Desarrollo de un Backbone cíclica Péptido Biblioteca como Potencial Antiparasitarios Terapéutica Utilizando Microondas irradiación

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar una biblioteca de peptidomiméticos cíclicos focalizada con diversidad conformacional utilizando la irradiación de microondas para nuevas terapias antiparasitarias. Este método puede ayudar a desarrollar herramientas novedosas para dirigirse específicamente a las interacciones proteína-proteína. Para comenzar este procedimiento, agregue 2,5 mililitros del aminoácido deseado, un mililitro de activador y 0,5 mililitros de base activadora a un cartucho de polipropileno.

Coloque el cartucho en un sintetizador de microondas automatizado y deje que la reacción de acoplamiento continúe durante 300 segundos a 25 vatios y 75 grados Celsius. Una vez completada la reacción, lava la resina con siete mililitros de N, N-dimetilformamida o DMF, durante 120 segundos a temperatura ambiente. Después de repetir el paso anterior cinco veces, agregue siete mililitros de piperidina al 20% en DMF con 1-hidroxibenzotriazol 0.1 molar, o HOBt, al cartucho de polipropileno e incube durante 30 segundos a 45 vatios y 75 grados Celsius.

Cuando termines, escurre la mezcla de reacción. A continuación, agregue siete mililitros de piperidina al 20% en DMF con HOBt 0.1 molar al cartucho de polipropileno e incube durante 180 segundos a 45 vatios y 75 grados Celsius. Después de escurrir la mezcla de reacción, lave la resina con siete mililitros de DMF durante 120 segundos a temperatura ambiente.

Luego, lava la resina con siete mililitros de diclorometano, o DCM, durante 120 segundos a temperatura ambiente. Para el acoplamiento de anhídrido, lave la resina con siete mililitros de 1-metil-2-pirrolidinona, o NMP, durante 120 segundos a temperatura ambiente. Cuando termines, escurre la mezcla de reacción.

Después de repetir el paso anterior tres veces, disuelva 10 equivalentes del anhídrido correspondiente en cinco mililitros de NMP en un tubo de polipropileno de 50 mililitros. Luego, agregue un equivalente de 4-dimetilaminopiridina, o DMAP, y 10 equivalentes de N, N-diisopropiletilamina o DIEA, a la solución. Agregue esta mezcla a la resina e incube durante 300 segundos a 25 vatios y 75 grados centígrados.

Después de lavar la resina con NMP, lávala con siete mililitros de DMF durante 120 segundos a temperatura ambiente. En este punto, transfiera la resina a un cartucho de polipropileno equipado con un tapón y una llave de paso. Una vez que la resina se haya lavado con DCM, agregue de 15 a 25 mililitros de una mezcla de 1% de ácido trifluoroacético, 5% de triisopropilsilano y 94% de DCM al cartucho de polipropileno por 1 gramo de resina.

Coloque el cartucho de polipropileno en una coctelera y agite durante cinco minutos a temperatura ambiente. Después de esto, drene la solución del cartucho de polipropileno aplicando una aspiradora. Después de repetir los pasos anteriores tres veces, lava la resina con siete mililitros de DCM durante 120 segundos a temperatura ambiente.

Estos pasos son muy importantes, ya que se encontró que los grupos protectores de tritilo en varias resinas estaban parcialmente escindidos en las soluciones de ácido trifluoroacético DCM. La eliminación de los grupos metiltritilo es un proceso lento que requiere múltiples lavados. En un tubo de polipropileno de 50 mililitros, disuelva cinco equivalentes de benzotriazol-1-ly-oxi-tris-pirrolidinofosfato en cinco mililitros de dibromometano.

Luego, agregue 10 equivalentes de DIEA a la solución. Agregue la mezcla a la resina enjuagada con DCM e incube durante 300 segundos a 25 vatios y 75 grados centígrados. A continuación, lava la resina con siete mililitros de DCM durante 120 segundos a temperatura ambiente.

Después de dos lavados con DCM, transfiera la resina a un cartucho de polipropileno y lave dos veces con éter dietílico. Seque la resina en un desecador al vacío a temperatura ambiente durante al menos tres horas sobre hidróxido de potasio. A continuación, agregue 10 mililitros de un cóctel de escisión de ácido trifluoroacético preenfriado a cada gramo de resina.

Coloque el cartucho de polipropileno en un agitador y agite durante 3 horas a temperatura ambiente. A continuación, recoge la solución de escisión filtrando la resina en un tubo de polipropileno de 50 mililitros. Agregue 35 mililitros de éter dietílico frío al tubo.

Centrifugar durante cinco minutos a 1.207 veces g a cuatro grados centígrados. A continuación, decanta la capa de éter. Para la prueba de Kaiser, prepare la solución A disolviendo 16,5 miligramos de cianuro de potasio en 25 mililitros de agua destilada.

Diluir un mililitro de la solución con 49 mililitros de peridina. A continuación, prepare la solución B disolviendo un gramo de ninhidrina en 20 mililitros de etanol. Prepare la solución C disolviendo 40 gramos de fenol en 20 mililitros de etanol.

Una vez preparadas las soluciones, transfiera algunas perlas de la resina a un tubo de ensayo. Agregue tres gotas de cada solución al tubo y mezcle. Finalmente, caliente el tubo de ensayo en un bloque calefactor a 110 grados centígrados durante cinco minutos.

La síntesis de los péptidos cíclicos de la columna vertebral se realizó utilizando un sintetizador de microondas automatizado sobre soporte sólido siguiendo el protocolo FMOC, t-butilo. El producto se analizó por espectrometría de masas y su grado de pureza se determinó mediante HPLC. El cribado biológico mostró que el péptido pL1 era activo contra Leishmania donovani, un parásito causante de la leishmaniasis visceral, la más grave en humanos.

El péptido pL1 redujo la viabilidad del parásito en un 75% en comparación con el tratamiento control. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres a cinco días si se realiza correctamente. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en una amplia gama de campos exploraran los péptidos como reguladores farmacológicos en la investigación básica y terapéutica.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar una biblioteca enfocada de peptidomiméticos con diversidad conformacional para dirigirse específicamente a las interacciones proteína-proteína. No olvide que trabajar con ácido trifluoroacético puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar protección para los ojos, una bata de laboratorio y guantes mientras se trabaja en una capucha bien ventilada mientras se realiza este procedimiento.