Gradiente de densidad multicapa polimerización (DGMP): una técnica novedosa para la creación de multi-compartimiento, Andamios personalizables para Ingeniería de Tejidos

El objetivo general de este procedimiento es crear un andamio de cultivo celular de múltiples capas. Este video demostrará cómo producir una matriz de cultivo celular en 2D, incorporando el péptido de adhesión RGDS en capas alternas para separar regiones de C dos células C 12. Esto se logra atando primero el péptido RGDS a un macro acrobático leal.

A continuación, la combinación de macropéptidos se etiqueta con el colorante LOR para permitir la visualización del péptido que contiene capas de los geles multicapa. El segundo paso es formar los moldes cortándolos de una lámina de silicona y colocándolos entre dos portaobjetos de vidrio a continuación, mezclando los componentes individuales de cada capa. Las soluciones de peg di acrl y peg di acrl con PEG RGDS Alexa three 50 se colocan alternativamente en capas dentro de los moldes.

Los geles se polimerizan mediante irradiación UV. El paso final es sembrar C dos células C 12 en geles multicapa 2D para examinar cómo la composición de la matriz afecta el crecimiento y la unión de las células. En última instancia, la microscopía de campo claro y de fluorescencia se utiliza para visualizar el crecimiento selectivo de dos células C 12 en los andamios.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que es un método simple y rentable para crear matrices de cultivo celular 2D y 3D de múltiples capas. No depende de la necesidad de instrumentación costosa. Mientras que las interfaces entre capas son contiguas y estructuralmente integrales.

No hay mezcla entre los componentes de las capas individuales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave, como cómo las células migran y se polarizan en respuesta a señales biológicas, químicas y mecánicas modeladas. Este método puede proporcionar una visión suave de la migración y diferenciación celular y se puede aplicar a otros sistemas, como la dirección de nuevos crecimientos y sinaptogénesis de células madre neuronales.

Para comenzar este procedimiento, combine el péptido RGDS y el éster metílico de succinil carbo de peg de aceite acrobático en una proporción molar de uno a dos a uno en DMSO seco bajo Argonne. Luego agregue NN diop, propilmetilamina o D-I-P-E-A en una proporción de dos a un molar en relación con el aquilo PEG SCM para ayudar a facilitar la reacción, confirme la conjugación de la molécula del aquilo PEG RGDS utilizando espectrometría de masas TOF mohosa. Para esto por separado, agregue un microlitro de la solución de reacción AQUILO PEG RGDS y un microlitro de SCM aquilo PEG no reactivo a diferentes puntos del objetivo mohoso.

Deja que ambos se sequen. A continuación, prepare una solución saturada de matriz mohosa universal en vórtice THF durante un minuto y añada un microlitro en los mismos dos puntos. Deja que ambos se sequen.

A continuación, cargue las muestras. Realice análisis de resistencia y moho con un láser de 60 hercios a aproximadamente el 19 % de potencia utilizando los algoritmos de suavizado de sombrero de copa SAVIS gole, corte de cabeza, sustracción y detección de picos OID. El peso molecular de acro PEG RGDS debe desplazarse hacia la derecha, lo que corresponde al cambio de masa debido al péptido unido covalentemente.

El siguiente paso es conjugar el flúor mediante la adición de una cantidad equimolar de LOR, tres 50 de ácido carboxílico aspira un éster medio en relación con el aquilo, PEG, SCM, disuelto en un volumen mínimo de DMSO, al aquilo, PEG RGDS, solución de reacción bajo argón, incubar durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, purifique la clavija de aceite acrobático RGD S3 50 diálisis contra el agua de tinte a cuatro grados centígrados utilizando un casete de diálisis de corte de 3.500 DAU. Continúe dilalizando durante 48 horas utilizando una proporción volumétrica de 1001, intercambiando dializado frío al menos dos veces al día.

El producto se purifica aún más mediante la esterilización por filtro a través de un filtro de jeringa de 0,22 micras. Por último, en un entorno estéril, alícuota el aceite acrobático purificado estéril clava RGD S3 50 en tubos de microcentrífuga preponderados estériles. Selle los tubos de microcentrífuga abiertos dentro de un tubo de ventilación estéril.

Liofilizar las muestras y almacenar cada una sellada con película de parafina a menos 20 grados centígrados. El prelavado se desliza en metanol 100% y se seca en un horno a 80 grados centígrados hasta que el líquido se evapore. A continuación, coloque un plato que contenga los portaobjetos de vidrio en una campana extractora y añada 250 microlitros de capa sigma a cada portaobjetos.

Mece suavemente los portaobjetos durante 30 segundos para cubrir toda la superficie. A continuación, enjuague a fondo los portaobjetos recubiertos con metanol al 100%, seguido de lavado y agua destilada, remojándolos dos veces durante cinco minutos en al menos 10 mililitros de agua. Una vez enjuagados, deje que los portaobjetos se sequen al aire.

Prepare espacios de silicona de 0,8 milímetros de grosor recortando una lámina de silicona de las mismas dimensiones que los portaobjetos de vidrio. Luego, con punzones de biopsia, haga agujeros de 10 u ocho milímetros en la silicona para sujetar los andamios con una cuchilla de afeitar. Haga canales de alrededor de dos milímetros en la parte superior del molde para permitir la adición del material del andamio.

A continuación, autoclave los espacios de silicona y recubre los portaobjetos de vidrio tratados con sigma para esterilizarlos. También esterilice materiales adicionales para fundir los geles, como tubos de einor y pinzas. En un filtro de campana de cultivo de tejidos, esterilice una solución madre de Peg di aquil utilizando una jeringa estéril de un mililitro y un filtro de 0,2 micras.

Comience formulando soluciones de prepolímero PEG en una relación peso-volumen del 15% para cada capa respectiva en tubos de microrresiduos ámbar individuales combinando el 50% de PEG D acrl con diferentes cantidades de solución madre estéril de 60%IO DAL, PBS y fotoiniciador para producir concentraciones finales variables de 10%, 20%, 30% y 40%; mezcle bien las soluciones para preparar la solución de prepolímero al 15%PEG marcada con fluorescencia, combine 50%PEG di aquil y aquilo PEG RGD S3 50 a una concentración final de ocho milimolares con IO Dal, solución madre PBS y fotoiniciador en tubos Microview de color ámbar para producir concentraciones de 15%25% y 35%IO IAL, mezcle completamente las soluciones. A continuación, ensamble la configuración del molde colocando un espaciador precortado entre dos portaobjetos de vidrio tratado con sigma co y asegúrelo con abrazaderas. Una vez ensamblado el molde, mezcle un gel en capas agregando primero 10 microlitros de la solución al 40%, seguidos de 10 microlitros de la solución al 35% marcada con fluorescencia.

Repita la capa alternativa para lograr varias capas. A continuación, irradie el molde con luz de 365 nanómetros durante tres minutos. Con una lámpara portátil UVR 9, 000, deje que los hidrogeles polimerizados se curen durante cinco minutos.

A continuación, retire las abrazaderas y levante suavemente la corredera de cristal superior y el molde. El gradiente de densidad estratificado. La polimerización multicapa o los geles DG MP permanecerán en los portaobjetos.

Con una espátula estéril, retire con cuidado los geles del molde y colóquelos en un tubo de 50 mililitros que contenga DMEM estéril. Lave los geles polimerizados utilizando una proporción volumétrica de 1000 a uno de DMEM durante 48 horas con dos intercambios de tampón por día. Esto eliminará cualquier densidad, modificador, fotoiniciador y prepolímero de reacción.

A continuación, almacene los geles de DGMP en DMEM suplementado con estreptomicina al 1%. Para visualizar capas alternas, coloque el gel DGMP a lo largo de una regla en la bandeja de muestras de una unidad de documentación de gel. A continuación, exponga y obtenga imágenes de los geles con Alexa, tres 50 bandas oscuras y azules alternas en el hidrogel DGMP que demuestran la formación de capas discretas de composición química distinta.

Para preparar los geles DGMP para el cultivo celular, insértelos suavemente en los pocillos de una placa de cultivo celular de 48 pocillos. Usando un raspador de células estéril y enjuáguelas tres veces en medio de cultivo celular. A continuación, extraiga dos mioblastos C 12 de una placa de cultivo celular de 100 milímetros cuando estén confluentes en un 60%.

Para hacer esto, enjuague la placa tres veces con PBS precalentado. A continuación, añadir un mililitro de 0,25%trips en EDTA e incubar la placa a 37 grados centígrados durante dos minutos. Una vez que las células se hayan desprendido, agregue un mililitro de medio de cultivo precalentado y transfiera las células a un tubo cónico de 50 mililitros para la centrifugación.

Después de que las células hayan sido peletizadas, escríbalas en un medio de crecimiento y cuente las células vivas agregando azul triam y usando un contador de células TC 10. A continuación, siembre el andamio DG MP con C, dos mioblastos C 12 e incube durante 24 horas a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Confirmar la unión de dos mioblastos C 12 C en el RGDS que contiene capas de geles DGMP mediante epifluorescencia y microscopía de contraste de fase.

Las capas alternas de los geles DGMP pueden contener varios péptidos, como el RGDS que se muestra a la derecha, que favorece la unión y el crecimiento celular. La capa de la izquierda, sin embargo, no contenía ningún péptido de unión celular y las células no sobrevivieron en esa región. El IO diol puede afectar la rigidez del gel.

Aquí, el módulo elástico se midió utilizando microscopía de fuerza atómica. Se observó un aumento del 60% en la rigidez cuando se usó 30%IAL en esta formulación de gel, el efecto IAL en la rigidez del gel puede variar según los materiales que se utilicen. Al intentar este procedimiento, es importante recordar la secuencia de las capas. La capa que contenga la mayor cantidad de IEX null estará en la parte inferior, mientras que la capa con la menor cantidad de IEX null estará en la parte superior.

Recuerde siempre agregar el fotoiniciador al final para evitar la polimerización de la luz ambiental. Con nuestros colaboradores, estamos adaptando esta técnica para organizar el crecimiento de las neuritas en 3D. Esto permitirá comparar las células neuroprogenitoras derivadas de individuos sanos y las de pacientes con trastornos del neurodesarrollo.

No olvide que trabajar con luz ultravioleta puede ser peligroso. Use gafas con protección UV mientras realiza el paso de reticulación.