación con la microscopía confocal 9, con tiempos de exposición muy rápidos. En nuestra aplicación, debemos la imagen durante largos períodos, registro de las pilas en 3D y en última instancia, resolver los pequeños-cerca de difracción de estructuras limitadas. Aunque microscopio confocal evita fuera del foco de luz de cada vez que llega al detector y por lo tanto reduce significativamente fondo en gruesos, densamente-etiquetados muestras 7, 8, sólo se logra una utilizable relación señal-ruido con entrada de luz mucho más grande que amplio microscopía de campo 10. Para sparsel muy sensible a la luzmuestras y marcados como los cortes electroporated de la médula espinal, por lo tanto, toda la microscopía de campo se comporta mejor que la microscopía confocal. Cuando se combina con la restauración de imágenes por deconvolución, que elimina la información de atención y mejora el contraste de campo amplio es entonces particularmente bueno para la detección de objetos pequeños, débiles 11. Si bien no es apropiado para todos los experimentos de imagen del tejido, este enfoque ha sido muy eficaz para nuestra aplicación en directo imágenes de células. La elección de la proteína fluorescente es un factor importante que puede influir en la supervivencia celular. Nos parece que los mejores resultados se obtienen a partir de construcciones que utilizan la proteína verde fluorescente (GFP) 12 como un marcador. Actualmente estamos evaluando una serie de proteínas fluorescentes rojas que pueden ser utilizados eficazmente en combinación con las buenas prácticas agrarias para el canal de doble lapsos de tiempo. Hay una variedad de tales proteínas disponibles 13. Aunque muchas proteínas son estables como fusiones con una proteína fluorescente, Algunas proteínas pueden volverse inestable por fusión, dando como resultado la viabilidad celular reducida. En tales casos, el uso de construcciones que contienen un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) es útil para separar la proteína de interés a partir de la proteína fluorescente. Cuando las rebanadas de imágenes de la médula espinal, se debe tener cuidado para minimizar la exposición a la luz fluorescente. Los oculares del microscopio debe ser utilizado sólo con luz transmitida (campo claro) para localizar y posición de las rebanadas. Imágenes fluorescentes siempre deben ser adquiridas utilizando el software de microscopio utilizando el mínimo tiempo de exposición. Estos deben mantenerse en el intervalo de 5-50 ms y el uso de filtros de densidad neutra se debe experimentar. A pesar de los tiempos de exposición más largos al principio puede producir imágenes más nítidas, los efectos de la exposición fototóxicas luz fluorescente puede conducir a la muerte celular. Los primeros 5-10 micras de tejido que está más cerca del cubreobjetos no debe ser reflejado ya que esta región contiene tejido que pueden haber sufrido daños durante elrebanar. Aunque los ejemplos presentados aquí son de embriones en la etapa electroporadas HH 10 y fotografiado 6-7 horas más tarde, este método puede ser utilizado para los embriones hasta HH etapa 18. En etapas posteriores, el tejido de la médula espinal es mucho más grande y por lo tanto es difícil de cortar con la mano. En estos casos, la incorporación de los embriones en el bajo punto de fusión de agarosa, y se seccionó con un vibratome puede producir mejores resultados. A pesar de que presentan este ensayo como un método para células de imagen en la médula espinal en desarrollo, este enfoque también ha sido modificado para la imagen de otros tejidos embrionarios, incluyendo la sensorial placodas 3.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> Willco Dish </td><td> Willco Wells </td><td> GWst-3522 </td><td></td></tr><tr><td> poli-l-lisina </td><td> Sigma </td><td> P8970 </td><td> 0,1% en Tris </td></tr><tr><td> Vidrio borosilicato capilares </td><td> Instrumentos de Harvard </td><td> GC100-10 </td><td> Diámetro exterior de 1,0 mm, Diámetro interior 0.58mm </td></tr><tr><td> Electrodos (Genetrodes ovo, en forma de L </td><td> BTX </td><td> 10-001850-01 </td><td> 5 mm chapada de oro </td></tr><tr><td> ECM 830 cuadrada del generador de impulsos </td><td> BTX </td><td> 45-0002 </td><td> en electroopration ovo </td></tr><tr><td> Fast Green </td><td> Sigma </td><td> F7258 </td><td></td></tr><tr><td> El colágeno tipo I de rata </td><td> Sigma </td><td> C3857 </td><td></td></tr><tr><td> Medio L-15 (en polvo) </td><td> Sigma </td><td></td><td> 2,76 g / l en agua destilada para solución 5x </td></tr><tr><td> De bicarbonato de sodio </td><td> Sigma </td><td> S8761 </td><td> 7,5% de solución </td></tr><tr><td> Medio Neurobasal </td><td> Invitrogen </td><td> 12348-017 </td><td> sin rojo fenol </td></tr><tr><td> Glutamax </td><td> Invitrogen </td><td> A1286001 </td><td> Solución de 100x </td></tr><tr><td> B-27 suplemento </td><td> Invitrogen </td><td> 17504-044 </td><td></td></tr><tr><td> Gentamicina </td><td> Invitrogen </td><td> 15710049 </td><td> 10 mg / ml </td></tr><tr><td> L15 (líquido 1x) </td><td> Invitrogen </td><td> 11415-049 </td><td></td></tr><tr><td> Microknife </td><td> Altomed </td><td> A10102 </td&gt; <td> 15 grados de inclinación </td></tr><tr><td> Inoxidable pasadores de acero sin cabeza </td><td> Watkins y Doncaster </td><td> E6871 </td><td> Tamaño A1 </td></tr><tr><td> Sylgard 184 elastómero </td><td> VWR </td><td> 634165S </td><td></td></tr><tr><td> Core DeltaVision sistema de microscopio </td><td> Applied Precision </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Coolsnap HQ2 cámara CCD </td><td> Fotometría </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

High-resolution Live Imaging of Cell Behavior in the Developing Neuroepithelium

La médula espinal de embriones consta de ciclismo células progenitoras neuronales que dan lugar a un gran porcentaje de las células neuronales y gliales del sistema nervioso central (SNC). Aunque se sabe mucho sobre los mecanismos moleculares que el patrón de la médula espinal y provocan la diferenciación neuronal 1, 2, carecemos de una comprensión profunda de estos primeros eventos en el nivel de comportamiento de las células. Por tanto, es fundamental para estudiar el comportamiento de los progenitores neuronales en tiempo real que sean sometidos a la neurogénesis. En el pasado, imágenes en tiempo real de tejido embrionario temprano ha visto limitado por la viabilidad celular / tejido en cultivo, así como los efectos fototóxicas de imagen fluorescente. Aquí se presenta un nuevo ensayo para el tejido de imágenes tales durante largos períodos de tiempo, utilizando un ex vivo novela rebanada protocolo de cultivo y de campo amplio microscopía de fluorescencia (Fig. 1). Este enfoque logra a largo plazo de lapso de tiempo de seguimiento de los embriones de pollo sPinal de células progenitoras de la médula con alta resolución espacial y temporal. Este ensayo puede ser modificado a la imagen de una gama de tejidos embrionarios 3, 4 Además de la observación de los comportamientos celulares y subcelulares, el desarrollo de la novela y periodistas altamente sensibles para la actividad de los genes (por ejemplo, la señalización de Notch 5) hace que este ensayo una poderosa herramienta con la que comprender cómo se regula la señalización comportamiento de las células durante el desarrollo embrionario.

Tisular embrionario en tiempo real es un reto durante largos períodos de tiempo. Aquí presentamos un ensayo para el seguimiento de los cambios celulares y subcelulares en la médula espinal de pollo durante largos periodos con alta resolución espacial y temporal. Esta técnica puede ser adaptado para otras regiones del sistema nervioso y embrión en desarrollo.

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

La médula espinal embrionaria consta de células progenitoras neurales en ciclo que dan lugar a un gran porcentaje de las células neuronales y gliales del sistema nervioso central...

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes del comportamiento celular dentro del tubo neural embrionario con alta resolución durante largos períodos de tiempo. Esto se logra primero seccionando transversalmente el tubo neural temprano con un constructo que dirige la expresión de una proteína fluorescente de elección para marcar células individuales. El siguiente paso consiste en realizar cortes del embrión temprano y montarlos sobre placas con fondo de vidrio.Tras la recuperación en una incubadora, las secciones embrionarias se observan en un microscopio de campo amplio a intervalos regulares. En definitiva, esta técnica puede utilizarse para estudiar el comportamiento celular dentro del neuroepitelio en desarrollo durante largos períodos de tiempo con alta resolución espacial y temporal. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes para la obtención de imágenes de tejido vivo es que permite observar el comportamiento individual de las células durante largos períodos de tiempo con alta resolución espacial y temporal.Este método le permite abordar preguntas clave en el campo de la neurobiología del desarrollo, como el papel de la orientación del huso mitótico en la elección de sulfato o cómo la dinámica de señales podría estar regulando el comportamiento celular antes de la electroforesis de plásmidos en el tubo neural. Se preparan agujas de vidrio utilizando un extractor de microcapilares bajo un microscopio estereoscópico. Utilice pinzas finas para romper la punta de la aguja.La punta de la aguja debe ser lo suficientemente afilada como para atravesar el tubo neural, pero sin ser tan estrecha que dificulte la inyección de la solución de ADN. Las X para este experimento se han incubado a 37 grados Celsius durante aproximadamente 36 horas hasta la etapa de Hamilton correspondiente al estado de hamburguesa. Etapa 10.Para comenzar este procedimiento, realice una ventana en el huevo y coloque electrodos separados cinco milímetros a ambos lados del embrión; luego, inyecte ADN en el tubo neural. El ADN se tiñe con una pequeña cantidad de verde brillante para su visualización. Aplique una corriente de 12 a 17 voltios y una duración de pulso de 50 milisegundos, repetida tres veces con intervalos de 950 milisegundos entre cada pulso.Se utilizan bajas concentraciones de ADN y bajos voltajes de electroforesis para lograr una expresión mosáica, de modo que se puedan seguir células individuales. Finalmente, cubra la ventana en la cáscara del huevo con cinta adhesiva, asegurándose de que quede sellada. Deje que los embriones se recuperen durante tres o cuatro horas o durante la noche a 37 grados Celsius.La mezcla de colágeno y el medio de cultivo de secciones deben prepararse aproximadamente una hora antes de seccionar los embriones. Para preparar la mezcla de colágeno, añada 100 microlitros de una solución de ácido acético al 0,1 % a 300 microlitros de colágeno tipo I y mezcle completamente mediante vortex. A continuación, añada 100 microlitros de medio L 15 cinco veces concentrado y mezcle completamente mediante vortex. Nuevamente, la solución debe volverse amarilla.A continuación, agregue de 15 a 20 microlitros de bicarbonato de sodio al 7,5% y vortexee completamente. La solución debe volverse ligeramente rosada. Mantenga en hielo.Esta mezcla de colágeno debe prepararse fresca cada vez. Para preparar el medio de cultivo de cortes, añada lo siguiente a 10 mililitros de medio neurobasal: suplemento B27, GlutaMAX y solución de gentamicina; coloque el medio en un incubador a 37 grados Celsius, tamponado con 5% de dióxido de carbono. Deje la tapa del recipiente ligeramente abierta para permitir que se equilibre con el dióxido de carbono durante al menos una hora.Para comenzar este procedimiento, utilice un par de tijeras pequeñas para extraer el embrión. Retire el embrión del huevo con pinzas, lavándolo con medio L 15. Coloque el embrión en una placa de cultivo de tejidos con una capa de Sylgard en el fondo.Fije el embrión a través de las membranas extraembrionarias circundantes de manera que las membranas queden tensas. Utilizando un microcuchillo, corte el embrión lo más recto posible a través de la región de interés. Para cortes de la médula espinal, el grosor debe ser de uno a dos somitas, con los cortes laminares adheridos al tejido lateral del embrión para que no se pierdan mientras se realizan cortes en otros embriones.Se necesita una punta microperpet personalizada para transferir los cortes de médula espinal a la placa de fondo de vidrio. Para prepararla, fije una punta de 200 microlitros a una pipeta P2 o P10 permanente y corte aproximadamente un milímetro del extremo de la punta. Code el interior de la punta con colágeno preparando un microlitro de la mezcla de colágeno que se preparó anteriormente.Deje reposar de uno a dos minutos y luego enjuague con medio L-15. Esto evitará que el tejido se adhiera al interior de la punta. Ahora, desprenda una sección del embrión utilizando un microcuchillo y retire la sección del recipiente usando una pipeta P-2 o P-10 equipada con una punta de 200 microlitros.Intente utilizar la menor cantidad posible de medio. Vortexe la mezcla de colágeno y coloque de cinco a ocho microlitros de ella sobre un recipiente con fondo de vidrio recubierto de poliol lisina y una cubeta como base; inmediatamente coloque el corte del embrión en el colágeno y posicione con un par de pinzas finas. Las LIC deben colocarse de modo que el lado que se va a observar quede al ras con la cubeta.El tejido debe adherirse al recubrimiento de poliolisina en la laminilla. Repita esto hasta que tenga varias secciones sobre la laminilla. Por lo general, se colocan de seis a nueve secciones en un solo cultivo.Una vez que todas las secciones estén en su lugar, agregue de dos a tres microlitros de medio L-15 a la gota de colágeno más antigua y cubra el recipiente. Deje que el colágeno se solidifique durante 20 minutos. Una vez que el colágeno haya solidificado, agregue cuidadosamente dos mililitros de medio de cultivo de secciones que se haya equilibrado durante al menos una hora en un ambiente con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius.Debe tenerse cuidado de no desalojar el colágeno del cubreobjetos; colóquelo en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y permita que las secciones se recuperen durante al menos tres horas antes de la adquisición de imágenes. Visualizar el comportamiento celular dentro del tejido durante largos períodos de tiempo con alta resolución temporal y espacial es un desafío. Una combinación de condiciones óptimas de cultivo y el uso de microscopía de campo claro es esencial para obtener buenos resultados.Se utiliza un microscopio de campo amplio Delta Vision Core equipado con una cámara ambiental estación meteorológica para obtener imágenes de los cortes. La cámara se mantiene constantemente a 37 grados Celsius con un aparato de perfusión de dióxido de carbono para mantener la platina del microscopio al 5% de dióxido de carbono y 95% de aire. La obtención de imágenes se lleva a cabo normalmente usando un objetivo de inmersión en aceite de 40 aumentos y apertura numérica 1.30, y las imágenes se capturan con una cámara CCD Core Snap HQ2. Se capturan secciones Z cada 1,5 micrómetros a lo largo de 45 micrómetros de tejido. El tiempo de exposición debe mantenerse tan bajo como sea posible, por ejemplo, entre cinco y 50 milisegundos.Para cada sección mencionada, se capturan imágenes cada siete minutos. Se pueden visitar hasta nueve cortes utilizando los sistemas Delta Vision. La función de visita de punto preciso mostrada aquí es un ejemplo de una secuencia de lapsos de tiempo de una célula progenitora de la médula espinal transfectada con un constructo que expresa GFP alfa-tubulina; el registro por imagen se inició en un corte de médula espinal de un embrión de dos días de edad, etapa HH 12.En esta etapa temprana, las células progenitoras neurales experimentan predominantemente divisiones en modo progenitor-progenitor, durante las cuales las células se dividen para generar dos células progenitoras adicionales en ciclo. Esta figura muestra cuadros seleccionados de la secuencia de lapso de tiempo mostrada anteriormente. A las dos horas y 20 minutos, la célula se divide con un plano de escisión perpendicular a la superficie apical, generando dos células hijas.Estas dos células se dividen nuevamente a las 24 horas y 23 minutos y a las 25 horas y 54 minutos. Esta siguiente secuencia de lapso de tiempo corresponde a una célula transfectada con G-F-P-G-P-I que marca la membrana celular. Esta célula experimenta una división durante la cual el proceso basal se divide en dos, indicado por las flechas blancas, y es heredado equitativamente por las células hijas.Los fotogramas seleccionados de esta secuencia de lapsos de tiempo muestran que la división celular ocurre a cero horas y 49 minutos. Después de ver este video, deberías tener una buena idea de cómo preparar e imaginar cortes de la médula espinal. Recuerda, si eres nuevo en esta técnica, podrías tener dificultades al principio, ya que existen varios pasos técnicamente desafiantes que deben coordinarse correctamente para que funcione.

high-resolution-live-imaging-cell-behavior-developing

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo describe imágenes de las neuronas individuales o de las células de la cresta neural en embriones de pez cebra de vida. Este método se utiliza para examinar los comportamientos celulares y la localización de actina mediante fluorescencia confocal time-lapse microscopía.

Imágenes en directo de la motilidad celular y citoesqueleto de actina de las neuronas individuales y las células de la cresta neural en embriones de pez cebra

El vídeo de la actualidad muestra un método que aprovecha las ventajas de la combinación de electroporación y la microscopía confocal para realizar las imágenes en vivo en cada células progenitoras neurales en el cerebro anterior pez cebra en desarrollo.

Time-lapse de imágenes en vivo de la relación clonal con células progenitoras neurales en el cerebro anterior El desarrollo de pez cebra

Se describe un protocolo en tiempo real videoimaging de la migración neuronal en el cerebro anterior del ratón. La migración de viralmente marcados o injertado precursores neuronales se registró en rebanadas agudas en vivo utilizando de gran campo de imagen fluorescente con un intervalo de adquisición relativamente rápido para estudiar las diferentes fases de la migración de células, incluyendo las duraciones de las fases estacionaria y la migración y la velocidad de migración.

Time-lapse de imágenes de Migración neuroblasto en rodajas agudas del cerebro anterior ratón adulto

Aquí desarrollamos las herramientas necesarias...

Ex vivo de imágenes en vivo de las divisiones sola celda en ratón neuroepitelio

Este protocolo describe cómo reproducir la división de células dentro de un tejido en Caenorhabditis elegans embriones. Mientras que varios protocolos describen cómo la división celular imagen en el embrión temprano, este protocolo se describe cómo la imagen de la división celular dentro de un tejido en desarrollo durante la embriogénesis tardía mediados.

Visualizar Neuroblast Citocinesis Durante<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriogénesis

La mitosis progenitoras neurales es un parámetro crítico de la neurogénesis. Gran parte de nuestra comprensión de la mitosis progenitoras neurales se basa en el análisis de tejido fijado. Formación de imágenes en vivo en rodajas de cerebro de embriones es una técnica versátil para evaluar la mitosis con alta resolución temporal y espacial en un entorno controlado.

Imágenes en vivo de la mitosis en el desarrollo de la corteza de embriones de ratón

Este protocolo detalla un método simplificado utilizado para llevar a cabo imágenes de células vivas en el contexto de un cerebro de larvas intacta. Enfoques imágenes de células vivas tienen un valor incalculable para el estudio de las divisiones asimétricas de células madre neuronales, así como otros procesos neurogénicos y de desarrollo, descubriendo constantemente los mecanismos que se pasaron por alto anteriormente.

Imágenes en vivo de<em&gt; Drosophila</em&gt; larvales neuroblastos

Se describe un protocolo robusto para monitorear las poblaciones neuronales de Time-lapse vídeo-microscopía seguido basado en software de post-processing. Este método representa una poderosa herramienta para identificar acontecimientos biológicos en una población seleccionada durante los experimentos de imagen vivo.

La proyección de imagen seguida de la célula de seguimiento para la biología de la célula de Monitor y la progresión de linaje de poblaciones neuronales múltiples en vivo

Aquí, nos proporcionan un método confiable y de bajo costo para generar culturas de electroporated cerebro organotypic rebanada de embriones de ratón adecuados para microscopía confocal y técnicas de imagen en vivo.

Ex útero Electroporación y culturas Organotypic rebanada de cerebros embrionarios de ratón para vivir-la proyección de imagen de interneuronas GABAérgicas de migrando

Este protocolo describe el uso de un peróxido de hidrógeno genéticamente codificado (H2O2)-biosensoren neuronas de pez cebra cultivadas y larvas para evaluar las funciones fisiológicas de señalización de H 2 O2durante el desarrollo del sistema nervioso. Se puede aplicar a diferentes tipos de células y modificar con tratamientos experimentales para estudiar especies reactivas de oxígeno (ROS) en el desarrollo general.

Ros imágenes de células vivas durante el desarrollo neuronal

Durante el desarrollo de la corteza cerebral, las neuronas y las células gliales se originan en la zona ventricular que recubre el ventrículo y migran hacia la superficie cerebral. Muchos genes están involucrados en este proceso. Este protocolo introduce la técnica para la obtención de imágenes en time-lapse de las neuronas migratorias y los progenitores gliales.

Imágenes de lapso de tiempo de neuronas migratorias y progenitores gliales en cortes de cerebro de ratón embrionario

Aprende a realizar imágenes de alta resolución del comportamiento celular en el neuroepitelio embrionario de pollo usando microscopía de campo amplio. Esta técnica permite observar células individuales durante períodos prolongados con resolución espacial y temporal óptima.

Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

Explorar más videos