Name: Síntesis en fase sólida de un péptido funcionalizado Bis-El uso de Cierre de seguridad Metodología (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Aprende la síntesis en fase sólida de péptidos bis-funcionalizados utilizando resina HMBA y el método de corte con trampa de seguridad. Este protocolo demuestra la eficiencia para obtener productos con alta pureza.

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Los autores desean agradecer al Dr. Zachary Z. Brown y Jennifer Alleva para el desarrollo inicial de esta técnica de síntesis en fase sólida y Matthew Parker FL útil para los debates. Este trabajo es apoyado por la Agencia de Defensa de Reducción de Amenazas (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) y el Premio Horst Witzel Beca financiada por Cephalon, Inc.

1. El programa de instalación <ol><li> La reacción puesta a punto para la síntesis en fase sólida es un cartucho de filtro de polipropileno o reactor de vidrio que está conectado a través de tubos de polipropileno a un matraz cerrado filtrado bajo vacío como se muestra en la Figura 1. La reacción se puede mezclar por una barra de agitación magnética o haciendo burbujear nitrógeno a través del reactor. </li><li> Un colector de gas conectado a un cilindro de argón equipado con un tubo de secado y borboteador de aceite también se recomienda ya que permite al recipiente de reacción para ser contenida en una atmósfera inerte y permite la eliminación de los reactivos de recipientes herméticos. </li><li> Todas las operaciones se llevan a cabo en una campana de humos y equipo de protección personal (anteojos de seguridad, bata de laboratorio y guantes de nitrilo) se requiere. </li></ol> 2. Cargando Primero Bis-péptido en la resina <ol><li> Pesar 114 mg de HMBA-AM Resina (0,88 mmol / g de carga, 100 mmol) en 8 ml recipiente de reacción y añadir la barra de agitación magnética. Tapar la parte superior de THe vasija con un tabique de caucho y el tubo de purga con argón durante al menos 5 minutos. </li><li> Mientras tanto, pesan 117,3 mg del compuesto 1 de la Figura 3 (586,63 g / mol, 2eq) y 59,2 mg de 1 - (mesitileno-2-sulfonil)-3-nitro-1 ,2,4-triazol (MSNT, 296,0 g / mol, 2eq) en un tubo de centrífuga de 15 ml desechable y disolver en 2 ml de diclorometano anhidro (DCM). Añadir 24 l de 1-metilimidazol (NMI, 80,81 ml / mol, 3eq) a la solución y se mezcla hasta que esté completamente disuelto. </li><li> Transferir la solución activada al recipiente de reacción mediante una jeringa y permita que se agita bajo argón durante la noche (aproximadamente 10 horas). </li><li> Quitar el tabique y drenar la mezcla de reacción. Lavar la resina con DCM (5x) y dimetilformamida (DMF) (5x). Lleve a cabo el &quot;metil rojo de prueba&quot; que se describe en la sección 10.1 para evaluar el grado de carga de la resina. Si la resina permanece en rojo durante la prueba de rojo de metilo a continuación los pasos 2.2 y 2.3 se debe repetir. Un color amarillo, indicativo de un grupo metilo negativo en la prueba de color rojo, se prefiere;Sin embargo, puesto que ningún grupo hidroxilo restantes se limitará en la siguiente etapa, un resultado ligeramente positivo (color de la luz resina naranja) puede ser aceptable. </li></ol> 3. La desprotección de primera resina Bis-péptido y simultánea de límite <ol><li> Añadir 1 ml de DCM a la vasija de reacción a continuación, añadir 1 ml 33% gota a gota bromuro de hidrógeno en ácido acético durante 30 segundos (burbujeo se produce) y permitir a agitar durante 15 minutos. Escurrir y lavar la resina con DCM (5x) y luego repetir procesar una vez más. </li><li> Lavar la resina con DCM (5x) y luego DMF (5x). Neutralizar la resina por lavado dos veces con un 5% v / v de solución de N, N-diisopropiletilamina (DIPEA) en DMF a continuación, se lava con DCM (5x) y DMF (5x) de nuevo. Realizar la &quot;prueba de rojo de metilo&quot; y &quot;prueba de cloranil&quot; discutido en las secciones 10.1 y 10.2. Los resultados deben ser negativos para el rojo de metilo prueba y positivo para la prueba de cloranil. </li></ol> 4. Acoplamiento Boc / tBu-Protegido funcionalizados Bis-Amisin ácido <ol><li> Reintroducir una atmósfera inerte a la resina que contiene recipiente de reacción por lavado tres veces con DCM anhidro después coloque un tabique y la línea de argón. Purgar y lavar el recipiente mediante la adición de 1-2 ml de DCM anhidro y dejar que se agita durante 30 segundos y luego vaciar el recipiente hasta que el argón línea de burbujeo empieza a subir. ¿Es esto por lo menos una vez más. </li><li> Preparar una solución de 0,15 M funcionalizado bis-aminoácido (3eq) y 245 mg de 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt, 136,11 g / mol, 18eq) en 2 mL de 2:1 DCM: DMF en una prueba de secado a la llama tubo bajo atmósfera de argón. Añadir 47 l de diisopropilcarbodiimida (DIC, 156,6 ml / mol, 3eq) y se agita durante 90 minutos. </li><li> Añadir 35 l DIPEA (174,19 ml / mol, 2eq) en DMF anhidra 666 l de resina y permita que se agita durante 5 minutos. </li><li> Transferir la pre-activado bis-amino solución de ácido al recipiente de reacción mediante una jeringa y permita que se agita durante la noche. </li><li> Escurrir la mezcla de reacción y se lava dos veces con DCM anhidro mientras que bajo<html> argón. </li><li> Para promover el cierre de la dicetopiperazina, añadir una solución 0,25 M de HOAt (136,11 g / mol, 10eq) y DIC (156,6 ml / mol, 10eq) en un ml 4 de 1:1 DCM: DMF y permitir a agitar en atmósfera de argón durante 1 hora. </li><li> Quitar el tabique y drenar la mezcla de reacción. Lavar la resina con DCM (5x) y DMF (5x). Si lo desea, realice la &quot;prueba de cloranil&quot; discutido en la sección 10.2. </li></ol> 5. La desprotección de Boc / tBu-Protegido funcionalizados Bis-aminoácido <ol><li> Añadir 2 ml de una solución de ácido 95:5 trifluororacetic (TFA): triisopropilsilano (TIPS) al recipiente de reacción y permitir que se agita durante 1 hora. Escurrir y lavar la resina durante unos 30 segundos con DCM (5x) y luego repita el proceso una vez más. </li><li> Lavar la resina con DCM (5x) y luego DMF (5x). Neutralizar la resina por lavado dos veces con un 5% v / v de solución de DIPEA en DMF lavar DCM (5x) y DMF (5x) de nuevo. Si lo desea, realice la &quot;prueba de cloranil&quot; discutido en la sección 10.2. </li></ol>le &quot;&gt; 6. Repita los pasos 4 y 5 como se desee para sintetizar dirigido bis-péptido. 7. El fin de funcionalización Prolidine Bis-péptido <ol><li> El extremo prolidine de la creciente bis-péptido puede ser acilado independientemente o conjuntamente a través de una dicetopiperazina. Además, este fin se puede dejar protegido, que se escinde último, proporcionando el aminoácido libre. Si lo desea, realice la &quot;prueba de cloranil&quot; discutido en la sección 10.2 para evaluar la eficiencia de acoplamiento. </li></ol> 8. La desprotección de Fmoc y acilación de la finalización del Cuaternario de la bis-Péptido <ol><li> Una solución 2 ml de 20% de piperidina en DMF se añade y la mezcla de reacción se durante 20 minutos. Escurrir y lavar la resina con DMF (5x) y luego repita el proceso una vez más. </li><li> Lavar la resina con DCM (5x) y luego DMF (5x). </li><li> Preparar una solución 0,15 M de ácido amino (3eq) en 2 ml de N-metilpirrolidona (NMP) con 114 mg de 2 - (7-aza-1H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato<html> (HATU, 380,2 g / mol, 3eq) y 104,5 l DIPEA (174,19 ml / mol, 6EQ) y mezclar bien. Añadir al recipiente de reacción y permitir en agitación durante 6 horas. </li><li> Lavar la resina con DCM (5x) y luego DMF (5x). </li></ol> 9. Eliminar el grupo Boc desde unido a la resina de aminoácidos y se unirá a partir de Resina <ol><li> Añadir 2 ml de una TFA 1:1: solución de DCM al recipiente de reacción y permitir en agitación durante 30 minutos. Escurrir y lavar la resina con DCM (5x) y luego repetir procesar una vez más. </li><li> Lavar y escurrir la resina durante 30 segundos con DCM (5x) y luego DMF (5x). </li><li> Añadir 2 ml de una solución de 10% DIPEA en DMF anhidro y permitir a agitar 24-48 horas. </li><li> Recoger mezcla de reacción en previamente pesado matraz de fondo redondo. Transferir 30 l de esta solución a 450 l de THF en un frasco de LC-MS y presentar para su análisis. Lavar la resina con alícuotas adicionales de DMF y se recogen en el matraz de fondo redondo entonces eliminar el disolvente a vacío. </li></ol>dflinebreak &quot;&gt; 10. Purificación de Bis-Péptido <ol><li> Disolver crudo bis-péptido en una cantidad mínima de dimetilsulfóxido (100-250 l) y la transferencia en inserto vial de HPLC. Coloque el inserto en el muestreador automático de semi-prepitive sistema de HPLC (Hewlett Packard 1100 Series) equipado con un XTerra Prep MS C18 columna de 5 m mm 7.8x150 y un circuito de inyección de 100 l. </li><li> Realizar múltiples inyecciones de 50 l de la muestra utilizando un programa de gradiente de 5-95% de acetonitrilo en agua con 0,1% de ácido fórmico durante 30 minutos mientras se monitoriza a 274 nm. Recoger el pico del producto en un tubo de centrífuga previamente pesado disponible y congelar en seco utilizando un liofilizador. Se debe tener precaución con la carrera por primera vez como un ligero cambio en el tiempo de retención de pico en comparación con el LCMS de análisis se observa típicamente. </li></ol> 11. Métodos de evaluación <ol><li> Rojo de metilo PRUEBA 7: Retire aproximadamente 1 mg de la resina seca a través de una pipeta desechable y enjuague en 4 ml recipiente de reacción. Añadir una solución de 20 mg de rojo de metilo, 50 N l, N&#39;-diisopropilcarbodiimida (DIC), y 5 mg de 4-dimetilaminopiridina (DMAP) en 500 l DCM anhidro y permita que se agita durante 5-10 minutos. Escurrir y lavar la resina con DCM hasta que el filtrado se vuelve incolora. Indicación positiva es las perlas de resina restantes naranja o rojo. </li><li> PRUEBA cloranil 12: Transferencia de ~ 1 mg de resina seca en un frasco pequeño a través de una pipeta desechable. Añadir 3 gotas de tanto un cloranilo 0,8 mM en solución de DMF y 2% de acetaldehído en solución de DMF y deje reposar a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Indicación positiva es las perlas de resina de inflexión azul / morado. </li><li> Test de activación de TRAP: compuestos activados durante la síntesis se puede evaluar mediante la transferencia de una pequeña cantidad (l 5-10) de la solución activada a una cromatografía líquida-espectrometría de masas (LC-MS) frasco que contiene 50 l de pirrolidina. Mezclar con la mano durante unos segundos (solucidebe convertirse en amarillo) y luego se diluye con 450 l de tetrahidrofurano (THF) y someter a análisis de LC-MS. </li><li> ANALÍTICA LC-MS: El producto final y los intermedios activados se puede evaluar utilizando una HP 1200 serie LC-MS sistema equipado con un Waters Xterra MS C18 3,5 m 4,6 mm x 150 mm de columna y un sistema de gradiente de 5-95% de acetonitrilo en agua con 0,1% de ácido fórmico durante 30 minutos. </li></ol> 12. Los resultados representativos Un ejemplo de ambos crudo (Figura 4) y purificado (Figura 5) trazas LCMS se proporcionan. Purificadas de los rendimientos de aproximadamente el 10% se espera que mediante los métodos descritos anteriormente. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> Figura 1. Diagrama del montaje experimental para la síntesis en fase sólida. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> Figura 2.Nomenclatura pertinente de Bis-Aminoácidos Péptidos / Bis. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> Figura 3. Esquema sintético general. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver más grande la figura</a> . <img alt="Figura 4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> Figura 4a. Traza de HPLC del producto crudo a 274 nm. <img alt="Figura 4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> Figura 4b. Espectro MS del pico de producto bruto. <img alt="Figura 5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> Figura 5a. HPLC de seguimiento de producto purificado a 274 nm. <img alt="Figura 5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> Figura 5b. MS Espectro de Produc purificadat pico.

<ol><li>Atherton, E., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtherton%2C+E+%22Solid+Phase+Peptide+Synthesis%3A+A+Practical+Approach%22">Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (1989).</li>
<li>Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-Phase+Synthesis+of+Functionalized+Bis-Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides.</a> Biopolymers. 96, 578-585 (2010).</li>
<li>Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape-Programmable+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Shape-Programmable Macromolecules.</a> Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).</li>
<li>Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Hexa-+and+Pentasubstituted+Diketopiperazines+from+Sterically+Hindered+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Let%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids.</a> Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).</li>
<li>Nielson, J., Lyngso, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Solid-Phase+Synthesis+of+Balanol+Analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues.</a> Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).</li>
<li>Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Method+for+Anchoring+Fmoc-Amino+Acids+to+Hydroxyl-Functionalized+Solid+Supports%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports.</a> Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).</li>
<li>Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Colorimetric+Test+for+Detection+of+Hydroxyl+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis.</a> Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).</li>
<li>Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Functional+Groups+into+Peptides+via+N-Alkylation%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation.</a> Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).</li>
<li>Plas, S. E. V. ander, Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+New+SPE+Material+for+EDCs%3A+Fully+Automated+Synthesis+of+a+Library+of+Tripodal+Receptors+Followed+by+Fast+Screening+by+Affinity+LC%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC.</a> Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).</li>
<li>Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+Test+for+Detection+of+Free+Terminal+Amino+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis+of+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li>
<li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChan%2C+WC+%22Fmoc+Solid+Phase+Peptide+Synthesis%3A+A+Practical+Approach%22">Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2000).</li>
<li>Vojkovsky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Secondary+Amines+on+Solid-Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Peptide+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of Secondary Amines on Solid-Phase.</a> Peptide Research. 71, 236-237 (1995).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

El enfoque sintético presenta en este documento proporciona un método para la síntesis de péptidos funcionalizados bis-bis-a partir de unidades de aminoácidos utilizando comunes en fase sólida técnicas de síntesis de péptidos. La síntesis de monómeros de estos bloques de construcción &quot;Pro4&quot; de trans-4-hidroxiprolina 3 es altamente escalable y se ha completado con éxito a la etapa de hidantoína en un 600 mmol (234 g) de escala (no publicado). Una vez que los monómeros están en la mano, el uso de técnicas en fase sólida proporciona un método más rápido de bis-péptido de síntesis que nuestro actual en fase de solución metodología 4, eliminando la necesidad de reacción de trabajo en marcha y purificaciones intermedias. El principal desafío en la síntesis en fase sólida es el diagnóstico de los avances sintético y la resolución de problemas ya que no hay intermediarios están aislados. Esto ha llevado al desarrollo de muchos ensayos colorimétricos incluyendo aquellos para identificar si aminas libres (Kaiser Prueba 10) o Hydrox libreHMJM (metil rojo de prueba 7) se exponen en la resina. Desafortunadamente, el uso común de prueba Kaiser 10 no es aplicable en general en nuestra síntesis en fase sólida, debido al uso casi exclusivo de aminas secundarias o aminas unidas a un carbono cuaternario. Otras opciones para la evaluación en resina HMBA incluyen divisiones de prueba usando un nucleófilo tal como hidrazina 11, escisión cuantitativa Fmoc seguimiento por UV / Vis 1,11, y la captura y el análisis de entrantes compuestos activados. Otra cuestión vecinos en síntesis en fase sólida es la naturaleza repetitiva de etapas sintéticas requeridos por el operador. Con esto en mente, los autores recomiendan el uso de una hoja de cálculo o lista de control al realizar cualquier manual de síntesis en fase sólida de péptidos. La dificultad en el uso de bis-péptidos para síntesis en fase sólida en comparación con comunes α-aminoácidos incluye la posibilidad de acoplamientos más difícil debido a estérico HinDrance, la necesidad de cierres de dicetopiperazina en resina, y desprotecciones simultáneas (Boc / tBu; Cbz / tBu). Otra dificultad radica en conseguir la liberación cuantitativa de la resina usando este &quot;cierre de seguridad&quot; método en comparación con medios más convencionales. Con estos factores en mente, es muy posible que una mayor optimización de este método se puede lograr y los esfuerzos actuales están llevando a cabo en nuestro grupo para mejorar el método que aquí se presenta.

<table border="1"><tr><td> Nombre </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td><td> Comentarios </td></tr><tr><td> HMBA-Am Resina </td><td> Novabiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> Novabiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> Tóxico, Corrosivo </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> Cancerígeno </td></tr><tr><td> DCM anhidro </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> Cancerígeno </td></tr><tr><td> 33% de bromuro de hidrógeno en ácido acético </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> Corr. tóxico,osive, humos cuando está abierto </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> Inflamable, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC27960 </td><td> Inflamable, tóxico </td></tr><tr><td> DMF anhidra </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> Inflamable, tóxico </td></tr><tr><td> HOAt </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> Inflamable, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> Tóxico, Corrosivo </td></tr><tr><td> CONSEJOS </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> Inflamable, tóxico </td></tr><tr><td> Piperidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> Inflamable, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; Toxic </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> Tóxico </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> Novabiochem </td><td> 851055 </td><td> Tóxico </td></tr><tr><td> Rojo de metilo </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> Inflamable, tóxico peróxido, Formación </td></tr><tr><td> Pirrolidina </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> Inflamable, tóxico, corrosivo </td></tr><tr><td> Dimetilsulfóxido </td><td> Pescador </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS Los reactores </td><td> Gracia </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> Serie 1200 </td><td></td></tr><tr><td> Semi-Prep LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> Serie 1100 </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Liofilizador </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotavapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 Series </td><td></td></tr><tr><td> Argón </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

síntesis en fase sólida de un péptido funcionalizado bis-el uso de &quot;cierre de seguridad&quot; metodología

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

En 1962, RB Merrifield publicado el primer procedimiento utilizando síntesis en fase sólida de péptidos como una nueva ruta para sintetizar péptidos eficientemente. Esta técnica demostró rápidamente una ventaja respecto a su antecesor en fase de solución en el tiempo y la mano de obra. Las mejoras sobre la naturaleza del soporte sólido, los grupos protectores empleados y los métodos de acoplamiento utilizados en los últimos cinco años sólo han aumentado la utilidad de sistema original de Merrifield. Hoy en día, el uso de una protección Boc-basado y la base / nucleófilo estrategia de resina de escindible o Fmoc basada en la protección y la estrategia de resina ácida escindible, por primera vez por RC Sheppard, son los más utilizados para la síntesis de péptidos 1. Inspirados en sólida de Merrifield estrategia apoyado, hemos desarrollado un Boc / terc-butilo en fase sólida estrategia de síntesis para el montaje de funcionalizados bis-péptidos 2, que se describe en este documento. El uso de síntesis en fase sólida en comparación to en fase de solución metodología no es sólo ventajoso en tanto tiempo y trabajo como se describe por Merrifield 1, sino que también permite una mayor facilidad en la síntesis de bis-péptido bibliotecas. La síntesis que se demuestra aquí incorpora una etapa de escisión final que utiliza una de dos pasos &quot;cierre de seguridad&quot; mecanismo para liberar el funcionalizado bis-péptido de la resina por la formación de dicetopiperazina. Bis-péptidos son rígidos, espiro-escalera oligómeros de bis-aminoácidos que son capaces de posicionar la funcionalidad de una manera predecible y diseñable, controlada por el tipo y la estereoquímica de las unidades monoméricas y la conectividad entre cada monómero. Cada ácido bis-amino es un estereoquímicamente puros, cíclico andamio que contiene dos aminoácidos (un ácido carboxílico con una α-amina) 3,4. Nuestro laboratorio está investigando el potencial de los péptidos funcionales bis-a través de una amplia variedad de campos incluyendo la catálisis, interacciones proteína-proteína y nanomaterials.

El eficiente síntesis en fase sólida de péptidos de un funcionalizado bis-péptido trímero utilizando un &quot;cierre de seguridad&quot; procedimiento de escisión de la resina HMBA se describe.

Síntesis en fase sólida de un péptido funcionalizado Bis-El uso de &quot;Cierre de seguridad&quot; Metodología

En 1962, R.B. Merrifield publicó el primer procedimiento que utilizaba la síntesis de péptidos en fase sólida como una vía novedosa para sintetizar péptidos de manera eficiente. Este ...

El objetivo general del siguiente experimento es sintetizar un péptido BSP funcionalizado utilizando técnicas de fase sólida. Esto se logra cargando un aminoácido BIS protegido sobre una resina de ácido hidroxietilbenzoico. Luego, se repiten ciclos de acoplamiento con protección profunda para unir aminoácidos bis funcionalizados, un proceso que alarga el péptido BIS y expone la funcionalidad deseada.Finalmente, el primer aminoácido bis se modifica con un aminoácido alfa para escindir el péptido BIS de la resina mediante la formación de una pirazina DI cetónica. Los resultados obtenidos muestran la síntesis exitosa de un péptido BSP funcionalizado con buena pureza bruta y rendimientos aislados consistentes de aproximadamente 10 %, según el análisis por espectrometría de masas con cromatografía líquida. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la síntesis paralela y de bibliotecas de péptidos bis, ya que los péptidos BIS se ensamblan sobre una resina sólida, lo que facilita su manipulación en comparación con reacciones en solución, y los subproductos se eliminan fácilmente por filtración.La demostración visual de este método es fundamental, ya que muchos de los pasos son difíciles de aprender debido a que existen muchos detalles importantes necesarios para asegurar que todas las reacciones se acerquen lo más posible a su finalización. En la síntesis en fase sólida, no existe manera de purificar los intermedios. Por lo tanto, para obtener un producto final puro, cada reacción debe impulsarse tanto como sea posible.Se recomienda crear una lista de verificación de los procedimientos experimentales para evitar confusiones, ya que los pasos son de naturaleza repetitiva. Este protocolo comienza con la carga del primer péptido BSP, la protección del primer péptido BSP y la capsulación simultánea de la resina. Para iniciar, cargue el primer péptido BSP pesando 114 miligramos de resina H-M-B-A-A en un vaso de reacción de ocho mililitros y agregue una barra magnética de agitación.Tape la parte superior del recipiente con el septum de goma y purgue el tubo con Argón durante al menos cinco minutos. Mientras tanto, prepare la solución de aminoácido BIS activado según se describe en el protocolo escrito. Junto con este video, transfiera la solución al recipiente de reacción mediante una jeringa y agite bajo Argón durante la noche. Al día siguiente, retire el septum y drene la mezcla de reacción.Lave la resina añadiendo aproximadamente dos mililitros de clorometano a la resina. Agite durante 30 segundos a un minuto y luego drene. Repita este proceso cuatro veces con DCM y luego lave la resina cinco veces con dimetilformamida.Para realizar la desprotección profunda del primer bisaminoácido y la cappingulación simultánea de la resina, agregue lentamente dos mililitros de una solución de 33% de bromuro de hidrógeno en ácido acético y DCM al recipiente de reacción. Deje agitar durante 15 minutos tras drenar y lavar la resina cinco veces con DCM. Repita la secuencia de desprotección D una vez más.A continuación, lave la resina cinco veces con DCM seguido de cinco veces con DMF, neutralice la resina lavando dos veces con la solución al 5% en volumen de D-I-P-E-A en DMF. Luego lave cinco veces con DCM y cinco veces más con DMF. Ahora se puede realizar el acoplamiento del bis aminoácido funcionalizado protegido.Primero, reintroduzca una atmósfera inerte al recipiente de reacción que contiene la resina mediante tres lavados con DCM anhidro. Luego, coloque un septo y purgue y lave el recipiente con una línea de argón, agregando de uno a dos mililitros de DCM anhidro y agitando durante 30 segundos. A continuación, drene el recipiente hasta que comience a subir el burbujeador de la línea de argón.Repita este proceso al menos una vez más. A continuación, prepare una solución de bis aminoácido funcionalizado en un tubo de ensayo secado con llama bajo atmósfera de argón. Añada 47 microlitros de DIC y agite durante 90 minutos.Luego, agregue 35 microlitros de D-I-P-E-A en 666 microlitros y DMF Hydrus a la resina y agite durante cinco minutos adicionales. Transfiera la solución de aminoácido BIS previamente activada al recipiente mediante jeringa y agite durante la noche el día siguiente. Drene la mezcla de reacción y lave dos veces con DCM anhidro bajo argón.Un paso crítico en este procedimiento son los acoplamientos de aminoácidos biz. Para garantizar el cierre de los anillos de dipeptidas cíclicas diketo, empleamos tiempos de reacción más largos con agentes activadores adicionales. Para favorecer el cierre de la diketopirazina, añada una solución de HOAT y DIC y agite bajo argón durante una hora.A continuación, retire el septum y drene la mezcla de reacción. Lave la resina cinco veces con DCM y cinco veces con DMF. Esta sección abarca la protección profunda del aminoácido BIS funcionalizado, la protección profunda de F moc y la acilación del primer aminoácido BIS.Para realizar la protección profunda del bisaminoácido funcionalizado protegido, agregue lentamente dos mililitros de una solución de TFA y TIPS al recipiente de reacción y agite durante una hora tras el drenado; lave la resina con DCM durante aproximadamente 30 segundos y luego drene, repita el lavado con DCM cinco veces. A continuación, repita toda la secuencia de lavado de resina para protección profunda siguiendo el lavado A-D-C-M-D-M-F. Neutralice la resina lavando dos veces con una solución al 5% volumen/volumen de D-I-P-E-A en DMF.Luego, realice otro lavado D-C-M-D-M-F. A partir de este punto, el péptido BIS puede alargarse con otros aminoácidos bis funcionales o funcionarse en el ácido carboxílico del nitrógeno terminal, o ambas cosas. Para desproteger el grupo FM, agregue una solución de dos mililitros de piperidina al 20% en DMF y mezcle la reacción durante 20 minutos.Drenar y lavar la resina cinco veces con DMF. Repetir este proceso una vez más tras un lavado adicional de la resina. A aislar el primer bis aminoácido añadiendo la solución de aminoácido preparada al recipiente de reacción y agitar durante seis horas como paso final.Lave la resina cinco veces con DCM y cinco veces con DMF. La etapa final de este protocolo incluye la eliminación del grupo Bach del aminoácido unido a la resina y la escisión de la resina. Primero, añada dos mililitros de una solución de T-F-A-D-C-M uno a uno al vaso de reacción y agite durante 30 minutos.Drene y lave la resina cinco veces con DCM. Luego repita este proceso una vez más. Lave y drene la resina durante 30 segundos, cinco veces con DCM y cinco veces con DMF.A continuación, agregue dos mililitros de una solución de 10 % D-I-P-E-A en DMF anhidro y agite durante 24 a 48 horas. Finalmente, recoja la mezcla de reacción en un matraz redondo previamente pesado. Transfiera 30 microlitros de esta solución a 450 microlitros de Tetra Hydro FU en un vial de LC-MS y envíela para análisis.Lave la resina con alícuotas adicionales de DMF y recupere en el matraz redondo. Los siguientes métodos pueden utilizarse para monitorear las transformaciones químicas en la resina durante toda la síntesis. Para detectar grupos hidroxilo libres, realice la prueba del rojo de metilo extrayendo primero aproximadamente un miligramo de resina seca mediante pipeta desechable.Lave en un recipiente de reacción de cuatro mililitros. Añada una solución de rojo de metilo preparada como se describe en el texto y agite durante cinco a 10 minutos. Drene y lave la resina cinco veces con DCM; las perlas de resina de color naranja o rojo indican la presencia de grupos hidroxilo libres.Esta prueba puede utilizarse para evaluar la carga del primer aminoácido bis y los pasos de sellado de la resina. Para detectar aminas secundarias, realice la prueba del cloral transfiriendo aproximadamente un miligramo de resina seca a un vial pequeño mediante pipeta desechable. Añada tres gotas de la solución de cloral 0,8 milimolar en DMF y tres gotas de la solución de aldehído ácido al 2% en DMF.Y dejemos reposar a temperatura ambiente durante cinco a 10 minutos. En este caso, las perlas de resina de color azul o púrpura indican que hay aminas secundarias libres presentes en el compuesto unido a la resina. Para confirmar las eficiencias de activación, realice la prueba de atrapamiento de activación; el compuesto activado durante la síntesis puede evaluarse transfiriendo de cinco a 10 microlitros de la solución activada a un vial de cromatografía líquida con espectrometría de masas que contenga 50 microlitros de olaina mezclados manualmente.Durante unos segundos, la solución debe volverse amarilla, luego diluir con 450 microlitros de tetrahidrofuran y someter a análisis por LC-MS. El producto final y los intermedios activados pueden evaluarse utilizando un sistema LCM S equipado con una columna C 18 de fase reversa y un sistema de disolventes de agua acetonitrilo con 0,1 % de ácido fórmico. Este cromatograma L-C-M-S-U-V proporciona un ejemplo de la buena pureza del producto bruto.El pico principal en el espectro encontrado a los 21,3 minutos presenta una máscara consistente con la masa esperada del producto. Esto puede visualizarse en el espectro de masas del producto crudo, donde el pico revela picos principales correspondientes a la masa, más la masa del ion sodio, así como la masa menos la masa del grupo protector IV DDE. Aquí se muestra el cromatograma UV de LCMS de los espectros purificados, que revela un producto muy puro a los 21,3 minutos, y el espectro de masas confirma la identidad de este pico trier purificado.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar técnicas de síntesis en fase sólida para obtener bis péptidos funcionalizados tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de los bis péptidos exploraran aplicaciones en interacciones proteína-proteína y catálisis una vez dominada. Esta técnica puede permitir la síntesis de un trímero de bis péptido funcionalizado en cuatro o cinco días si se realiza adecuadamente.Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las perlas sumergidas en las soluciones de reacción y lavado siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la síntesis paralela o la síntesis de bibliotecas, para responder preguntas adicionales, como el efecto de la estereoquímica o de funcionalidades alternas sobre la unión a proteínas o la actividad catalítica. No olvide que trabajar con reactivos orgánicos puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo adecuado de seguridad personal y una campana extractora, al realizar este procedimiento.

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