Name: Gradiente de densidad multicapa polimerización (DGMP): una técnica novedosa para la creación de multi-compartimiento, Andamios personalizables para Ingeniería de Tejidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-02-12T12:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 54 s
Description: Aprende a crear andamios multicapa para ingeniería de tejidos mediante polimerización UV con gradiente de densidad. Este método económico permite estudiar el comportamiento celular sin equipamiento costoso.

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Los autores agradecen el apoyo de los Premios Innovadores Nuevos NIH Director (1DP2 OD006499-01 a AA y 1DP2 OD006460-01 a AJE) y la Ciudad Rey Abdulaziz para la Ciencia y la Tecnología (Universidad de California en San Diego Centro de Excelencia en Nanomedicina). Nos gustaría dar las gracias a la Sra. Jessica Moore por sus comentarios críticos sobre el manuscrito.

1. Síntesis de la etiqueta fluorescente acriloil-PEG-RGDS <ol><li> Reaccionar el péptido RGDS con acriloil-PEG-succinimidil éster de carboximetil (APEG-SCM, PEG MW: 3400 g / mol) y diisopropiletilamina NN (DIPEA) en 1.2:1:2 relaciones molares en sulfóxido de dimetilo (DMSO) en atmósfera de argón a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Confirmar conjugación por láser asistida por matriz de desorción / ionización tiempo de vuelo (MALDI-TOF) espectrometría de masas. Añadir 1 ml de solución de reacción APEG-RGDS a un punto de la muestra sobre la diana MALDI y seco. Preparar una solución saturada de Universal MALDI Matrix en tetrahidrofurano (THF) y agitar durante 1 min. Añadir ~ 1 l de esta solución para el punto de la muestra misma. Repita el procedimiento para APEG-SCM para la comparación. Cargar y analizar. El peso molecular de APEG-RGDS debe ser mayor que APEG-SCM (Figura 2). </li><li> Para conjugar el fluoróforo, añadir una cantidad equimolar de Alexa Fluor 350 de ácido carboxílico (succinimydyl éster), disueltoen un volumen mínimo de DMSO, a la solución de reacción APEG-RGDS de 1,1 y reaccionar en atmósfera de argón a temperatura ambiente durante la noche. </li><li> Purificar APEG-350-RGDS por diálisis (PM 3500 Da) contra DI-H 2 O a 4 º C durante 48 hr en relación volumétrica 1,000:1, el intercambio de dializado al menos dos veces por día. </li><li> Se liofiliza la purifica-RGDS APEG-350 en un Labconco Freezone Plus o el sistema de congelación en seco equivalente y se almacena a -20 ° C. </li></ol> 2. La preparación de un molde 2D y fabricación de un gel 2D con PEG-350 Rgds alterna capas <ol><li> Preparar portaobjetos de vidrio hidrófobos. Coloque portaobjetos de vidrio limpias en un plato de vidrio en un horno de vacío. Calentar a 80 ° C durante 30 min para secar completamente las superficies. Lugar plato con diapositivas en una campana de extracción y añadir 250 l Sigmacote para cada diapositiva, agitando suavemente durante 30 segundos a la superficie de capa entera. Enjuague bien los portaobjetos recubiertos con 100% de metanol, seguido de lavado en agua destilada, empapando dos veces durante 5 min en al LEAt 10 ml. </li><li> Cortar separadores de silicona (0,8 mm de espesor) con 10 mm sacabocados. </li><li> Autoclave los separadores de silicona y Sigmacote tratados con portaobjetos de vidrio. </li><li> Formular soluciones para cada capa respectiva en tubos de microcentrífuga individuales mediante la mezcla de diacrilato de PEG (PEGDA) precursor (concentración final 15% w / v) con diferentes cantidades de iodixanol (60% solución madre en agua) para dar concentraciones finales que varían (por ejemplo, 40%, 30%, 20% y% 10), se completa el volumen restante con tampón fosfato salino (PBS) para obtener soluciones de densidades graduadas. De una manera similar, para capas alternas, mezcla APEG-RGDS-350 (concentración final 8 mM) con iodixanol y PBS para dar concentraciones diferentes (por ejemplo, 35%, 25%, y% 15). </li><li> Añadir fotoiniciador (2-hidroxi-4&#39;-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona, stock 333mg/ml en N-vinil pirrolidona) a cada solución para las diversas capas (10 l de solución madre por ml de cada solución de la capa). Fotoiniciador is añadió el pasado para prevenir la polimerización antes de la estratificación de los geles en el molde, ya que es sensible a la luz. </li><li> Los pasos posteriores de este protocolo se realiza en una cabina de bioseguridad para asegurar la esterilidad. </li><li> Filtrar a esterilizar cada solución utilizando una jeringa estéril de 1 ml y 0,2 micras de filtro. Montar la configuración de molde intercalando el espaciador entre dos portaobjetos de vidrio tratados con Sigmacore y asegurar con abrazaderas de colocación como se representa en la figura 1. </li><li> Reparto de los geles de capas mediante la adición de la solución más densa (por ejemplo PEGDA con 40% iodixanol) primero, seguido por una solución menos denso (por ejemplo APEG-RGDS-350 con 35% iodixanol). Repita la estratificación alternativo para lograr varias capas de composición deseada y densidades, como se muestra en la figura 1. </li><li> Irradiar el molde con luz de 365 nm durante 3 min usando un portátil UVR-9000 lámpara. Permitir que los geles polimerizados curar durante 5 min. Retire las abrazaderas, y luego levante suavemente la tapa de cristaldiapositiva y el molde, los geles dGMP estratificados se mantendrá en las diapositivas. Usando una espátula estéril, se coloca cuidadosamente los geles en un tubo de 50 ml que contenía PBS estéril o medio de cultivo para el lavado. </li><li> Lavar los geles polimerizados en PBS a 1,000:1 relación volumétrica, el intercambio de tampón por lo menos dos veces al día para eliminar el modificador de la densidad, fotoiniciador, y polímero sin reaccionar. Alternativamente, el PBS se puede intercambiar con medio de crecimiento celular. La tienda de los geles dGMP en PBS o medio de crecimiento para el experimento de cultivo de células se describe en el paso 3. </li><li> Para visualizar capas alternas, organizar gel DGMP (estos geles no se podrá utilizar para el cultivo celular) a lo largo de una regla en la bandeja de muestras de una unidad documental VersaDoc gel. Exponer los geles en 350 nm, el tiempo de exposición variará dependiendo de la concentración del fluoróforo. Alternancia de bandas oscuras y azul en el hidrogel DGMP demostrar la formación de capas discretas de composición química distinta (Figura 3). </li></ol><ol><li> Para geles incorporan péptido RGDS, utiliza células de adhesión dependientes, como C2C12 mioblastos. </li><li> Suavemente inserte geles dGMP (almacenados en PBS) en los pocillos de placas de 48 pocillos de cultivo de células utilizando un raspador de células estéril en una cabina de bioseguridad. </li><li> Pre-caliente crecimiento medio (medio Eagle modificado de Dulbecco o medio DMEM suplementado con v / v 10% de suero fetal bovino y 1% v / v solución 100x penicilina-estreptomicina) y PBS en un baño de agua a 37 ° C. </li><li> Lavar una placa de 60% confluentes (10 mm) de C2C12 células tres veces con PBS. Aspirar fuera de PBS y las células de la cosecha mediante la adición de 1 ml de 0,25% de tripsina-EDTA y se incubaron a 37 ° C durante 2 min. Resuspender las células en medio de crecimiento y células de recuento. Semilla del DGMP gel que contiene el cultivo de células con mioblastos C2C12 bien (20.000 células / cm 2). Se incuban las células a 37 ° C en 5% de CO 2/95% de humedad relativa. Suavemente cambio medio después de 4 horas, cuidando de no volver amover ligeramente las células adheridas. </li><li> Después de 24 h, la unión de mioblastos C2C12 sobre las capas que contienen RGDS de geles dGMP puede ser confirmada por epifluorescencia y la microscopía de contraste de fase (Zeiss Axiovert 200). </li></ol>

<ol><li>Place, E. S., Evans, N. D., Stevens, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexity+in+biomaterials+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Complexity in biomaterials for tissue engineering.</a> Nat. Mater. 8, 457-470 (2009).</li>
<li>Liu, V. A., Jastromb, W. E., Bhatia, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+protein+and+cell+adhesivity+using+PEO-terminated+triblock+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Mater.+Res%22%5BJournal%5D)">Engineering protein and cell adhesivity using PEO-terminated triblock polymers.</a> J. Biomed. Mater. Res. 60, 126-134 (2002).</li>
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<li>Karpiak, J. V., Ner, Y., Almutairi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Density+gradient+multilayer+polymerization+for+creating+complex+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Density gradient multilayer polymerization for creating complex tissue.</a> Adv. Mater. 24, 1466-1470 (2012).</li>
<li>Pierschbacher, M. D., Ruoslahti, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+attachment+activity+of+fibronectin+can+be+duplicated+by+small+synthetic+fragments+of+the+molecule%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell attachment activity of fibronectin can be duplicated by small synthetic fragments of the molecule.</a> Nature. 309, 30-33 (1984).</li>
<li>Kaushik, G., Fuhrmann, A., Cammarato, A., Engler, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+In+Situ+Mechanical+Analysis+of+Myofibrillar+Perturbation+and+Aging+on+Soft%2C+Bilayered+Drosophila+Myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)"> In Situ Mechanical Analysis of Myofibrillar Perturbation and Aging on Soft, Bilayered Drosophila Myocardium.</a> Biophysical Journal. 101, 2629-2637 (2011).</li>
</ol>

Los autores no tienen conflictos de intereses a revelar.

DGMP es una estrategia sencilla para la preparación de geles de capas múltiples que no se basan en instrumentos costosos. Este protocolo se puede adaptar para crear andamios utilizando otros materiales biocompatibles, tales como colágeno y ácido hialurónico. Pequeñas moléculas bioactivas, por ejemplo de células que promueve la adhesión péptido RGDS, puede estar amarrado a la matriz de polímero para evitar la mezcla de las señales entre las capas. Las proteínas se pueden encapsular en capas distintas, sin necesidad de conjugación química, ya que, dependiendo del tamaño de la malla de la matriz, son menos propensos a difundirse a través de hidrogeles 10. Aquí hemos utilizado iodixanol (Nycoprep), un modificador de la densidad inerte, que se ha utilizado anteriormente para las aplicaciones de células viables. Otros modificadores de la densidad tales como sacarosa y dextrosa también se puede utilizar. Al variar el tiempo de establecimiento (t s), se puede ajustar con precisión las interfaces entre las dos capas para producir una transición suave o fuerte, según sea necesario (tiempo de asentamiento más aporta mayor suavidad a las transiciones) &lt;sup&gt; 10. Por ejemplo, transiciones más suaves entre las capas de gel dGMP podría ser utilizado para generar un gradiente continuo de una señal biológica para estudiar procesos celulares, tales como la quimiotaxis. El efecto modificador de la densidad sobre la rigidez de gel se muestra en la Figura 5 para un 15% de gel de aPEGda; una caracterización más completa de la rigidez y de la porosidad como una función de las concentraciones de iodixanol PEGDA y se está evaluando actualmente. Mientras que la concentración de PEGDA en este ejemplo es relativamente alta, se observó un módulo de 60% mayor elástica en geles con 30% iodixanol comparación con los geles sin. El cambio en la rigidez del gel se puede ajustar mediante la modulación de la concentración de macrómero o la densidad de reticulación. También hemos aplicado la técnica DGMP para crear 3D geles de poliacrilamida utilizando múltiples capas y los precursores de PEG 10. La variación de la concentración o el grado de reticulación del prepolímero permite variación estructural en elandamios, que pueden ser utilizados para explorar el comportamiento celular tales como el crecimiento y la migración polarizada en 3D. En resumen, DGMP es una técnica adaptable que se puede aplicar para fabricar andamios 2D y 3D a partir de una variedad de materiales biocompatibles para una amplia gama de aplicaciones de investigación biomédica y de base.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo o Instrumento </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> Polietilenglicol succinimydyl carboximetil (a-PEG-SCM) </td><td> Laysan </td><td> 120-64 </td></tr><tr><td> Polyethelyene glicol diacrilato (PEGDA) </td><td> Dajac Labs </td><td> 9359 </td></tr><tr><td> Arginina-glicina-ácido aspártico-serina (RGDS) </td><td> American Peptide </td><td> 49-01-4 </td></tr><tr><td> N, N - diisopropiletilamina (DIPEA) </td><td> Sigma </td><td> D125806 </td></tr><tr><td> Sulfóxido de dimetilo (DMSO) </td><td> Sigma </td><td> D2438 </td></tr><tr><td> N, N-dimetilformamida (DMF) </td><td> Pescador </td><td> D119-4 </td></tr><tr><td> El tetrahidrofurano (THF) </td><td> Pescador </td><td> T397 </td></tr><tr><td> Casete de diálisis (3500Da) </td><td> Thermo Scientific </td><td> 66330 </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 350 carboxílico succinimydyl </td><td> Life Technologies </td><td> A-10168 </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> Sigma </td><td> SL2 </td></tr><tr><td> Separadores de silicona </td><td> Grainger </td><td> 1MWA4 </td></tr><tr><td> Biopsia golpes </td><td> Acuderm </td><td> P1025 (10 mm) P850 (8 mm) </td></tr><tr><td> Fosfato de Dulbecco tamponada con solución salina (DPBS) </td><td> Hyclone </td><td> SH30028 </td></tr><tr><td> Iodixanol (NycoPrep) </td><td> Pescador </td><td> NC9388846 </td></tr><tr><td> 2-hidroxi-4&#39;-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona </td><td> Sigma </td><td> 410896 </td></tr><tr><td> Dulbecco modificado a medio Eagle (DMEM) </td><td> Life Technologies </td><td> 11054 </td></tr><tr><td> El suero fetal bovino </td><td> Life Technologies </td><td> 10082 </td></tr><tr><td> Penicilina-estreptomicina </td><td> Life Technologies </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> C2C12 mioblastos </td><td> ATCC </td><td> CRL-1772 </td></tr><tr><td> MALDI </td><td> Bruker </td><td> N / A </td></tr><tr><td> UVR-9000 </td><td> Bayco </td><td> UVR-9000 </td></tr><tr><td> VersaDoc </td><td> Bio-Rad </td><td> N / A </td></tr></tbody></table>

gradiente de densidad multicapa polimerización (dgmp): una técnica novedosa para la creación de multi-compartimiento, andamios personalizables para ingeniería de tejidos

Density Gradient Multilayered Polymerization (DGMP): A Novel Technique for Creating Multi-compartment, Customizable Scaffolds for Tissue Engineering

Complejas matrices de cultivo de tejidos, en el que los tipos y concentraciones de los estímulos biológicos (por ejemplo, factores de crecimiento, inhibidores, o pequeñas moléculas) o la estructura de la matriz (por ejemplo, composición, concentración, o la rigidez de la matriz) varían en el espacio, que permiten una amplia gama de investigaciones sobre cómo estas variables afectan la diferenciación celular, la migración y otros fenómenos. El principal reto en la creación de matrices de capas es el mantenimiento de la integridad estructural de las interfaces de capa sin difusión de los componentes individuales de cada capa 1. Las metodologías actuales para ello es photopatterning 2-3, litografía 4, functionalization5 secuencial, liofilización 6 de microfluidos 7, 8 o centrifugación, muchos de los cuales requieren instrumentos sofisticados y habilidades técnicas. Otros confían en unión secuencial de las capas individuales, que pueden llevar a la deslaminación de las capas 9 </sup&gt;. DGMP supera estos problemas mediante el uso de un modificador de la densidad inerte tal como iodixanol para crear capas de densidades variables 10. Dado que el modificador de la densidad se puede mezclar con cualquier prepolímero o molécula bioactiva, DGMP permite que cada capa andamio para personalizar. Simplemente variando la concentración del modificador de la densidad evita que se mezclen las capas adyacentes mientras permanecen acuosa. Polimerización subsiguiente solo paso da lugar a una estructura de andamio continuo de múltiples capas, en la que cada capa tiene química distinta y propiedades mecánicas. El modificador de la densidad se puede quitar fácilmente con suficiente lavado sin perturbación de las capas individuales o sus componentes. Esta técnica es por lo tanto muy adecuado para la creación de hidrogeles de diversos tamaños, formas y materiales. Un protocolo para la fabricación de un 2D-polietilenglicol (PEG) gel, en el que las capas alternantes incorporar RGDS-350, se describe a continuación. Utilizamos PEG bomo es biocompatible e inerte. RGDS, una adhesión celular péptido 11, se utiliza para demostrar restricción espacial de una señal biológica, y la conjugación de un fluoróforo (Alexa Fluor 350) nos permite distinguir visualmente distintas capas. Este procedimiento se puede adaptar para otros materiales (por ejemplo, colágeno, ácido hialurónico, etc) y se puede ampliar para fabricar geles 3D con algunas modificaciones 10.

MALDI-TOF análisis confirma la conjugación del péptido RGDS para acriloil-PEG (Figura 2). Gel imagen revela alterna RGDS-350 (azul) capas después de la fotopolimerización (Figura 3A). Como se muestra en la Figura 3A, tamaño del gel 2D DGMP se puede variar en función del diámetro de los moldes de silicona (10 mm, izquierdo; 8 mm, derecha), y por lo tanto son fácilmente adaptables para su uso en múltiples ensayos - en este caso para adaptarse a una 48 así placa de cultivo de células (Figura 3B). Epifluorescencia y la microscopía de contraste de fase de C2C12 mioblastos cultivados en un gel de DGMP muestra unión selectiva en RGDS-350-que contiene capas de PEG (Figura 4), ​​lo que demuestra la compartimentación de la adhesión celular péptido (RGDS). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1.jpg" alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig1highres.jpg"/> Figura 1. Molecular Weight análisis por MALDI-TOF comparar APEG-SCM para APEG-RGDS obtenidos después de la conjugación del péptido RGDS. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2.jpg" alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50018/50018fig2highres.jpg"/> Figura 2. Representación esquemática de DGMP fabricación de gel. Después de los gradientes se disponen en capas, pueden dejarse en reposo durante períodos variables de tiempo (t s) para crear interfaces graduadas, seguido por fotopolimerización. Estratificados geles dGMP puede ser fácilmente extraído del molde para su posterior utilización. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50018/50018fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ampliar la cifra</a> . <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig3.jpg" alt="Figura 3" /> Figura 3. A) geles 2D multicapa obtenidos después de la fotopolimerización imágenes utilizando 350 nm y blancas canales de luz de VersaDoc. gel unidad documental. La escala de grises de la imagen revela alternando capas que contienen RGDS en blanco. B) Inserción de gel DGMP en 48 pocillos de cultivo celular. <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig4.jpg" alt="Figura 4" /> Figura 4. Contraste de fase y de la imagen fusionada de epifluorescencia C2C12 mioblastos cultivados en DGMP geles (barra de escala 50 mm). <img src="/files/ftp_upload/50018/50018fig5.jpg" alt="Figura 5" /> Figura 5. Efecto de la elasticidad del gel iodixanol en superficie. Atómica mediciones de fuerza de microscopía de muestras estáticas de sustratos PEG reticulados utilizando métodos previamente establecidos con un activador 2 nN fuerza 12. * P &lt;0,05 y ** p &lt;0,01.

Aquí se describe una estrategia única para la creación de matrices biocompatibles, capas continuas con interfaces entre capas distintas para la ingeniería de tejidos. Tal andamio podría proporcionar un entorno adaptable ideal para modular el comportamiento celular por varias señales biológico, químico o mecánico

Gradiente de densidad multicapa polimerización (DGMP): una técnica novedosa para la creación de multi-compartimiento, Andamios personalizables para Ingeniería de Tejidos

Complex tissue culture matrices, in which types and concentrations of biological stimuli (e.g. growth factors, inhibitors, or small molecules) or matrix ...

El objetivo general de este procedimiento es crear un andamio de cultivo celular de múltiples capas. Este video demostrará cómo producir una matriz de cultivo celular en 2D, incorporando el péptido de adhesión RGDS en capas alternas para separar regiones de C dos células C 12. Esto se logra atando primero el péptido RGDS a un macro acrobático leal.A continuación, la combinación de macropéptidos se etiqueta con el colorante LOR para permitir la visualización del péptido que contiene capas de los geles multicapa. El segundo paso es formar los moldes cortándolos de una lámina de silicona y colocándolos entre dos portaobjetos de vidrio a continuación, mezclando los componentes individuales de cada capa. Las soluciones de peg di acrl y peg di acrl con PEG RGDS Alexa three 50 se colocan alternativamente en capas dentro de los moldes.Los geles se polimerizan mediante irradiación UV. El paso final es sembrar C dos células C 12 en geles multicapa 2D para examinar cómo la composición de la matriz afecta el crecimiento y la unión de las células. En última instancia, la microscopía de campo claro y de fluorescencia se utiliza para visualizar el crecimiento selectivo de dos células C 12 en los andamios.La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que es un método simple y rentable para crear matrices de cultivo celular 2D y 3D de múltiples capas. No depende de la necesidad de instrumentación costosa. Mientras que las interfaces entre capas son contiguas y estructuralmente integrales.No hay mezcla entre los componentes de las capas individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave, como cómo las células migran y se polarizan en respuesta a señales biológicas, químicas y mecánicas modeladas. Este método puede proporcionar una visión suave de la migración y diferenciación celular y se puede aplicar a otros sistemas, como la dirección de nuevos crecimientos y sinaptogénesis de células madre neuronales.Para comenzar este procedimiento, combine el péptido RGDS y el éster metílico de succinil carbo de peg de aceite acrobático en una proporción molar de uno a dos a uno en DMSO seco bajo Argonne. Luego agregue NN diop, propilmetilamina o D-I-P-E-A en una proporción de dos a un molar en relación con el aquilo PEG SCM para ayudar a facilitar la reacción, confirme la conjugación de la molécula del aquilo PEG RGDS utilizando espectrometría de masas TOF mohosa. Para esto por separado, agregue un microlitro de la solución de reacción AQUILO PEG RGDS y un microlitro de SCM aquilo PEG no reactivo a diferentes puntos del objetivo mohoso.Deja que ambos se sequen. A continuación, prepare una solución saturada de matriz mohosa universal en vórtice THF durante un minuto y añada un microlitro en los mismos dos puntos. Deja que ambos se sequen.A continuación, cargue las muestras. Realice análisis de resistencia y moho con un láser de 60 hercios a aproximadamente el 19 % de potencia utilizando los algoritmos de suavizado de sombrero de copa SAVIS gole, corte de cabeza, sustracción y detección de picos OID. El peso molecular de acro PEG RGDS debe desplazarse hacia la derecha, lo que corresponde al cambio de masa debido al péptido unido covalentemente.El siguiente paso es conjugar el flúor mediante la adición de una cantidad equimolar de LOR, tres 50 de ácido carboxílico aspira un éster medio en relación con el aquilo, PEG, SCM, disuelto en un volumen mínimo de DMSO, al aquilo, PEG RGDS, solución de reacción bajo argón, incubar durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, purifique la clavija de aceite acrobático RGD S3 50 diálisis contra el agua de tinte a cuatro grados centígrados utilizando un casete de diálisis de corte de 3.500 DAU. Continúe dilalizando durante 48 horas utilizando una proporción volumétrica de 1001, intercambiando dializado frío al menos dos veces al día.El producto se purifica aún más mediante la esterilización por filtro a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras. Por último, en un entorno estéril, alícuota el aceite acrobático purificado estéril clava RGD S3 50 en tubos de microcentrífuga preponderados estériles. Selle los tubos de microcentrífuga abiertos dentro de un tubo de ventilación estéril.Liofilizar las muestras y almacenar cada una sellada con película de parafina a menos 20 grados centígrados. El prelavado se desliza en metanol 100% y se seca en un horno a 80 grados centígrados hasta que el líquido se evapore. A continuación, coloque un plato que contenga los portaobjetos de vidrio en una campana extractora y añada 250 microlitros de capa sigma a cada portaobjetos.Mece suavemente los portaobjetos durante 30 segundos para cubrir toda la superficie. A continuación, enjuague a fondo los portaobjetos recubiertos con metanol al 100%, seguido de lavado y agua destilada, remojándolos dos veces durante cinco minutos en al menos 10 mililitros de agua. Una vez enjuagados, deje que los portaobjetos se sequen al aire.Prepare espacios de silicona de 0,8 milímetros de grosor recortando una lámina de silicona de las mismas dimensiones que los portaobjetos de vidrio. Luego, con punzones de biopsia, haga agujeros de 10 u ocho milímetros en la silicona para sujetar los andamios con una cuchilla de afeitar. Haga canales de alrededor de dos milímetros en la parte superior del molde para permitir la adición del material del andamio.A continuación, autoclave los espacios de silicona y recubre los portaobjetos de vidrio tratados con sigma para esterilizarlos. También esterilice materiales adicionales para fundir los geles, como tubos de einor y pinzas. En un filtro de campana de cultivo de tejidos, esterilice una solución madre de Peg di aquil utilizando una jeringa estéril de un mililitro y un filtro de 0,2 micras.Comience formulando soluciones de prepolímero PEG en una relación peso-volumen del 15% para cada capa respectiva en tubos de microrresiduos ámbar individuales combinando el 50% de PEG D acrl con diferentes cantidades de solución madre estéril de 60%IO DAL, PBS y fotoiniciador para producir concentraciones finales variables de 10%, 20%, 30% y 40%; mezcle bien las soluciones para preparar la solución de prepolímero al 15%PEG marcada con fluorescencia, combine 50%PEG di aquil y aquilo PEG RGD S3 50 a una concentración final de ocho milimolares con IO Dal, solución madre PBS y fotoiniciador en tubos Microview de color ámbar para producir concentraciones de 15%25% y 35%IO IAL, mezcle completamente las soluciones. A continuación, ensamble la configuración del molde colocando un espaciador precortado entre dos portaobjetos de vidrio tratado con sigma co y asegúrelo con abrazaderas. Una vez ensamblado el molde, mezcle un gel en capas agregando primero 10 microlitros de la solución al 40%, seguidos de 10 microlitros de la solución al 35% marcada con fluorescencia.Repita la capa alternativa para lograr varias capas. A continuación, irradie el molde con luz de 365 nanómetros durante tres minutos. Con una lámpara portátil UVR 9, 000, deje que los hidrogeles polimerizados se curen durante cinco minutos.A continuación, retire las abrazaderas y levante suavemente la corredera de cristal superior y el molde. El gradiente de densidad estratificado. La polimerización multicapa o los geles DG MP permanecerán en los portaobjetos.Con una espátula estéril, retire con cuidado los geles del molde y colóquelos en un tubo de 50 mililitros que contenga DMEM estéril. Lave los geles polimerizados utilizando una proporción volumétrica de 1000 a uno de DMEM durante 48 horas con dos intercambios de tampón por día. Esto eliminará cualquier densidad, modificador, fotoiniciador y prepolímero de reacción.A continuación, almacene los geles de DGMP en DMEM suplementado con estreptomicina al 1%. Para visualizar capas alternas, coloque el gel DGMP a lo largo de una regla en la bandeja de muestras de una unidad de documentación de gel. A continuación, exponga y obtenga imágenes de los geles con Alexa, tres 50 bandas oscuras y azules alternas en el hidrogel DGMP que demuestran la formación de capas discretas de composición química distinta.Para preparar los geles DGMP para el cultivo celular, insértelos suavemente en los pocillos de una placa de cultivo celular de 48 pocillos. Usando un raspador de células estéril y enjuáguelas tres veces en medio de cultivo celular. A continuación, extraiga dos mioblastos C 12 de una placa de cultivo celular de 100 milímetros cuando estén confluentes en un 60%.Para hacer esto, enjuague la placa tres veces con PBS precalentado. A continuación, añadir un mililitro de 0,25%trips en EDTA e incubar la placa a 37 grados centígrados durante dos minutos. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue un mililitro de medio de cultivo precalentado y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros para la centrifugación.Después de que las células hayan sido peletizadas, escríbalas en un medio de crecimiento y cuente las células vivas agregando azul triam y usando un contador de células TC 10. A continuación, siembre el andamio DG MP con C, dos mioblastos C 12 e incube durante 24 horas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Confirmar la unión de dos mioblastos C 12 C en el RGDS que contiene capas de geles DGMP mediante epifluorescencia y microscopía de contraste de fase.Las capas alternas de los geles DGMP pueden contener varios péptidos, como el RGDS que se muestra a la derecha, que favorece la unión y el crecimiento celular. La capa de la izquierda, sin embargo, no contenía ningún péptido de unión celular y las células no sobrevivieron en esa región. El IO diol puede afectar la rigidez del gel.Aquí, el módulo elástico se midió utilizando microscopía de fuerza atómica. Se observó un aumento del 60% en la rigidez cuando se usó 30%IAL en esta formulación de gel, el efecto IAL en la rigidez del gel puede variar según los materiales que se utilicen. Al intentar este procedimiento, es importante recordar la secuencia de las capas. La capa que contenga la mayor cantidad de IEX null estará en la parte inferior, mientras que la capa con la menor cantidad de IEX null estará en la parte superior.Recuerde siempre agregar el fotoiniciador al final para evitar la polimerización de la luz ambiental. Con nuestros colaboradores, estamos adaptando esta técnica para organizar el crecimiento de las neuritas en 3D. Esto permitirá comparar las células neuroprogenitoras derivadas de individuos sanos y las de pacientes con trastornos del neurodesarrollo.No olvide que trabajar con luz ultravioleta puede ser peligroso. Use gafas con protección UV mientras realiza el paso de reticulación.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Técnicas sencillas se describen para la producción rápida de microfabricated sistemas de cultivo neuronal mediante un dispositivo digital de microespejos para la litografía de proyección dinámica máscara regular de los sustratos de cultivo celular. Estos sistemas de cultivo pueden ser más representativos de la arquitectura biológica natural, y las técnicas descritas podrían ser adaptados para numerosas aplicaciones.

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Este protocolo se centra en la utilización de la capacidad inherente de las células madre para tomar el ejemplo de su matriz extracelular circundante y ser inducidas a diferenciarse en múltiples fenotipos. Este manuscrito métodos extiende nuestra descripción y caracterización de un modelo utilizando un hidrogel bicapa, compuesto de PEG-fibrina y colágeno, a la vez co-diferenciar derivadas de tejido adiposo células...

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Andamios electrospun puede ser procesado post-producción para aplicaciones de ingeniería de tejidos. Aquí se describen los métodos para hacer girar los andamios complejos (por hilado consecutivos), para la fabricación de andamios más gruesas (por el multi-capas usando calor o recocido de vapor), para lograr la esterilidad (la producción aséptica o esterilización de la post-producción) y para la consecución de adecuadas propiedades biomecánicas.

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Los andamios para la ingeniería de tejidos necesitan recapitular el complejo microambiente bioquímico y biofísico del nicho celular. Aquí, mostramos el uso de fibras de complejación de polielectrolitos interfaciales como plataforma para crear andamios poliméricos compuestos de múltiples componentes con liberación bioquímica sostenida.

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Un Facile y respetuoso del medio ambiente de ruta para la fabricación de poli (ácido láctico) Los andamios con graduado Tamaño de poro

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Un método versátil de Patterning proteínas y células

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Hidrogeles ultrafino Porated elástico como una membrana del sótano biomiméticos para doble cultura de la célula

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Aprende a crear andamios multicapa para ingeniería de tejidos mediante polimerización UV con gradiente de densidad. Este método económico permite estudiar el comportamiento celular sin equipamiento costoso.

Gradiente de densidad multicapa polimerización (DGMP): una técnica novedosa para la creación de multi-compartimiento, Andamios personalizables para Ingeniería de Tejidos (Video) | JoVE Journal

Gradiente de densidad multicapa polimerización (DGMP): una técnica novedosa para la creación de multi-compartimiento, Andamios personalizables para Ingeniería de Tejidos

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