Síntesis en fase sólida de un péptido funcionalizado Bis-El uso de "Cierre de seguridad" Metodología

El objetivo general del siguiente experimento es sintetizar un péptido BSP funcionalizado utilizando técnicas de fase sólida. Esto se logra cargando un aminoácido BIS protegido en la resina de ácido hidroxietilbenzoico. A continuación, se repiten los ciclos de acoplamiento de protección profunda para unir los aminoácidos bis funcionalizados, un proceso que alarga el péptido BIS y muestra la funcionalidad deseada.

Finalmente, el primer aminoácido bis se modifica con un aminoácido alfa para escindir el péptido BIS de la resina mediante la formación de pirazina DI Keto. Se obtienen resultados que muestran la síntesis exitosa de un péptido BSP funcionalizado con buena pureza bruta y rendimientos aislados consistentes de aproximadamente el 10% basados en el análisis de espectrometría de masas por cromatografía líquida. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la síntesis paralela y en biblioteca de péptidos bis, ya que los péptidos BIS se ensamblan en una resina sólida, que es más fácilmente manipulable que las reacciones en solución, y los subproductos se eliminan fácilmente por filtración.

La demostración visual de este método es crítica, ya que muchos de los pasos son difíciles de aprender porque hay muchos detalles importantes necesarios para garantizar que todas las reacciones se acerquen lo más posible a su finalización. Con la síntesis en fase sólida, no hay forma de purificar los intermedios. Por lo tanto, para obtener un producto final limpio, cada reacción debe llevarse lo más lejos posible.

Recomendamos crear una lista de verificación de procedimientos experimentales para evitar confusiones, ya que los pasos son de naturaleza repetitiva. Este protocolo comienza con la carga del primer péptido BSP, la protección del primer péptido BSP y el taponado simultáneo de la resina. Para comenzar, cargue el primer péptido BSP pesando 114 miligramos de resina H-M-B-A-A en un recipiente de reacción de ocho mililitros y agregue una barra de agitación magnética.

Tape la parte superior del recipiente con el tabique de goma y purgue el tubo con Argonne durante al menos cinco minutos. Mientras tanto, prepare la solución de aminoácidos BIS activados como se describe en el protocolo escrito. Acompañando este video, transfiera la solución al recipiente de reacción a través de una jeringa y revuelva bajo Argonne durante la noche del día siguiente, retire el tabique y drene la mezcla de reacción.

Lava la resina añadiendo aproximadamente dos mililitros de clorometano a la resina. Revuelva durante 30 segundos a un minuto y luego escurra. Repita este proceso cuatro veces con DCM y luego lave la resina cinco veces con dimetilformamida.

Para realizar una protección profunda del primer aminoácido bis y un taponado simultáneo de resina, agregue lentamente dos mililitros de una solución de bromuro de hidrógeno al 33% en ácido acético y DCM al recipiente de reacción. Deje remover durante 15 minutos después de escurrir y lavar la resina cinco veces en DCM. Repita la secuencia de protección D una vez más.

A continuación, lave la resina cinco veces en DCM seguido de cinco veces en DMF, neutralice la resina lavando dos veces con la solución de volumen al 5% de D-I-P-E-A en DMF. A continuación, lavar cinco veces con DCM y cinco veces con DMF una vez más. Ahora se puede realizar el acoplamiento del aminoácido bis funcionalizado protegido.

Primero, vuelva a introducir una atmósfera inerte en el recipiente de reacción que contiene resina lavando tres veces con DCM anhidro. A continuación, coloque un tabique y una purga de la línea de argonne y lave el recipiente añadiendo uno o dos mililitros de DCM anhidro y agitando durante 30 segundos. Luego drene el recipiente hasta que el burbujeador de línea de argonne comience a subir.

Repite este proceso al menos una vez más. A continuación, prepare una solución de aminoácido bis funcionalizado en un tubo de ensayo secado al llama bajo atmósfera de Argonne. Agregue 47 microlitros de DIC y revuelva durante 90 minutos.

A continuación, añade 35 microlitros de D-I-P-E-A en 666 microlitros e hidrus DMF a la resina y remueve durante cinco minutos más. Transfiera la solución de aminoácidos BIS preactivados al recipiente a través de una jeringa y revuelva durante la noche del día siguiente. Drene la mezcla de reacción y lave dos veces con DCM anhidro mientras está bajo argón.

Un paso crítico en este procedimiento son los acoplamientos de aminoácidos biz. Para garantizar los cierres de los anillos de las piperazinas cetogénicas, empleamos tiempos de reacción más largos con agentes activadores adicionales. Para promover el cierre de la pirazina di keto, agregue una solución de HOAT y DIC y revuelva bajo argón durante una hora.

A continuación, retire el tabique y escurra la mezcla de reacción. Lava la resina cinco veces con DCM y cinco veces con DMF. Esta sección cubre la protección profunda del aminoácido BIS funcionalizado, la protección profunda del F moc y la acilación del primer aminoácido BIS.

Para realizar una protección profunda del aminoácido bis funcionalizado protegido, agregue lentamente dos mililitros de una solución de TFA y TIPS al recipiente de reacción y revuelva durante una hora después del drenaje, lave la resina con DCM durante unos 30 segundos y luego drene repita el lavado de DCM cinco veces. A continuación, repita toda la secuencia de lavado de la resina de protección profunda después del lavado A-D-C-M-D-M-F. Neutralizar la resina lavándola dos veces con una solución de volumen al 5% de D-I-P-E-A en DMF.

A continuación, realice otro lavado D-C-M-D-M-F. A partir de aquí, el péptido BIS puede alargarse con otros aminoácidos bis funcionalizados o funcionalizarse en el ácido carboxílico nitrógeno principal o ambos. Para desproteger el grupo FM, añadir una solución de dos mililitros de paridina al 20% en DMF y mezclar la reacción durante 20 minutos.

Escurrir y lavar la resina cinco veces en DMF. Repita este proceso una vez más después de un lavado adicional de la resina. A Aísle el primer aminoácido bis añadiendo la solución de aminoácidos preparada al recipiente de reacción y remueva durante seis horas como paso final.

Lava la resina cinco veces con DCM y cinco veces con DMF. La parte final de este protocolo incluye la eliminación del grupo de Bach del aminoácido unido a la resina y la escisión de la resina. Primero, agregue dos mililitros de una solución T-F-A-D-C-M uno a uno al recipiente de reacción y revuelva durante 30 minutos.

Escurrir y lavar la resina cinco veces en DCM. A continuación, repita este proceso una vez más. Lava y escurre la resina durante 30 segundos, cinco veces con DCM y cinco veces con DMF.

A continuación, agregue dos mililitros de una solución de 10%D-I-P-E-A en DMF anhidro y revuelva durante 24 a 48 horas. Finalmente, recoja la mezcla de reacción en un matraz de fondo redondo previamente pesado. Transfiera 30 microlitros de esta solución a 450 microlitros de Tetra Hydro FU en un archivo lc MS y envíelo para su análisis.

Lave la resina con alícuotas adicionales de DMF y recolóquela en el matraz de fondo redondo. Los siguientes métodos se pueden utilizar para monitorear las transformaciones químicas de la resina a lo largo de la síntesis. Para detectar los grupos hidroxilo libres, realice la prueba del rojo de metilo extrayendo primero aproximadamente un miligramo de resina seca con una pipeta desechable.

Enjuague en un recipiente de reacción de cuatro mililitros. Agregue una solución de rojo de metilo preparada como se describe en el texto y revuelva durante cinco a 10 minutos. Escurrir y lavar la resina cinco veces con DCM, las perlas de resina naranja o roja indican la presencia de grupos hidroxilo libres.

Esta prueba se puede utilizar para evaluar la carga de los primeros pasos de taponado de aminoácidos y resina. Para detectar medios secundarios, realice la prueba de cloral transfiriendo aproximadamente un miligramo de resina seca a un pequeño vial a través de una pipeta desechable. Agregue tres gotas de cloral 0.8 milimolar en solución de DMF y aldehído ácido al 2% en solución de DMF.

Y sentémonos a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos. En este caso, las perlas de resina azules o moradas son una indicación de que hay medios secundarios libres en el compuesto unido a la resina. Para confirmar la eficiencia de la activación, realizar la prueba de trampa de activación, el compuesto activado durante la síntesis se puede evaluar transfiriendo de cinco a 10 microlitros de la solución activada a un vial de espectrometría de masas de cromatografía líquida que contiene 50 microlitros de olaína mezclada a mano.

Durante unos segundos, la solución debe volverse amarilla, luego diluirse con 450 microlitros de tetra hidrouran y someterse a un análisis de MS de LC. El producto final y los intermedios activados pueden evaluarse utilizando un sistema LCM S equipado con una columna de fase inversa C 18 y un sistema de disolventes de nitrilo acetil en agua con ácido fórmico al 0,1%. Esta traza L-C-M-S-U-V es un ejemplo de la buena pureza del producto bruto.

El pico principal en el espectro encontrado a los 21,3 minutos se encuentra con una máscara consistente con la masa esperada del producto. Esto se puede visualizar en el espectro de masas del producto crudo, el pico revela los picos principales correspondientes a la masa, más la masa del ion sodio, así como la masa menos la masa del grupo protector IV DDE. Aquí se muestra la traza LCMS UV de los espectros purificados, revelando un producto muy puro a los 21,3 minutos, y el espectro de masas, confirmando la identidad de este pico de Tréveris purificado.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar técnicas de cara sólida para sintetizar péptidos bis funcionalizados después de su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los péptidos biz exploraran aplicaciones en las interacciones proteína-proteína y la catálisis una vez dominadas. Esta técnica puede conducir a la síntesis de un trímero de péptido biz funcionalizado en cuatro o cinco días si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las perlas sumergidas en las soluciones de reacción y lavado después de este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la síntesis en paralelo o en bibliotecas, para responder a preguntas adicionales como el efecto de la estereoquímica o las funcionalidades alternativas en la unión a proteínas o la actividad catalítica. No olvide que trabajar con reactivos orgánicos puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de equipo de seguridad personal adecuado y una campana extractora al realizar este procedimiento.