Ingeniería de un hidrogel de dos capas para el control de la diferenciación ASC

El objetivo general de este procedimiento es crear una matriz compuesta hecha de biomateriales naturales que se pueda utilizar para administrar y diferenciar células madre para ayudar en la cicatrización de heridas. Esto se logra aislando primero las células madre derivadas del tejido adiposo o un SC de un animal de prueba. A continuación, los A SC se cargan en microesferas de quitosano prefabricadas.

A continuación, se moldea el gel de colágeno FIBRILADO y las perlas A-S-C-C-S-M se colocan sobre el gel de colágeno. Finalmente, se echa el gel de fibrina PEG sobre el gel de colágeno A-S-C-C-S-M y se agrega medio. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la migración simultánea bidireccional de A SC desde la perla CSM a matrices de colágeno y fibrina PEG.

A través de este procedimiento, una sola fuente de células madre puede tomar señales diferenciales de los microambientes de colágeno y fibrina PEG, y estimularse diferencialmente para producir factores pleiotrópicos y formar una red de estructuras prevasculares. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como los compuestos de un solo material o los sustitutos de la piel descelularizados, es que estos otros productos no abordan activamente la revascularización del producto por parte del huésped. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que el RAD A SE aislado tiene la propensión a diferenciarse hacia un fenotipo vascular cuando se cultiva en una matriz de fibrina de cerdo.

Esta observación despertó la idea de que una sola fuente de células madre podría utilizarse simultáneamente en un sistema que consistía en diferentes biomateriales. Después de aislar y cultivar células madre derivadas del tejido adiposo o ASC, preparar microesferas de quitosano o CSM y cargar las ASC en los CSM, prepare polietilenglicol, hidrogel de fibrina mediante la disolución de glut de succinil y dinamita modificada en cuatro mililitros de solución salina tamponada tris. Justo antes del experimento, utiliza un filtro de 0,22 micras para esterilizar la solución.

En un pocillo de cultivo de una mezcla de seis placas de pocillos, 500 microlitros de caldo de fibrinógeno y 250 microlitros de caldo de PEG incuban durante 20 minutos en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. A continuación, mezcle 250 microlitros de A-S-C-C-S-M previamente preparado con la solución de fibrinógeno pegilado, agregue inmediatamente un mililitro de solución madre de trombina y, con una pipeta, tri rate rápidamente una o dos veces, coloque inmediatamente la mezcla de gel celular en una placa de 12 pocillos e incube en una cámara humidificada con dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, lavar la fibrina peg resultante dos veces con HBSS e incubar con medio esencial alfa mínimo suplementado con 10% de FBS en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% a 37 grados Celsius utilizando técnicas estándar de microscopía óptica durante un período de 11 días.

Observe la migración de células del CSM a la mezcla de gel, A-S-C-C-S-M con colágeno tipo uno extraído de tendones de cola de rata utilizando dos hidróxidos de sodio normales. Ajustar el pH a 6,8 y fibrilar. Agregue la mezcla de colágeno fibrilado, A-S-C-C-S-M a una placa de 12 pocillos e incube en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Después de comprobar que la fibrilación es completa, incubar los geles de colágeno A-S-C-C-S-M durante un máximo de 11 días en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados. Observar la migración de células de CSM al gel durante un período de 11 días utilizando técnicas de microscopía estándar para desarrollar la construcción de bicapa para estudiar las propiedades migratorias y de coinducción de una sola fuente de células madre. Usando dos andamios biológicos.

Prepare tanto el colágeno como los geles de fibrina PEG con las siguientes ligeras modificaciones, prepare un mililitro de 7,5 miligramos por mililitro de colágeno. Luego transfiera la mezcla a un inserto de cultivo de tejido de seis pocillos e incube durante 30 minutos a 37 grados centígrados. Después de la fibrilación completa, coloque sobre la superficie de colágeno, 200 microlitros de cinco miligramos de A-S-C-C-S-M en medio de cultivo.

Una vez que las microesferas se hayan asentado sobre el gel, prepare el gel de fibrina PEG utilizando 250 microlitros de medio de cultivo celular. A continuación, coloque la solución de trombina de fibrinógeno pegilado sobre las capas de colágeno A-S-C-C-S-M. Una vez completado, incube los constructos durante 30 minutos en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5% para lograr la finalización del proceso.

Finalmente, coloque un mililitro de medio en la cámara superior sobre la construcción y tres mililitros de medio en la cámara inferior. La caracterización de un SC incrustado dentro de este andamio reveló que un CSM cargado de SC puede intercalarse entre una capa de colágeno y fibrina peg simultáneamente y diferencialmente tomar señales de ambos entornos extracelulares para prosperar en sus nuevas condiciones. Como se muestra aquí, el colágeno apoyó la capacidad de las ASC para permanecer como células madre, como lo demostró su expresión de stro one en verde, así como su morfología similar a la de los fibroblastos.

Por el contrario, la fibrina PEG indujo a las ASC a diferenciarse hacia un fenotipo avascular, como lo demuestra su morfología en forma de tubo que se muestra aquí, completa con luz y su expresión específica de células endoteliales de la marca y el factor de von Willow que se muestra aquí en rojo. Además, como se demostró aquí, estos fenotipos observados parecían ocurrir temprano en el cultivo y se mantuvieron durante 11 días. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar células madre derivadas del tejido adiposo de rata, cargarlas en chito y microesferas e incorporarlas a un hidrogel bicapa utilizando biomateriales aprobados por la FDA.

No olvide que los biomateriales y las células que se utilizan en este protocolo se derivan de animales y humanos y pueden ser extremadamente peligrosos si están contaminados con patógenos de su huésped. Y siempre se deben tomar precauciones como el equipo de protección personal y las técnicas de cultivo celular aséptico mientras se realizan estos procedimientos.