Imágenes de alta resolución en vivo del comportamiento de las células en el desarrollo de neuroepitelio

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes del comportamiento celular dentro del tubo neural embrionario con alta resolución durante largos períodos de tiempo. Esto se logra primero seccionando transversalmente el tubo neural temprano con un constructo que dirige la expresión de una proteína fluorescente de elección para marcar células individuales. El siguiente paso consiste en realizar cortes del embrión temprano y montarlos sobre placas con fondo de vidrio.

Tras la recuperación en una incubadora, las secciones embrionarias se observan en un microscopio de campo amplio a intervalos regulares. En definitiva, esta técnica puede utilizarse para estudiar el comportamiento celular dentro del neuroepitelio en desarrollo durante largos períodos de tiempo con alta resolución espacial y temporal. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes para la obtención de imágenes de tejido vivo es que permite observar el comportamiento individual de las células durante largos períodos de tiempo con alta resolución espacial y temporal.

Este método le permite abordar preguntas clave en el campo de la neurobiología del desarrollo, como el papel de la orientación del huso mitótico en la elección de sulfato o cómo la dinámica de señales podría estar regulando el comportamiento celular antes de la electroforesis de plásmidos en el tubo neural. Se preparan agujas de vidrio utilizando un extractor de microcapilares bajo un microscopio estereoscópico. Utilice pinzas finas para romper la punta de la aguja.

La punta de la aguja debe ser lo suficientemente afilada como para atravesar el tubo neural, pero sin ser tan estrecha que dificulte la inyección de la solución de ADN. Las X para este experimento se han incubado a 37 grados Celsius durante aproximadamente 36 horas hasta la etapa de Hamilton correspondiente al estado de hamburguesa. Etapa 10.

Para comenzar este procedimiento, realice una ventana en el huevo y coloque electrodos separados cinco milímetros a ambos lados del embrión; luego, inyecte ADN en el tubo neural. El ADN se tiñe con una pequeña cantidad de verde brillante para su visualización. Aplique una corriente de 12 a 17 voltios y una duración de pulso de 50 milisegundos, repetida tres veces con intervalos de 950 milisegundos entre cada pulso.

Se utilizan bajas concentraciones de ADN y bajos voltajes de electroforesis para lograr una expresión mosáica, de modo que se puedan seguir células individuales. Finalmente, cubra la ventana en la cáscara del huevo con cinta adhesiva, asegurándose de que quede sellada. Deje que los embriones se recuperen durante tres o cuatro horas o durante la noche a 37 grados Celsius.

La mezcla de colágeno y el medio de cultivo de secciones deben prepararse aproximadamente una hora antes de seccionar los embriones. Para preparar la mezcla de colágeno, añada 100 microlitros de una solución de ácido acético al 0,1 % a 300 microlitros de colágeno tipo I y mezcle completamente mediante vortex. A continuación, añada 100 microlitros de medio L 15 cinco veces concentrado y mezcle completamente mediante vortex. Nuevamente, la solución debe volverse amarilla.

A continuación, agregue de 15 a 20 microlitros de bicarbonato de sodio al 7,5% y vortexee completamente. La solución debe volverse ligeramente rosada. Mantenga en hielo.

Esta mezcla de colágeno debe prepararse fresca cada vez. Para preparar el medio de cultivo de cortes, añada lo siguiente a 10 mililitros de medio neurobasal: suplemento B27, GlutaMAX y solución de gentamicina; coloque el medio en un incubador a 37 grados Celsius, tamponado con 5% de dióxido de carbono. Deje la tapa del recipiente ligeramente abierta para permitir que se equilibre con el dióxido de carbono durante al menos una hora.

Para comenzar este procedimiento, utilice un par de tijeras pequeñas para extraer el embrión. Retire el embrión del huevo con pinzas, lavándolo con medio L 15. Coloque el embrión en una placa de cultivo de tejidos con una capa de Sylgard en el fondo.

Fije el embrión a través de las membranas extraembrionarias circundantes de manera que las membranas queden tensas. Utilizando un microcuchillo, corte el embrión lo más recto posible a través de la región de interés. Para cortes de la médula espinal, el grosor debe ser de uno a dos somitas, con los cortes laminares adheridos al tejido lateral del embrión para que no se pierdan mientras se realizan cortes en otros embriones.

Se necesita una punta microperpet personalizada para transferir los cortes de médula espinal a la placa de fondo de vidrio. Para prepararla, fije una punta de 200 microlitros a una pipeta P2 o P10 permanente y corte aproximadamente un milímetro del extremo de la punta. Code el interior de la punta con colágeno preparando un microlitro de la mezcla de colágeno que se preparó anteriormente.

Deje reposar de uno a dos minutos y luego enjuague con medio L-15. Esto evitará que el tejido se adhiera al interior de la punta. Ahora, desprenda una sección del embrión utilizando un microcuchillo y retire la sección del recipiente usando una pipeta P-2 o P-10 equipada con una punta de 200 microlitros.

Intente utilizar la menor cantidad posible de medio. Vortexe la mezcla de colágeno y coloque de cinco a ocho microlitros de ella sobre un recipiente con fondo de vidrio recubierto de poliol lisina y una cubeta como base; inmediatamente coloque el corte del embrión en el colágeno y posicione con un par de pinzas finas. Las LIC deben colocarse de modo que el lado que se va a observar quede al ras con la cubeta.

El tejido debe adherirse al recubrimiento de poliolisina en la laminilla. Repita esto hasta que tenga varias secciones sobre la laminilla. Por lo general, se colocan de seis a nueve secciones en un solo cultivo.

Una vez que todas las secciones estén en su lugar, agregue de dos a tres microlitros de medio L-15 a la gota de colágeno más antigua y cubra el recipiente. Deje que el colágeno se solidifique durante 20 minutos. Una vez que el colágeno haya solidificado, agregue cuidadosamente dos mililitros de medio de cultivo de secciones que se haya equilibrado durante al menos una hora en un ambiente con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius.

Debe tenerse cuidado de no desalojar el colágeno del cubreobjetos; colóquelo en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono y permita que las secciones se recuperen durante al menos tres horas antes de la adquisición de imágenes. Visualizar el comportamiento celular dentro del tejido durante largos períodos de tiempo con alta resolución temporal y espacial es un desafío. Una combinación de condiciones óptimas de cultivo y el uso de microscopía de campo claro es esencial para obtener buenos resultados.

Se utiliza un microscopio de campo amplio Delta Vision Core equipado con una cámara ambiental estación meteorológica para obtener imágenes de los cortes. La cámara se mantiene constantemente a 37 grados Celsius con un aparato de perfusión de dióxido de carbono para mantener la platina del microscopio al 5% de dióxido de carbono y 95% de aire. La obtención de imágenes se lleva a cabo normalmente usando un objetivo de inmersión en aceite de 40 aumentos y apertura numérica 1.30, y las imágenes se capturan con una cámara CCD Core Snap HQ2. Se capturan secciones Z cada 1,5 micrómetros a lo largo de 45 micrómetros de tejido. El tiempo de exposición debe mantenerse tan bajo como sea posible, por ejemplo, entre cinco y 50 milisegundos.

Para cada sección mencionada, se capturan imágenes cada siete minutos. Se pueden visitar hasta nueve cortes utilizando los sistemas Delta Vision. La función de visita de punto preciso mostrada aquí es un ejemplo de una secuencia de lapsos de tiempo de una célula progenitora de la médula espinal transfectada con un constructo que expresa GFP alfa-tubulina; el registro por imagen se inició en un corte de médula espinal de un embrión de dos días de edad, etapa HH 12.

En esta etapa temprana, las células progenitoras neurales experimentan predominantemente divisiones en modo progenitor-progenitor, durante las cuales las células se dividen para generar dos células progenitoras adicionales en ciclo. Esta figura muestra cuadros seleccionados de la secuencia de lapso de tiempo mostrada anteriormente. A las dos horas y 20 minutos, la célula se divide con un plano de escisión perpendicular a la superficie apical, generando dos células hijas.

Estas dos células se dividen nuevamente a las 24 horas y 23 minutos y a las 25 horas y 54 minutos. Esta siguiente secuencia de lapso de tiempo corresponde a una célula transfectada con G-F-P-G-P-I que marca la membrana celular. Esta célula experimenta una división durante la cual el proceso basal se divide en dos, indicado por las flechas blancas, y es heredado equitativamente por las células hijas.

Los fotogramas seleccionados de esta secuencia de lapsos de tiempo muestran que la división celular ocurre a cero horas y 49 minutos. Después de ver este video, deberías tener una buena idea de cómo preparar e imaginar cortes de la médula espinal. Recuerda, si eres nuevo en esta técnica, podrías tener dificultades al principio, ya que existen varios pasos técnicamente desafiantes que deben coordinarse correctamente para que funcione.