La evaluación de la replicación y la función celular beta en Adenovirally transducidas aislados islotes de roedores

El objetivo general de este procedimiento es identificar las vías de señalización que regulan los cambios en la masa funcional de las células beta. Esto se logra en ojales de rata aislados mediante la sobreexpresión o supresión de la expresión de un gen utilizando vectores adenovirales. Después de esta manipulación, la función de las células beta se evalúa mediante la secreción de insulina y la replicación de los ojales medida por la incorporación de timidina tritiada.

En última instancia, estos ensayos pueden mostrar si un gen de interés regula la proliferación de las células beta o funciona in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de los párpados, como ¿un componente particular de una vía de señalización influye en el crecimiento y la función de las células beta? Prepare una placa recubierta de seis pocillos sin cultivo de tejidos agregando dos mililitros de medio modificado al número requerido de pocillos.

Por ejemplo, un experimento típico puede requerir tres pocillos, uno para un control sin virus, otro para un control de virus, y el grupo experimental calienta la placa a 37 grados centígrados en una incubadora de cultivo de tejidos durante al menos 30 minutos. Inmediatamente después del aislamiento de los ojales para ratas, coloque de uno a 200 ojales en cada pocillo del plato preparado. 60 ojales se utilizarán para ensayos bioquímicos y los ojales restantes se pueden utilizar para estudios de expresión génica o inmunotransferencia, hinchar suavemente la placa para llevar los ojales al centro de cada uno.

Pues bien, pipetee inmediatamente el adenovirus directamente sobre los ojales. En el centro del plato. Utilice de una a 500 multiplicidades de infección dependiendo de la eficacia del adenovirus para sobreexpresar o eliminar la proteína de interés.

La penetración eficiente de los adenovirus en el centro del párpado aumenta la consistencia de los resultados. Transducción de los párpados inmediatamente después del párpado. El aislamiento es esencial.

No moleste la placa durante cinco minutos, luego muévala a la incubadora durante 24 horas. Al día siguiente, retire la placa de la incubadora e hinche suavemente los ojales hasta el centro de los pocillos. Transfiera los ojales a un nuevo pocillo que contenga medios frescos con una micropipeta de 200 microlitros.

Si los ojales se adhieren a la placa, se pueden desplazar suavemente con la punta de la pipeta. Es útil utilizar un virus de control que exprese GFP para verificar la eficiencia adecuada de la transducción mediante el uso de microscopía confocal para visualizar la penetración del adenovirus en el cultivo del núcleo de los islotes. Los islotes de uno a tres días más, cambiando los medios de comunicación a diario.

El tiempo de cultivo debe ser optimizado por estudios piloto y varía en función de los objetivos experimentales. Durante las últimas 24 horas, incorpore timidina tritiada en el medio a una concentración de un micro curie por milímetro de medio. Primero prepare 50 mililitros de SAB de trabajo en un tubo cónico de 50 mililitros y caliéntelo en un baño de agua a 37 grados centígrados.

Pipetear 10 mililitros de SAB de trabajo en un tubo cónico de 15 mililitros y añadir 66,8 microlitros de glucosa D 2,5 molar. Para preparar el SAB alto en glucosa, agregue 44,8 microlitros de glucosa 2,5 monolo D a los 40 mililitros restantes del SAB de trabajo. Para preparar el SAB bajo en glucosa, etiquete a continuación tres tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitros.

Para cada pocillo de la placa de seis pocillos y agregue un mililitro de PBS a cada tubo. No olvide seguir los protocolos institucionales para el manejo y disposición de los ojales radiactivos. Usando un estereoscopio o un microscopio estándar, seleccione y transfiera 20 ojales de tamaño comparable a cada tubo de microcentrífuga.

Por ejemplo, cada tubo puede contener cinco ojales pequeños, 10 medianos y cinco grandes. Aunque los resultados se normalizan al contenido total de proteínas al final del experimento, es fundamental que el tamaño coincida con los ojales entre los grupos. Después de permitir que los ojales se depositen en el fondo del tubo por gravedad o por centrifugación, aspire, pese el PBS con una micropipeta y luego proceda a preparar los ojales para los ensayos bioquímicos.

Para preparar los ojales para el ensayo de secreción de insulina, primero deben ser preincubados con SAB de baja glucosa. Para hacer esto, agregue 400 microlitros de SAB bajo en glucosa a los tubos y colóquelos con tapas en la incubadora de cultivo de tejidos Durante 60 minutos después de una hora, aspire el SAB bajo en glucosa preincubado para medir la secreción basal de insulina. Repita el procedimiento de preincubación.

Sin embargo, para medir la secreción estimulada de insulina, use 400 microlitros de SAB de alta glucosa en lugar de SAB de baja glucosa y, como antes, incube los ojales durante 60 minutos después de la incubación en aspirado de SAB de alta o baja glucosa y el SAB para el radioinmunoensayo de insulina, que se ejecutará de acuerdo con el protocolo del fabricante. A continuación, proceda con el ensayo de incorporación de timidina utilizando la misma colección de ojales. Comience con los ojales que se acaban de usar para el ensayo de secreción de insulina.

Agregue un mililitro de PBS y deje que los ojales se asienten por gravedad. A continuación, aspire el PBS con una micropipeta. Deseche y repita este paso una vez más.

A continuación, añade 500 microlitros de ácido tricloroacético helado a los ojales e incuba en hielo durante 30 minutos. Centrifugar los tubos a cuatro grados centígrados. Luego, aspiración, descartar el TCA.

A continuación, añade 80 microlitros de hidróxido de sodio normal al 0,3 e incuba los ojales durante 30 minutos a temperatura ambiente. Durante esta incubación, vórtice vigorosamente las muestras durante cinco a 10 segundos cada 10 minutos. Paralelamente, agregue cuatro mililitros de un cóctel de conteo seguro Conno a tubos de conteo de centelleo líquido de siete mililitros.

Cuando termine la incubación de los ojales, agregue 50 microlitros de los ojales a un tubo de centelleo. Agite brevemente el tubo tapado y mida la radiactividad de las muestras en un contador de centelleo líquido. Además, para medir la concentración de proteínas, transfiera 10 microlitros de vilas a un ensayo comercial de ácido biónico y siga el protocolo del fabricante.

Posteriormente, durante el análisis de datos, normalice los resultados a la concentración de proteínas utilizando los protocolos descritos. Replicación de ojales y función de las células beta. En los ojales de rata se evaluó una sobreexpresión adenoviral del gen hipotético seis que estimuló de forma robusta la replicación de los ojales sin alterar la función de las células beta.

Aumento de la expresión del gen seis, aumento de la síntesis de ADN medido por la incorporación de timidina porque la mayoría de las células en el ojal de la rata son células beta. Experimentos posteriores podrían mostrar que este aumento en la incorporación de timidina se debe a un aumento en la replicación de las células beta. El ensayo de secreción de insulina demostró que la sobreexpresión del gen seis no alteró una de las funciones primarias de las células beta: la secreción de insulina a niveles bajos y altos de glucosa.

El aumento de la secreción de insulina a concentraciones bajas y altas de glucosa refleja la salud de los ojales después del tratamiento con adenovirus. Si el aumento de la expresión del gen seis deteriora la función de las células beta, esto probablemente se reflejaría como una disminución de la insulina secretada a altas concentraciones de glucosa. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo medir la replicación de las células beta y la secreción de insulina para determinar si un gen en particular influye en el crecimiento o la función de las células beta.