Construcción de Hojas modular de hidrogel para la arquitectura celular 3D a escala macro micropatterned

El objetivo general de este procedimiento es demostrar la fabricación, manipulación y ensamblaje simples de láminas modulares de hidrogel para un sistema de cultivo celular en 3D. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, como por ejemplo cómo crear tejidos de ingeniería funcional más similares a los in vivo con microentornos cultivados. La principal ventaja de esta técnica es que las construcciones de hidrogel celular se pueden generar sin ningún incremento costoso.

Las condiciones de cultivo celular 3D dependerán de cada lámina de hidrogel modular. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la mejora de los ensayos basados en células y los estudios biológicos, ya que la técnica puede proporcionar diversas geometrías y composición de micro y macroentornos celulares en 3D. Aunque este método puede proporcionar información sobre los ensayos in vitro basados en células, también se puede aplicar a otro sistema, como el andamio trasplantable del modelo de tejido 3D.

Comience por producir los patrones de microescala deseados utilizando técnicas de fotolitografía estándar. El ejemplo que se muestra en este video utilizará un patrón de malla similar a un lóbulo hepático como el que se muestra aquí. A continuación, pese 2,5 gramos de PDMS y 2,5 gramos de la solución de agente de curado y mezcle bien los componentes.

Desgasifique la solución en una cámara de vacío y luego extienda la solución mezclada sobre la superficie del micropatrón de la oblea de silicio de manera uniforme dentro de un plato de fundición de papel de aluminio. A continuación, cure el PDMS colocando el plato sobre la superficie plana de una placa calentada a 65 grados centígrados durante 90 minutos. Una vez curado, retire el PDMS de la placa de fundición y retírelo con cuidado de la oblea de silicona.

Corta los bordes del PDMS y coloca la parte estampada en una placa de Petri de 100 milímetros de diámetro para que el lado del micropatrón quede hacia arriba. A continuación, lavar el PDMS micropatrón con etanol al 70%, seguido de agua destilada, para la esterilización primaria. Después, seca completamente la configuración durante 10 minutos en un horno a 65 grados centígrados.

A continuación, coloque el molde de PDMS microestampado en un limpiador de plasma y límpielos durante un minuto para crear una superficie hidrófila. Esto facilitará la carga de líquidos acuosos. A continuación, cubra la superficie del PDMS con 100 mililitros de la solución de tensioactivo que se indica en la Tabla de materiales.

Incubar las muestras en una mecedora de laboratorio durante al menos tres horas. A continuación, lave la solución de tensioactivo de los moldes PDMS con agua estéril y séquelos completamente en un horno a 65 grados centígrados durante 10 minutos. Luego, esteriliza cada molde microestampado exponiéndolo a la radiación ultravioleta durante 30 minutos.

Comience por cultivar células hepg2 utilizando técnicas estándar. Una vez que las células estén confluentes entre un 70% y un 80%, lávelas una vez con PBS. A continuación, recoja las células añadiendo un milímetro de 05%tripsin edta e incubándolas durante cuatro minutos a 37 grados centígrados.

Una vez desmontadas, recoger las células en un tubo de centrífuga y granularlas a 250 g durante tres minutos. Retire el sobrenadante y luego vuelva a suspender las células en un milpiés de PBS. Cuente el número de celdas distribuidas individuales en PBS mediante un contador de celdas automatizado.

A continuación, vuelva a pellet las células a 250 g durante tres minutos. Retire el sobrenadante PBS y agregue suficiente solución de alginato de sodio al uno por ciento a las células para que la densidad final de siembra esté entre cinco y diez millones de células por mililitro. Mezcle la solución celular suavemente con una pipeta y luego incube la suspensión de hidrogel celular en una incubadora humidificada con CO2 al cinco por ciento a 37 grados centígrados.

Mientras las células incuban, coloque los moldes de PDMS micropatrones en un limpiador de plasma y límpielos durante un minuto a 85 vatios para crear una superficie hidrófila. Mezcle la suspensión de hidrogel celular pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo y luego cargue constantemente 7,2 microlitros de la suspensión en el borde del micropatrón en el molde. A continuación, gelificar la suspensión de hidrogel celular produciendo una niebla del reactivo de reticulación con el humidificador a una velocidad de 250 mililitros por hora y rociándola sobre el precursor de hidrogel durante cinco minutos.

Asegúrese de que este procedimiento cubra la superficie topográfica del molde PDMS dentro de un rango de cinco centímetros. Después del proceso de reticulación, apague el humidificador y llene el molde de PDMS con PBS. Con una pipeta de 200 microlitros, dispense PBS suavemente alrededor del borde de las láminas de hidrogel endurecidas para separar cada uno de los hidrogeles.

A continuación, recoja cada lámina de hidrogel flotante con una punta de pipeta de 1.000 microlitros de corte final. Transfiera cada lámina del hidrogel a pocillos individuales de una placa de 12 pocillos que contenga un milímetro de DMEM precalentado para que floten en la superficie del medio. Cultive las células de esta manera durante una semana, intercambiando el medio de cultivo cada dos días.

A continuación, produzca un marco PDMS, que contenga estructuras de pilar de 170 micras de altura en la superficie inferior, como se describe en el protocolo de texto adjunto. Durante la fabricación, coloque un molde de policarbonato especializado en la oblea de silicio para el marco PDMS para crear un marco interior con un ancho de ocho milímetros, una altura de nueve milímetros y una profundidad de dos milímetros. Una vez esterilizado, coloque el marco PDMS en un cuarto de trozo de papel de filtro de nailon colocado en una placa de Petri de 60 milímetros.

Retire las láminas de hidrogel de la incubadora y transfiera la primera de las láminas de hidrogel modulares al interior del marco PDMS utilizando una punta de pipeta de 1.000 microlitros de corte final. Alinee el borde de la lámina de hidrogel modular con el marco PDMS utilizando una punta de pipeta vacía de 200 microlitros. Repita este proceso con láminas de hidrogel adicionales hasta lograr una pila de cuatro a seis capas.

A continuación, retire el medio de cultivo haciéndolo fluir a través de las estructuras de pilares en la parte inferior del marco PDMS. Luego, agregue dos microlitros de una solución de alginato al dos por ciento en una esquina de la construcción multicapa. Con un humidificador, rocíe una neblina del reactivo de reticulación a una velocidad de 250 milímetros por hora sobre la construcción multicapa durante treinta segundos para unir los bordes de cada capa.

A continuación, enjuague suavemente la construcción multicapa con 400 microlitros de DMEM y retire el marco PDMS con una pinza. A continuación, añade cuatro mililitros adicionales de DMEM. Separe la construcción de varias capas con el papel de filtro limpiándola suavemente con un elevador de celdas y luego use papel de filtro para transferirla a una placa de seis pocillos que contenga tres mililitros de DMEM.

Cultive las células de forma flotante con una construcción de hidrogel como un andamio celular multiescala en la placa de seis pocillos durante al menos una semana. Intercambie el medio de cultivo cada dos días. Aquí se muestra el resultado de un ensamblaje capa por capa de láminas de hidrogel microestampadas similares a lóbulos hepáticos, donde las células de carcinoma de hígado humano con color verde fluorescente y fibroblastos NIH-3T3 con color rojo fluorescente se cultivaron juntas en cocultivo en una malla combinada.

Usando la técnica presentada aquí, se pueden crear muchas variaciones de patrones, incluidos pilares hexagonales, mallas delgadas, matrices completas y múltiples microfibras similares a micropeines en forma de una construcción de hidrogel delgada del orden de 100 a 200 micrómetros. Estas estructuras proporcionan un rico entorno de cultivo 3D para muchos tipos de células diferentes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear láminas de hidrogel celular para diseñar sistemas de cultivo 3D similares a in vivo desde abajo.