Uso del ratón humanizado BLT como un modelo de células madre del tumor Terapia génica basada en

La generación y caracterización de células T específicas de tumor en ratones humanizados se describe aquí. Tejido del timo humano y genéticamente modificados células madre hematopoyéticas son trasplantados en ratones inmunodeficientes. Esto da como resultado la reconstitución de una ingeniería del sistema inmune humano permitiendo examen in vivo de anti-tumor de la respuesta inmune.

El objetivo general del siguiente experimento es generar ratones portadores de un sistema inmunológico humano modificado. Esto se logra preparando primero al ratón para la cirugía y luego cargando el trócar con un trozo de timo en el segundo paso. Matrigel se mezcla con células transducidas CD 34 negativas y CD 34 positivas, y la mezcla se añade al trocar.

A continuación, las construcciones matrigel se trasplantan debajo de la cápsula renal. En última instancia, el rechazo de los tumores objetivo por parte de las células T CD ocho modificadas genéticamente se puede monitorear mediante imágenes de mascotas vivas y mediciones físicas de tumores. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos de metanfetamina existentes, como los modelos de neuronas completas, es que este método permite el estudio del desarrollo de células madre humanas modificadas genéticamente dentro del timo humano y las posteriores pruebas de eficacia in vivo de linajes derivados que demuestren que el procedimiento será realizado por tres técnicos de nuestros laboratorios, Gregory Bristol, Bernard Levin, y Sean Kim.

En este diagrama esquemático, se describe el modelo BLT modificado utilizado en estos estudios para la generación de ratones quiméricos portadores de mart, una célula T específica. El implante se reconstruye a partir de células CD 34 transducidas y no transducidas aisladas de un hígado fetal autólogo. A continuación, se congela una fracción de las células transducidas y se inyecta en los ratones irradiados de cuatro a seis semanas después.

En este video, se muestra la implantación del constructo vivo una vez que los animales se han vuelto lentos por la anestesia. Comience afeitando el lado izquierdo de cada ratón desde la cadera hasta el hombro entre el centro de la espalda y el vientre. Después de registrar el peso de cada animal, perforar sus orejas para numerarlas y por vía subcutánea, inyectarles 0,3 mililitros de carprofeno en cada uno de sus hombros.

A continuación, coloque a los ratones sobre su lado derecho, mirando hacia la izquierda. Ahora enjuague el trócar de una aguja de implante de cáncer de calibre 16 con una punta de lima redonda con PBS. Con un par de pinzas nasales de aguja, agregue un trozo de timo al plato de PBS y luego sostenga el trócar horizontalmente con la varilla.

Justo dentro de la punta aspira el tejido. Deslizar el trócar debajo de la cápsula renal e inyectar el tejido es uno de los aspectos más desafiantes de este procedimiento. A continuación, tenga un ayudante.

Utilice una pipeta de desplazamiento positivo eend orph para mezclar cinco microlitros de matrigel frío en un tubo de celdas con una agitación suave. Mantener el trócar horizontal. Tire lentamente hacia atrás de la varilla mientras el ayudante pipetea el gel matri.

Mézclalo con el trocar para cada ratón. Primero, frote la piel desnuda del animal con Betadine y luego límpiela con una toallita de isopropanol. Dos veces determinan el punto más oscuro debajo de la piel, lo que indica la ubicación del bazo.

El riñón se encuentra a unos cinco milímetros dorsal al bazo utilizando pinzas romas para recoger la piel sobre el riñón. Haz una incisión de unos 15 milímetros de largo en la piel paralela al bazo. Haz un corte similar en la capa muscular del peritoneo que se encuentra debajo.

En los hombres, el riñón debe ser directamente visible. Basta con apretar el abdomen para sacarlo. Manteniendo la presión sobre el abdomen con la mano izquierda para mantener el riñón expuesto, en las mujeres primero se usa un hemostático para recoger el ovario y luego se arrastra el riñón para ayudar a retener el órgano fuera del cuerpo.

Raspe un pequeño orificio en el extremo posterior de la cápsula renal y luego deslice el trócar dentro de este orificio y a lo largo del riñón hasta que el orificio del trócar esté completamente cubierto por la cápsula renal. Luego, con el dedo meñique de la mano derecha, inyecte el tejido. Ahora use el hemostático cerrado para empujar suavemente el riñón de vuelta a su lugar.

Ata un punto en el peritoneo con un lazo doble, apretando la piel como si fuera un bolso, y luego colócalo en dos pinzas para heridas. Finalmente, coloque una gota de PBS en cada ojo y coloque al ratón de lado en una jaula encima de un poco de ropa de cama. Después de implantar a todos los ratones de la misma manera, confirme que los animales han vuelto a acostarse boca abajo antes de abandonarlos.

Esta primera figura muestra una imagen representativa del implante vivo THI en ratones humanizados. En esta figura, se demuestra el desarrollo normal del tejido tímico y la distribución del tejido fisiológico de la T humana CD cuatro y CD ocho positiva. Después de la reconstitución, los animales portan un sistema inmunológico humano con una distribución normal de células T CD cuatro y CD ocho positivas.

Aquí se muestra una imagen representativa de un ratón portador de un tumor de melanoma. Las áreas grises indican la imagen de la tomografía computarizada. Las áreas coloreadas indican la actividad metabólica del tumor detectada por la PET.

La tomografía computarizada sola en este experimento indicó una gran masa tumoral en el área indicada por el círculo blanco. Sin embargo, como ilustran las imágenes PET in vivo, esta área consiste principalmente en tejido necrótico y cicatricial, lo que subraya la utilidad de las imágenes PET como una forma más sensible y precisa de evaluar la regresión y el aclaramiento tumoral. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros ensayos, como el de células T, el fenotipado y la activación ex vivo, para responder a preguntas relacionadas con la función de las células T.