Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes del comportamiento de las células dentro del tubo neural embrionario a alta resolución durante largos períodos de tiempo. Esto se logra seccionando primero el tubo neural temprano con una construcción que impulsa la expresión de una proteína fluorescente de elección para marcar células individuales. El siguiente paso es hacer rodajas del embrión temprano y montarlas en platos con fondo de vidrio.

Después de la recuperación en una incubadora, los fragmentos de embrión se visualizan en un microscopio de campo amplio a intervalos regulares. En última instancia, esta técnica se puede utilizar para estudiar el comportamiento celular dentro del epitelio neurológico en desarrollo durante largos períodos de tiempo con alta resolución espacial y temporal. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes para obtener imágenes de tejidos vivos es que nos permite observar el comportamiento de las células individuales durante largos períodos de tiempo con una alta resolución espacial y temporal.

Este método le permite abordar preguntas clave en el campo de la neurobiología del desarrollo, como el papel de la orientación del huso mitótico en la elección de sulfato, o cómo la dinámica de señalización podría estar regulando el comportamiento celular antes de la electroporación de plásmidos en el tubo neural. Las agujas de vidrio se preparan utilizando un micro extractor capilar bajo un microscopio de disección. Use pinzas finas para romper la punta de la aguja.

El extremo de la aguja debe ser lo suficientemente afilado como para perforar el tubo neural y no debe ser tan estrecho que impida la inyección de la solución de ADN. Los X de este experimento se han incubado a 37 grados centígrados durante unas 36 horas para hacer una hamburguesa de Hamilton. Etapa 10.

Para comenzar este procedimiento, se inyecta ADN en el tubo neural. El ADN está coloreado con una pequeña cantidad de verde rápido para su visualización. Aplique una corriente de 12 a 17 voltios y una longitud de pulso de 50 milisegundos tres veces con 950 milisegundos entre pulsos.

Se utilizan bajas concentraciones de ADN y bajos voltajes de electroporación para lograr la expresión en mosaico, de modo que se pueda seguir a las células individuales. Finalmente, cubra la ventana con la cáscara de huevo con cinta adhesiva, asegurándose de que esté sellada. Deje que los embriones se recuperen durante tres o cuatro horas o toda la noche a 37 grados centígrados.

La mezcla de colágeno y el medio de cultivo en rodajas deben prepararse aproximadamente una hora antes de cortar los embriones. Para preparar bien la mezcla de colágeno a 100 microlitros de solución de ácido acético al 0,1% por 300 microlitros de colágeno tipo uno y vórtice, agregue 100 microlitros de cinco veces L 15, medio y vórtice a fondo. De nuevo, la solución debería volverse amarilla.

A continuación, agregue de 15 a 20 microlitros de bicarbonato de sodio al 7,5% y vórtice bien. La solución debe volverse ligeramente rosada. Mantener en hielo.

Esta mezcla de colágeno debe prepararse fresca cada vez. Para preparar el medio de cultivo en rodajas a los 10 mililitros siguientes de medio neuro basal, suplemento de B 27 glut max y solución de gentamicina, coloque el medio en una incubadora a 37 grados centígrados, tamponada con dióxido de carbono al 5%. Deje la parte superior del recipiente suelta para permitir que se equilibre con el dióxido de carbono durante al menos una hora.

Para comenzar este procedimiento, usa un par de tijeras pequeñas para cortar el embrión. Extraer el embrión del óvulo con unas pinzas de lavado L 15 medio. Coloque el embrión en una placa de cultivo de tejidos con una capa de protector de silicona en la parte inferior.

Sujete el embrión a través de las membranas embrionarias adicionales circundantes para que las membranas se estiren. Con un microbisturí, corte el embrión lo más recto posible a través de la región de interés. En el caso de la médula espinal, las rodajas deben ser de una a dos somitas, rodajas gruesas de hojas adheridas al tejido lateral del embrión para que no se pierdan mientras se cortan otros embriones.

Se necesita una punta micro perpet personalizada para transferir las rodajas de la médula espinal al plato con fondo de vidrio. Para preparar esto, coloque una punta de 200 microlitros en una perman P two o P 10 y corte aproximadamente un milímetro desde el extremo de la punta. Codifique el interior de la punta con colágeno preparando un microlitro de la mezcla de colágeno que se preparó anteriormente.

Dejar actuar de uno a dos minutos y luego enjuagar con L 15 medio. Esto evitará que el pañuelo se pegue al interior de la punta. A continuación, separe una rebanada del embrión con un microcuchillo y retire la rebanada del plato con la punta de 200 microlitros P two o P 10.

Trate de ocupar la menor cantidad de medio posible. Agite la mezcla de colágeno y deje caer de cinco a ocho microlitros en un plato con fondo de vidrio recubierto de poliol lisina con un cubreobjetos como base, coloque inmediatamente la rodaja de embrión en el colágeno y colóquela con un par de pinzas finas. Los LIC deben colocarse de manera que el lado que se va a fotografiar quede al ras con el cubreobjetos.

El tejido debe adherirse al recubrimiento de poliol lisina en el cubreobjetos. Repita esto hasta que tenga varias rebanadas en el cubreobjetos. Por lo general, se colocan de seis a nueve rebanadas en un plato.

Cuando todas las rodajas estén en su lugar, agregue dos o tres microlitros de colágeno L 15, medio al lugar más temprano y cubra el plato. Deje que el colágeno se asiente durante 20 minutos. Una vez que el colágeno esté cuajado, agregue cuidadosamente dos mililitros de medio de cultivo en rodajas que se haya equilibrado durante al menos una hora en 5% de dióxido de carbono y 37 grados centígrados.

Se debe tener cuidado de no desalojar el colágeno del cubreobjetos, colocarlo en una incubadora de dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius y permitir que las rodajas se recuperen durante al menos tres horas antes de la toma de imágenes. Obtener imágenes del comportamiento de las células dentro del tejido durante largos períodos de tiempo con una alta resolución temporal y espacial es un desafío. Una combinación de condiciones óptimas de cultivo y el uso de microscopía de campo blanco es esencial para obtener buenos resultados.

Se utiliza un microscopio de campo amplio con núcleo de visión delta equipado con una cámara ambiental de estación meteorológica para obtener imágenes de los cortes. La cámara se mantiene constantemente a 37 grados centígrados con un aparato de perfusión de dióxido de carbono para mantener la etapa del microscopio al 5% de dióxido de carbono y al 95% de dióxido de carbono. Las imágenes se realizan normalmente utilizando una lente de inmersión en aceite de 40 veces 1,30 NA y las imágenes se capturan con una cámara central HQ dos llamadas CCD, las secciones Z se capturan cada 1,5 micras a través de 45 micras de exposición de tejido. El tiempo debe mantenerse lo más bajo posible, por ejemplo, de cinco a 50 milisegundos.

Para cada sección mencionada, las imágenes se capturan cada siete minutos. Se pueden visitar hasta nueve segmentos utilizando los sistemas de visión Delta. La función precisa de visita al punto que se muestra aquí es un ejemplo de secuencia de lapso de tiempo de una célula progenitora de la médula espinal transfectada con un constructo que expresa GFP alfa Las imágenes de tubulina se iniciaron en un corte de la médula espinal de un embrión de HH en etapa 12 de dos días de edad.

Durante esta etapa temprana, las células progenitoras neurales se someten predominantemente a divisiones en modo progenitor progenitor durante las cuales las células se dividen para generar dos células progenitoras cíclicas adicionales. Esta figura muestra fotogramas seleccionados de la secuencia de lapso de tiempo que se acaba de mostrar. A las dos horas y 20 minutos, la célula se divide con un plano de escisión perpendicular a la superficie apical generando dos células hijas.

Estas dos células se dividen una vez más a las 24 horas y 23 minutos y a las 25 horas y 54 minutos. La siguiente secuencia de lapso de tiempo es de una célula transfectada con G-F-P-G-P-I marcando la membrana celular. Esta célula sufre una división durante la cual el proceso basal se divide en dos, indicado por las flechas blancas, y es heredada igualmente por las células hijas.

Los fotogramas seleccionados de esta secuencia de lapso de tiempo muestran que la división celular se produce a las cero horas y 49 minutos. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo preparar e obtener imágenes de los cortes de la médula espinal. Recuerde, si es nuevo en esta técnica, es posible que tenga dificultades al principio, ya que hay una serie de pasos técnicamente desafiantes que deben combinarse para que esto funcione.