Name: Construcción de Hojas modular de hidrogel para la arquitectura celular 3D a escala macro micropatterned (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-11T10:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprende a fabricar hojas modulares de hidrogel para cultivos celulares 3D en ingeniería de tejidos. Este método permite crear microambientes controlados sin costos elevados, mejorando ensayos biológicos y estudios celulares in vitro.

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Esta investigación fue apoyada por un Programa Nacional de Laboratorio de Investigación Líder (Subvención NRF-2013R1A2A1A05006378) a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiado por el Ministerio de Ciencia, TIC y Planificación Futura. Los autores también reconocen un programa de atención médica de KAIST Systems.

1. Preparación de la micropatterned Moldes y hidrogeles <ol><li> Producir los patrones de micro-escala deseada utilizando SU-8 fotoprotector en la superficie de una oblea de silicio a través de una de dos pasos 15,17 técnica de fotolitografía estándar para moldes de fundición PDMS. El ejemplo que se muestra utiliza un patrón de malla hígado lóbulo como (Figura 1). </li><li> Pesar PDMS y una solución de agente de curado con una proporción de 1: 5 (es decir, 12,5 g de PDMS y 2,5 g de agente de curado). </li><li> Mezclar el 15 g de la solución a fondo, desgasificar las burbujas en una cámara de vacío, y luego se extendió la solución mezclada sobre una superficie microestructurada de la oblea de silicio uniformemente dentro de un plato de fundición de aluminio. </li><li> Coloque la oblea de silicio sobre una placa de 65 ° C durante 90 min se calienta sobre una superficie plana para curar los PDMS. </li><li> Retire los PDMS curados desde el plato de fundición y la oblea de silicio. </li><li> Cortar los bordes de los PDMS y colocarlo en una placa de Petri de 100 mm de diámetro conel lado micropatterned arriba. </li><li> Lavar los PDMS curados micropatterned en la placa de Petri utilizando etanol al 70% y agua destilada para la esterilización primaria. A continuación, secar completamente durante 10 min en un horno a 65 ° C. </li><li> Disolver y mezclar O / N 3 g de un tensioactivo no iónico en polvo en 100 ml de agua destilada, la creación de un 3% (w / v) solución de revestimiento. </li><li> Coloque los moldes de PDMS micropatterned en un limpiador de plasma y limpiarlos durante 1 min (85 W, 0,73 mbar) para crear una superficie hidrófila, para facilitar la adición de líquidos acuosos. A continuación, recubrir la superficie de los PDMS con la solución de 100 ml de tensioactivo durante al menos 3 hr (Oro / N) utilizando un eje de balancín de laboratorio. </li><li> Lavar la solución de tensioactivo de los moldes de PDMS y secarlas completamente en un horno a 65 ° C durante 10 min. Entonces, esterilizar cada molde microestructurada por la exposición a los rayos ultravioleta (UV) durante 30 min. </li></ol> 2. Preparar la suspensión de células en un hidrogel Precursor <ol><li> Apreparar precursor de hidrogel, se disuelven 0,1 g de polvo de alginato de sodio en 10 ml de tampón fosfato salino (PBS), la creación de un 1% (w / v) precursor de alginato. Para disolver el polvo completamente, incubar y mezclarlas O / N. </li><li> Se filtra la solución a través de un filtro de 0,22 micras conectado a una jeringa de 1 ml. </li><li> Cultivar las células HepG2 en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y 1% de penicilina-estreptomicina en una placa de cultivo tisular convencional hasta 70% - 80% de confluencia en un incubador humidificado 5% de CO2 a 37 ° C . </li><li> Lave las células una vez utilizando PBS, y luego trypsinize ellos añadiendo 1 ml de 0,05% de tripsina-EDTA durante 4 minutos en una incubadora de CO 2 humidificado 5% a 37 ° C. Centrifugar las células recogidas de la placa de cultivo a 250 xg durante 3 min y resuspender usando 1 ml de PBS siguientes eliminación del sobrenadante. </li><li> Contar el número de células individuales distribuidas en PBS utilizando una célula automatizadamostrador. </li><li> Después de centrifugación a 250 xg durante 3 min y la eliminación PBS, añadir 1 ml de la 1% (w / v) de solución de alginato de sodio al sedimento celular restante y mezclar suavemente usando pipeteado. La densidad de siembra final de las células debe ser de 5 × 10 6 - 10 7 células / ml. Se incuba la suspensión de células / hidrogel en un incubador humidificado 5% de CO2 a 37 ° C. </li></ol> 3. Carga y reticulación de celular / hidrogel Suspensión <ol><li> Disolver 1,47 g de cloruro de calcio deshidratar en 100 ml de ddH 2 O para producir un reactivo de reticulación (es decir, 100 mM CaCl 2 · 2H 2 O en ddH 2 O). </li><li> Enjuague el interior de un humidificador con transductor ultrasónico usando 70% de etanol, y llenarlo con 200 ml de reactivo de reticulación. El humidificador es de 110 mm de ancho, 300 mm de largo y 170 mm de profundidad (es decir, 110 mm x 300 mm x 170 mm (W x H x D)). </li><li> Coloque el PDMS micropatternedmoldes en un limpiador de plasma y limpiarlos durante 1 min a 85 W para crear una superficie hidrófila. </li><li> Constantemente cargar 7.2 l de la suspensión de células / hidrogel bien mezclada en el borde de la microestructura en el molde. El ejemplo que se muestra utiliza un patrón de malla hígado lóbulo como (Figura 1). El volumen de la suspensión depende del patrón topográfico. </li><li> Para lograr la gelificación de la suspensión de células / hidrogel, encender el humidificador y verifique que el humidificador produce una niebla del reactivo de reticulación. Pulverizar el reactivo de reticulación en el precursor de hidrogel durante 5 min, que cubre la superficie topográfica de los moldes de PDMS dentro de un rango de 5 cm. Nota: Las distancias más largas y más cortas que 5 cm podrían causar gelificación incompleta y desigual, respectivamente. Asegúrese de que el humidificador tiene una tasa de pulverización de 250 ml / hr, produciendo 20 ml de niebla del reactivo de reticulación en 5 min. </li><li> Tras el proceso de entrecruzamiento, apague el humidificador y llenar el mo PDMSlds con PBS. </li></ol> 4. Manejo de hojas sueltas modular de hidrogel <ol><li> Separe cada hoja hidrogel endurecido de los moldes micropatterned mediante pipeteo PBS suavemente alrededor de la lámina de hidrogel usando una punta de pipeta 200 l. </li><li> Recoge cada hoja hidrogel flotante utilizando un 1000 l extremo de la punta de la pipeta extremo cortado. Cada lámina de hidrogel de malla-lóbulo como el hígado tiene unas dimensiones de 8 mm x 8,7 mm, y ser 100-200 m de espesor. </li><li> Transferir una sola capa de la lámina de hidrogel en 1 ml de DMEM en una placa de 12 pocillos, y cultivar las células in vitro de una manera flotante utilizando el hidrogel construir como un componente unitario en la placa de 12 pocillos durante una semana en un 5 % de CO 2 humidificado incubadora a 37 ° C. Cambie el medio de cultivo cada dos días. </li></ol> 5. Hojas de hidrogel Asamblea de múltiples capas- <ol><li> Repita los pasos 1,1 a 1,5 para producir un marco de PDMS con unas dimensiones de 18 mm x 18 mm x 4 mm (W xH x D), y que contiene estructuras de 170 m de altura de pilar en la superficie inferior. Utilice 42 g de la mezcla de PDMS y agente de curado, con la misma relación que en el paso 1.2. Coloque un molde de policarbonato especializada en la oblea de silicio para el marco de PDMS para crear un marco interior con dimensiones de 8 mm x 9 mm x 2 mm (W x alto x profundidad). </li><li> Esterilizar el marco de PDMS y 180-m-poros papeles de filtro de nylon sumergida en agua destilada y pinzas en un autoclave durante 15 min a 121 ° C. </li><li> Coloque el marco PDMS esterilizada en un cuarto de una pieza de papel de filtro de nylon (con un diámetro de 5 cm) en una placa Petri de diámetro de 60 mm. </li><li> Transferir una lámina de hidrogel modular en el interior del bastidor de PDMS usando una punta de pipeta de 1000 l final de corte. Las láminas de hidrogel utilizados para el montaje deben ser cultivadas durante al menos un día después de que fueron fabricados. </li><li> Alinee el borde de cada hoja de hidrogel modular con el marco PDMS utilizando una punta de pipeta 200 l vacío. </li><li> Repetir los pasos 5.4 y 5.5 el uso de hojas de hidrogel modulares para formar una pila de 4 - 6 capas. </li><li> Retire el medio de cultivo por que fluye hacia fuera a través de las estructuras de pilar en la parte inferior del bastidor de PDMS. A continuación, añadir 2 l de solución de alginato (2% w / v) en una esquina de la construcción multi-capa. </li><li> Pulverizar una niebla del reactivo de reticulación durante 30 segundos en la construcción de múltiples capas para fijar los bordes de cada capa con los de otro. Utilice 2 ml de niebla del reactivo de reticulación (a una velocidad de pulverización de 250 ml / h). </li><li> Enjuague la construcción de múltiples capas suavemente con 400 l DMEM y retire el marco de PDMS con unas pinzas. </li><li> Separe la construcción de varias capas de papel de filtro frotando suavemente con una célula elevador después de la adición de 4 ml de DMEM. </li><li> Transferir el de varias capas construir una placa de 6 pocillos que contiene 3 ml de DMEM usando papel de filtro, y cultivar las células in vitro de una manera flotante, con el hidrogel como construirun andamio celular multi-escala en la placa de 6 pocillos más de una semana en un incubador humidificado 5% de CO 2 a 37 ° C. Cambie el medio de cultivo cada dos días. </li></ol>

<ol><li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 64 (Supplement), 18-23 (2012).</li>
<li>Lan, S., Starly, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+based+3D+hydrogels+as+an+in+vitro+co-culture+model+platform+for+the+toxicity+screening+of+new+chemical+entities%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol.+Appl.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Alginate based 3D hydrogels as an in vitro co-culture model platform for the toxicity screening of new chemical entities.</a> Toxicol. Appl. Pharm. 256 (1), 62-72 (2011).</li>
<li>Szot, C. S., Buchanan, C. F., Freeman, J. W., Rylander, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+in+vitro+bioengineered+tumors+based+on+collagen+I+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D in vitro bioengineered tumors based on collagen I hydrogels.</a> Biomaterials. 32 (31), 7905-7912 (2011).</li>
<li>Lim, F., Sun, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microencapsulated+islets+as+bioartificial+endocrine+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Microencapsulated islets as bioartificial endocrine pancreas.</a> Science. 210 (4472), 908-910 (1980).</li>
<li>Koh, W. G., Itle, L. J., Pishko, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molding+of+hydrogel+microstructures+to+create+multiphenotype+cell+microarrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Molding of hydrogel microstructures to create multiphenotype cell microarrays.</a> Anal. Chem. 75 (21), 5783-5789 (2003).</li>
<li>Xu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Microfluidic+Hydrogel+Capable+of+Cell+Preservation+without+Perfusion+Culture+under+Cell-Based+Assay+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">A Microfluidic Hydrogel Capable of Cell Preservation without Perfusion Culture under Cell-Based Assay Conditions.</a> Adv Mater. 22 (28), 3017-3021 (2010).</li>
<li>Um, E., Lee, D. S., Pyo, H. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+generation+of+hydrogel+beads+and+encapsulation+of+biological+materials+using+a+microfluidic+droplet-merging+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid.+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Continuous generation of hydrogel beads and encapsulation of biological materials using a microfluidic droplet-merging channel.</a> Microfluid. Nanofluid. 5 (4), 541-549 (2008).</li>
<li>Lee, D. H., Lee, W., E, U. m, Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbridge+structures+for+uniform+interval+control+of+flowing+droplets+in+microfluidic+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microbridge structures for uniform interval control of flowing droplets in microfluidic networks.</a> Biomicrofluidics. 5 (3), 034117(2011).</li>
<li>Lee, D. H., Bae , C. Y., Han, J. I., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+analysis+of+heterogeneity+in+the+lipid+content+of+single+green+microalgae+in+alginate+hydrogel+microcapsules%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">In situ analysis of heterogeneity in the lipid content of single green microalgae in alginate hydrogel microcapsules.</a> Anal. Chem. 85 (18), 8749-8756 (2013).</li>
<li>Yamada, M., Sugaya, S., Naganuma, Y., Seki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+synthesis+of+chemically+and+physically+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+guided+cell+growth+and+networking%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Microfluidic synthesis of chemically and physically anisotropic hydrogel microfibers for guided cell growth and networking.</a> Soft Matter. 8 (11), 3122-3130 (2012).</li>
<li>Yamada, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+formation+of+heterotypic+hepatic+micro-organoids+in+anisotropic+hydrogel+microfibers+for+long-term+preservation+of+liver-specific+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Controlled formation of heterotypic hepatic micro-organoids in anisotropic hydrogel microfibers for long-term preservation of liver-specific functions.</a> Biomaterials. 33 (33), 8304-8315 (2012).</li>
<li>Onoe, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metre-long+cell-laden+microfibres+exhibit+tissue+morphologies+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions.</a> Nat. Mater. 12 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>Lee, W., Son, J., Yoo, S. S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+and+Biocompatible+Fabrication+of+Chemically+Sol%E2%88%92Gel+Transitional+Hydrogel+Free-Standing+Microarchitectures%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Facile and Biocompatible Fabrication of Chemically Sol−Gel Transitional Hydrogel Free-Standing Microarchitectures.</a> 12 (1), 14-18 (2011).</li>
<li>Lee, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+hydrogel+biopaper+for+patterned+3D+cell+culture+and+modular+tissue+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthcare+Mater%22%5BJournal%5D)">Cellular hydrogel biopaper for patterned 3D cell culture and modular tissue reconstruction.</a> Adv. Healthcare Mater. 1 (5), 635-639 (2012).</li>
<li>Bae, C. Y., Min, M. K., Kim, H., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometric+effect+of+the+hydrogel+grid+structure+on+in+vitro+formation+of+homogeneous+MIN6+cell+clusters%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Geometric effect of the hydrogel grid structure on in vitro formation of homogeneous MIN6 cell clusters.</a> Lab Chip. 14 (13), 2183-2190 (2014).</li>
<li>Bruzewicz, D. A., McGuigan, A. P., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+of+a+modular+tissue+construct+in+a+microfluidic+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip.</a> Lab Chip. 8 (5), 663-671 (2008).</li>
<li>Choi, S., Park, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+photolithography+to+fabricate+multilevel+microchannels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Two-step photolithography to fabricate multilevel microchannels.</a> Biomicrofluidics. 4 (4), 046503(2010).</li>
<li>Lee, B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+formation+and+collagen-alginate+composite+encapsulation+of+pancreatic+islet+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">In situ formation and collagen-alginate composite encapsulation of pancreatic islet spheroids.</a> Biomaterials. 33 (3), 837-845 (2012).</li>
<li>Cabodi, M., Choi, N. W., Gleghorn, J. P., Lee, C. S., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+biomaterial%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">A microfluidic biomaterial.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (40), 13788-13789 (2005).</li>
<li>Choi, N. W., Cabodi, M., Held, B., Gleghorn, J. P., Bonassar, L. J., Stroock, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Microfluidic scaffolds for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 6 (11), 908-915 (2007).</li>
<li>Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alginate+hydrogels+as+synthetic+extracellular+matrix+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials.</a> Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo proporciona un método sencillo de fabricar láminas de hidrogel modulares, y montaje de ellos para formar andamios celulares 3D. Para construir claras estructuras modeladas de alginato en un corto tiempo, deberíamos identificar un procedimiento de reticulación que pueden crear estructuras suficientemente rígido para mantener los complejos micropatrones del molde, así como mantener la viabilidad celular y el metabolismo. Hemos desarrollado un proceso de reticulación, incluyendo ...

Los hidrogeles son particularmente prometedores biomateriales, y se espera que ser importante en la biología básica, ensayos farmacológicos y la medicina. 1 Biofabrication de constructos celulares a base de hidrogel se ha sugerido para reducir el uso de los experimentos con animales, 2,3 reemplazar los tejidos trasplantables, 4 y mejorar ensayos basados ​​en células. 5,6 que contiene agua-(carburos) materiales viscoelásticos (geles) permiten un gran número de células a encapsular y se mantiene en una estructura de andamio para controlar el microambiente celular 3D. En combinación con la orientación de las tecnologías de microfluidos o micropatterning, la geometría de las construcciones de hidrogel puede ser controlada con precisión a escala celular. Hasta la fecha, una variedad de formas de hidrogeles, incluyendo partículas, fibras 7 - 9, 10 - 12 y hojas, 13 - 15 años han sido utilizados como unidades de construcción en apro bottom-updolores a la fabricación de escala macro arquitecturas multi-celulares. Ambas partículas y fibras a base de hidrogel se han fabricado fácil y rápidamente para aplicaciones como entornos celulares micro-escala, con controles de fluidos utilizando dispositivos de microfluidos. Sin embargo, como las unidades básicas de la ingeniería de tejidos, sería complicado para reorganizar ellos y para ampliar su volumen como construcciones a escala macro. 16 Es más difícil de lograr construcciones macro-escala que producir módulos básicos de tamaño micrométrico. Unidades similar a una lámina de construcciones a base de hidrogel pueden ser usados ​​para aumentar el volumen de los andamios a través de un proceso de montaje simple. Consecuentemente, las capas apiladas de láminas de hidrogel proporcionan no sólo un aumento volumétrico sino también una extensión geométrica en un espacio 3D. Hemos informado anteriormente de un método de fabricación de láminas de hidrogel micropatterned, 13-15 junto con su montaje en multi-layarquitecturas celulares Ered. La técnica permite micropatterning complejo y el diseño modular de los constructos celulares a través de un proceso de apilamiento de las estructuras de varias capas. A través de la fabricación de láminas de hidrogel modulares apilados, que se micropatterned, un sistema de cultivo celular 3D con un microambiente celular escala macro controlada puede ser realizado. Este protocolo de vídeo describe un método de fabricación sencilla pero potente que puede utilizarse para construir hojas de hidrogel modulares, basado en la línea celular de carcinoma de hígado humano (HepG2). Se demuestra en el presente documento sencilla manipulación de estas hojas de hidrogel modulares modelados, y su montaje en una estructura de múltiples capas.

<table><tbody><tr><td>Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>000000000001064291</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2443</td><td>Surfactante no iónico en polvo&nbsp;</td></tr><tr><td>Ácido algínico sal sódica, baja viscosidad</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25266</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Humidificador ultrasónico</td><td>MediHeim</td><td>MH-2800</td><td>Equipo modificado, Tasa máxima de pulverización: 250 ml/h</td></tr><tr><td>Filtro de red de nailon hidrófilo, 180 &mu; m</td><td>EMD Millipore</td><td>NY8H04700</td><td></td></tr><tr>Molde <td></td><td></td> de<td>policarbonato</td><td>Molde personalizado para la fabricación de un patrón de marco PDMS</td></tr></tbody></table>

construcción de hojas modular de hidrogel para la arquitectura celular 3d a escala macro micropatterned

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Los hidrogeles pueden ser modelados en la micro-escala utilizando tecnologías de microfluidos o micropatterning para proporcionar una geometría de tejido vivo -como (3D) tridimensional en. Los constructos celulares a base de hidrogel 3D resultantes se han introducido como una alternativa a los experimentos con animales para estudios biológicos avanzados, ensayos farmacológicos y las aplicaciones de trasplante de órganos. Aunque las partículas y fibras a base de hidrogel pueden ser fabricados fácilmente, es difícil manipularlos para la reconstrucción de tejidos. En este vídeo, se describe un método de fabricación de láminas de hidrogel de alginato micropatterned, junto con su montaje para formar un sistema de cultivo de células en 3D a escala macro con un microambiente celular controlada. Usando una forma de niebla del agente gelificante de calcio, hojas delgadas de hidrogel se generan fácilmente con un espesor en el rango de 100 - 200 m, y con micropatrones precisas. Las células pueden ser cultivadas a continuación, con la orientación geométrica de las hojas de hidrogel encondiciones independientes. Además, las láminas de hidrogel pueden ser manipulados fácilmente utilizando una micropipeta con una punta final de corte, y pueden ser montados en estructuras de varias capas por el apilamiento de ellos utilizando un polidimetilsiloxano modelado (PDMS) marco. Estas hojas de hidrogel modulares, que pueden ser fabricados utilizando un proceso Facile, tienen aplicaciones potenciales de los ensayos in vitro de drogas y estudios biológicos, incluyendo los estudios funcionales de micro y macroestructura y la reconstrucción de tejidos.

Hemos descrito la fabricación y manipulación de láminas de hidrogel autoportante celulares. Como se muestra en la Figura 1, se han fabricado de PDMS micropatterned moldes, y de hidrogel que contiene las células se cargó sobre la superficie hidrófila de estos mohos y reticulada usando un humidificador para generar una niebla de aerosol de agente gelificante. Tras la liberación de los moldes, las células HepG2 se cultivaron en autoportante hojas de hidroge...

Describimos la fabricación de láminas de hidrogel microestampadas utilizando un proceso simple, que se puede ensamblar y manipular de forma independiente. Utilizando estas láminas modulares de hidrogel, se puede generar un sencillo sistema de cultivo celular en 3D a macroescala con un microambiente celular controlado.

Construcción de Hojas modular de hidrogel para la arquitectura celular 3D a escala macro micropatterned

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la fabricación, manipulación y ensamblaje sencillos de láminas modulares de hidrogel para un sistema de cultivo celular tridimensional. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, como cómo crear tejidos funcionales ingenierizados más similares a los tejidos in vivo mediante microentornos cultivados. La principal ventaja de esta técnica es que los constructos celulares de hidrogel pueden generarse sin ningún incremento costoso.Las condiciones de cultivo celular en 3D dependerán de cada lámina hidrogel modular. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia ensayos basados en células y estudios biológicos mejorados, ya que el método puede proporcionar diversas geometrías y composiciones de micro y macro-entornos celulares en 3D. Aunque este método puede aportar información sobre ensayos in vitro basados en células, también puede aplicarse a otro sistema, como un andamiaje trasplantable de un modelo de tejido en 3D.Comience produciendo los patrones a microescala deseados utilizando técnicas estándar de fotolitografía. El ejemplo mostrado en este video utilizará un patrón de malla similar al lobulillo hepático como el que se muestra aquí. A continuación, pese 2,5 gramos de PDMS y 2,5 gramos de la solución del agente de curado y mezcle los componentes completamente.Desgasifique la solución en una cámara de vacío y luego extienda la solución mezclada uniformemente sobre la superficie micropatrón del oblea de silicio dentro de un recipiente de colada con lámina de aluminio. A continuación, cure el PDMS colocando el recipiente sobre la superficie plana de una placa calentada a 65 grados Celsius durante 90 minutos. Una vez curado, retire el PDMS del recipiente de colada y sepárelo cuidadosamente del oblea de silicio.Corte los bordes del PDMS y coloque la porción con el patrón sobre una placa de Petri de 100 milímetros de diámetro, de modo que el lado con el micropatrón quede hacia arriba. Luego, lave el PDMS micropatrón con etanol al 70%, seguido de agua destilada, para realizar la esterilización primaria. Posteriormente, seque completamente el conjunto durante 10 minutos en una estufa a 65 grados Celsius.A continuación, coloque el molde de PDMS con micropatrones en un limpiador de plasma y límpielo durante un minuto para crear una superficie hidrofílica. Esto facilitará la carga de líquidos acuosos. Luego, recubra la superficie del PDMS con 100 mililitros de la solución de agente tensioactivo que se enumera en la Tabla de Materiales.Incube las muestras en un agitador de laboratorio durante al menos tres horas. A continuación, lave la solución de tensioactivo de los moldes de PDMS utilizando agua estéril, y séquelos completamente en una estufa a 65 grados Celsius durante 10 minutos. Luego, esterilice cada molde micropatrón mediante exposición a radiación ultravioleta durante 30 minutos.Comience cultivando células HepG2 utilizando técnicas estándar. Una vez que las células alcancen una confluencia del 70 % al 80 %, lave las células una vez con PBS. A continuación, recoga las células añadiendo un mililitro de tripsina-EDTA al 0,5 % e incube durante cuatro minutos a 37 grados Celsius.Una vez separadas, recopile las células en un tubo de centrífuga y haga un pellet a 250 g durante tres minutos. Retire el sobrenadante y luego resuspenda las células en un mililitro de PBS. Cuente el número de células individuales distribuidas en PBS utilizando un contador automático de células.Luego, centrifugue las células nuevamente a 250 g durante tres minutos. Retire el sobrenadante de PBS y agregue suficiente solución de alginato de sodio al uno por ciento a las células, de modo que la densidad final de siembra esté entre cinco y diez millones de células por mililitro. Mezcle suavemente la solución celular utilizando una pipeta y luego incube la suspensión de hidrogel celular en un incubador humedecido con CO₂ al cinco por ciento a 37 grados Celsius.Mientras las células incuban, coloque los moldes de PDMS con micropatrones en un limpiador de plasma y límpielos durante un minuto a 85 vatios para crear una superficie hidrofílica. Mezcle la suspensión de hidrogel celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo, y luego cargue de forma constante 7,2 microlitros de la suspensión en el borde del micropatrón del molde. A continuación, gelesifique la suspensión de hidrogel celular generando una niebla del reactivo de reticulación con el humidificador a una velocidad de 250 mililitros por hora y rocíela sobre el precursor del hidrogel durante cinco minutos.Asegúrese de que este procedimiento cubra la superficie topográfica del molde de PDMS dentro de un rango de cinco centímetros. Tras el proceso de reticulación, apague el humidificador y llene el molde de PDMS con PBS. Utilizando una pipeta de 200 microlitros, distribuya PBS suavemente alrededor del borde de las láminas de hidrogel endurecidas para desprender cada uno de los hidrogeles.Luego, tome cada lámina de hidrogel flotante utilizando una punta de pipeta de 1.000 microlitros cortada en el extremo. Transfiera cada lámina de hidrogel a pozos individuales de una placa de 12 pozos que contenga un mililitro de DMEM precalentado, de modo que floten sobre la superficie del medio. Cultive las células de esta manera durante una semana, cambiando el medio de cultivo cada dos días.A continuación, produzca un marco de PDMS, que contiene estructuras de pilares de 170 micrones de altura en la superficie inferior, tal como se describe en el protocolo de texto adjunto. Durante la fabricación, coloque un molde especializado de policarbonato sobre la oblea de silicio para que el marco de PDMS forme un marco interior con un ancho de ocho milímetros, una altura de nueve milímetros y una profundidad de dos milímetros. Una vez esterilizado, coloque el marco de PDMS sobre un cuarto de una pieza de papel de filtro de nailon colocada en una placa de Petri de 60 milímetros.Retire las láminas de hidrogel del incubador y transfiera la primera de las láminas modulares de hidrogel al interior del marco de PDMS utilizando una punta de pipeta de 1.000 microlitros con corte en el extremo. Alinee el borde de la lámina modular de hidrogel con el marco de PDMS usando una punta de pipeta de 200 microlitros vacía. Repita este proceso con láminas adicionales de hidrogel hasta lograr una pila de cuatro a seis capas.A continuación, retire el medio de cultivo haciéndolo fluir a través de las estructuras de pilares en la parte inferior del marco de PDMS. Luego, agregue dos microlitros de una solución de alginato al dos por ciento en una esquina del constructo multicapa. Utilizando un humidificador, rocíe un aerosol del reactivo de reticulación a una velocidad de 250 mililitros por hora sobre el constructo multicapa durante treinta segundos para unir los bordes de cada capa entre sí.Luego, enjuague suavemente el constructo multicapa con 400 microlitros de DMEM y retire el marco de PDMS utilizando una pinza. A continuación, agregue cuatro mililitros adicionales de DMEM. Desprenda el constructo multicapa junto con el papel de filtro pasando suavemente un lifter celular y luego use el papel de filtro para transferirlo a una placa de seis pocillos que contenga tres mililitros de DMEM.Cultive las células de manera flotante con un constructo de hidrogel como andamio celular multiescala en la placa de seis pocillos durante al menos una semana. Cambie el medio de cultivo cada dos días. Aquí se muestra el resultado de un ensamblaje capa por capa de láminas de hidrogel micropatroneadas similares a lobulillos hepáticos, donde células de carcinoma hepático humano que fluorescen en verde y fibroblastos NIH-3T3 que fluorescen en rojo se cultivaron juntos en co-cultivo sobre una malla combinada.Utilizando la técnica presentada aquí, se pueden crear muchas variaciones de patrones, incluyendo pilares hexagonales, mallas delgadas, matrices completas y múltiples microfibras en forma de micropeine, en forma de un constructo de hidrogel delgado del orden de 100 a 200 micrómetros. Estas estructuras proporcionan un rico entorno de cultivo tridimensional para muchos tipos celulares diferentes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear láminas de hidrogel celularizadas para diseñar sistemas de cultivo 3D similares al entorno in vivo, desde abajo hacia arriba.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

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