Multi-objetivo enfoque de procesamiento paralelo para Gene a la estructura de determinación de la polimerasa subunidad PB2 Influenza

El objetivo general del siguiente experimento es utilizar un enfoque multiobjetivo para la determinación estructurada de una proteína objetivo mediante cristalografía de rayos X, comenzando con un solo gen o secuencia genética en el caso presentado aquí. La proteína diana es la subunidad PB dos polimerasa de la gripe A, un componente clave de la replicación viral. El enfoque multiobjetivo se logra diseñando y clonando primero una serie de construcciones genéticas en paralelo basadas en la secuencia de un solo objetivo y otra información conocida sobre la proteína.

El segundo paso es probar los niveles de expresión para cada constructo y seleccionar los mejores para la expresión de proteínas a gran escala en cultivo celular. El siguiente paso consiste en romper las células para eliminar las proteínas objetivo del material de expresión y refinar cada una de ellas hasta obtener una pureza muy alta. A continuación, se establecen una serie de ensayos de cristalización con cada proteína para obtener una forma cristalina adecuada para los estudios de rayos X.

A continuación, se recogen datos de difracción de rayos X de alta resolución en uno o más cristales y se utilizan para resolver y refinar un mapa de densidad de electrones que describe la estructura de cada proteína objetivo. Estos resultados permiten la representación de una estructura tridimensional de la proteína diana basada en el mapa de densidad de electrones. El procesamiento de objetivos múltiples aumenta en gran medida la probabilidad de éxito en la determinación estructurada al proporcionar alternativas viables en cada obstáculo potencial en el camino.

Trabajar con múltiples objetivos en paralelo también es muy eficiente, reduciendo el tiempo y el coste por proteína en cada paso. El potencial de aumentar la tasa a la que se completa la determinación estructurada de objetivos farmacológicos permitirá más oportunidades de desarrollo de terapias por año. Aunque este método puede proporcionar información valiosa en biología estructural, la proteína de alta calidad obtenida a través de estos métodos puede respaldar cualquier investigación basada en proteínas.

Cada fase del proceso tiene su propia ciencia y requiere su propia experiencia, pero la inversión en personas, instrumentación y conocimientos técnicos puede dar sus frutos una vez que se ensamblan todas las piezas. Una vez que se seleccionan un gen objetivo y un producto génico para la investigación, el primer paso requiere el diseño de múltiples variantes genéticas o construcciones. El software Gene Composer se utiliza para diseñar estas construcciones a nivel de proteína junto con el código asociado en secuencias de genes sintéticos diseñados.

Con el módulo de visor de alineaciones y el módulo de diseño de constructos, compare las alineaciones de secuencias de proteínas y defina los cebadores o amplificadores terminales de PCR vectorial y PCR de diseño de construcciones de proteínas. A continuación, utilice el algoritmo de proteína a ADN del compositor de genes para traducir cada secuencia de aminoácidos en un código en una secuencia de ácido nucleico modificada. Utilice el código adecuado en la tabla de uso para optimizar la secuencia de expresión en una línea celular específica.

En este caso, la bacteria E. coli. Una vez que la secuencia del gen objetivo esté lista, clone e inserte virtualmente el gen en un plásmido vectorial adecuado para la expresión bacteriana. En este caso, un vector PET 28 modificado.

Este vector contiene ciertos componentes necesarios para la expresión y purificación de proteínas. El gen diana se modifica para incorporar una secuencia de etiqueta de histamina en el extremo N o C de la proteína y una secuencia de escisión para permitir la eliminación de la etiqueta durante la purificación. El vector también posee un gen de resistencia a los antibióticos para las pruebas de expresión y la fermentación.

A continuación, cada secuencia genética de proteína diana se crea mediante métodos estándar de síntesis de genes en preparación para la clonación de la polimerasa en pipa, la clonación de extensión primaria incompleta, o clonación en pipa, es una estrategia de clonación basada en PCR en la que el gen diana se amplifica con cebadores que son complementarios al vector previsto. Este método explota la naturaleza incompleta de la PCR en etapa tardía, lo que deja los productos de PCR con terminales monocatenarios variables. Preparo el inserto PCR o IPCR añadiendo cinco microlitros de cebadores directos e inversos a cada reacción.

En una placa de 96 pocillos de acuerdo con un mapa de placas, agregue dos microlitros de cada gen sintético de longitud completa a su pocillo apropiado de acuerdo con el mapa de placas. Después de agregar 25 microlitros de mezcla maestra de PFU a cada uno, cicle las reacciones 25 veces usando las siguientes condiciones de PCR. Se desnaturaliza a 95 grados centígrados durante 30 segundos.

Anil a 50 grados centígrados durante 45 segundos y se extiende a 68 grados centígrados durante tres minutos. La amplificación de fragmentos se confirma mediante el análisis en gel AGROS de los productos IPCR. Los productos de IPCR exitosos están representados por bandas robustas.

Los resultados menos deseables a menudo se ven como bandas tenues o frotis en una reacción separada. La expresión del plásmido se amplifica mediante PCR vectorial o la amplificación de fragmentos de VPCR se confirma mediante el análisis en gel AROS de los productos VPCR. Una vez que se amplifican los productos IPCR y VPCR, se agregan a una placa de fusión y se colocan en un termociclador para la reacción de fusión.

Las construcciones clonadas con éxito se transforman en células de E. coli químicamente competentes y se almacenan en tallos de glicerol para comenzar la racha de pruebas de expresión. Una pequeña cantidad de cada muestra de una reserva de glicerol clonada en una placa de agar separada. La placa se elabora con caldo de nutrientes bacterianos y el marcador antibiótico Kanamicina codificado en el vector para incubar durante la noche a 37 grados centígrados al día siguiente.

Comience un precultivo para cada muestra eligiendo una sola colonia de la placa de agar recién cultivada. Utilice esta colonia para inocular 1,2 mililitros de caldo de tuberculosis suplementado con micina y glucosa para el procesamiento paralelo. Cada precultivo se cultiva en un bloque de fondo redondo de 96 pocillos.

Crece durante la noche a 37 grados centígrados con agitación a 220 rotaciones por minuto. Después del crecimiento nocturno. Inicie cultivos de inducción a pequeña escala para cada muestra utilizando 40 microlitros del precultivo para inocular.

1,2 mililitros de caldo de tuberculosis. Suplementado con 50 miligramos por mililitro de micina en lata y novagen overnight express system. Uno, cultivar los cultivos de inducción a 20 grados centígrados durante 48 horas, agitando a 220 RPM las células de cosecha por centrifugación a 4.000 unidades GForce durante 15 minutos.

Vierta el sobrenadante y almacene los gránulos a menos 20 grados centígrados durante al menos una hora antes de continuar con el procesamiento después de la purificación. Analice la proteína con y sin reacción de escisión por electroforesis capilar utilizando un sistema calibrador lab CHIP 90 según el protocolo del fabricante. En el caso de la gripe a, la subunidad 14 de la proteína PB dos de las 34 construcciones condujo a la proteína diana soluble y entró en el siguiente paso: la fermentación a gran escala.

Para comenzar una fermentación a gran escala, inocule 100 mililitros de caldo de cultivo de células bacterianas que contenga 50 miligramos por mililitro. ¿Puede la micina de una reserva de glicerol crecer durante la noche a 37 grados centígrados? Agitando a 220 RPM al día siguiente, expanda el precultivo utilizando 10 mililitros para inocular.

Un litro de caldo que contiene medios de autoinducción y 50 miligramos por mililitro pueden micina en un matraz con deflector de dos litros. Agitar los cultivos expandidos a 37 grados centígrados aproximadamente cada 30 minutos. Compruebe la densidad óptica del cultivo midiendo la absorbancia UV a una longitud de onda de 600 nanómetros.

Cuando se alcance una densidad óptica de 0,6, cambie la temperatura de la incubadora agitadora a 20 grados centígrados después del tiempo de crecimiento deseado. Retire un cuádruple Ali representativo de 10 mililitros de cada construcción para realizar pruebas de expresión. Recolección de células por centrifugación a 5.000 unidades GForce durante 15 minutos.

Vierta el sobrenadante y congele la pastilla de celda a menos 80 grados centígrados. Para comenzar este procedimiento, descongele y vuelva a suspender la pasta celular en el tampón de lisis en una proporción de volumen maestro de uno a cinco. Revuelva vigorosamente durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Use una espátula limpia para soltar los trozos del costado del vaso de precipitados. Limente mecánicamente las células en hielo con un sonicate masónico. Clarificar el lisado crudo por centrifugación a 18.000 unidades GForce durante 30 minutos a cuatro grados centígrados.

Recoja el sobrenadante y guarde una pequeña alícuota para su análisis antes de proceder a la purificación a gran escala. Confirme la expresión de proteínas a gran escala de cada cultivo a través del análisis de gel de página SDS. Este resultado representativo de la página SDS muestra una expresión robusta de proteínas, aproximadamente 50% de solubilidad y alrededor de 50% de escisión.

En este caso, se retiró la etiqueta de histidina junto con una etiqueta de solubilidad de proteínas añadida, que se diseñó en la construcción original. La resina de níquel se utiliza para separar la proteína objetivo con la etiqueta única de histamina de todo el resto del material celular, incluidas las proteínas bacterianas nativas. Una columna de níquel se prepara lavándola con cuatro volúmenes de columna de agua UE para eliminar el tampón de almacenamiento, seguido de un volumen de columna de tampón B y cinco volúmenes de columna de tampón.

La paralelización de equilibrio A para E se realiza con el fabricante de proteínas, que es capaz de ejecutar varias columnas a la vez. Cargue cada lisado clarificado que contenga proteína solubilizada con etiqueta de histamina en una columna separada a una velocidad de dos mililitros por minuto, seguido de varios lavados de volumen de columna con tampón A, recoja el flujo a través del tampón y guárdelo para el análisis. Eluir la proteína unida en una serie de gradientes escalonados con tampones A y B a 95 a cinco, 60 a 40 y, finalmente, 100% tampón B. Los componentes del tampón B compiten con la histamina por la resina de níquel y, por lo tanto, eliminan la proteína de la columna en una proporción determinada.

Recoja cada fracción de elución por separado. Aquí se muestra un cromatograma representativo resultado de una corrida en una columna de níquel. Analice las fracciones eludidas de níquel, el lisado crudo, el lisado clarificado y el flujo de níquel por la página SDS y compárelo con la absorbancia UV a 280 nanómetros recolectada durante la purificación de la columna.

Este paso determina si la purificación se realizó correctamente. Seleccionar y agrupar las fracciones que contienen la proteína objetivo para transportarlas para su posterior procesamiento. Calcule la cantidad total de proteína en esta etapa con el coeficiente de extinción teórico de la proteína, midiendo la absorbancia UV a 280 nanómetros y teniendo en cuenta el volumen total de las fracciones agrupadas.

Guarde una pequeña muestra para el análisis. El gen de la proteína diana se codificó con una secuencia específica, que es reconocida por ULP uno como un sitio de escisión, por lo que la adición de ULP uno da como resultado la escisión entre la etiqueta de histidina y la proteína de interés. Para comenzar este procedimiento, agregue un microlitro de ubiquitina como proteasa, uno por cada cinco miligramos de proteína presente en las fracciones agrupadas.

En este punto, la proteína escindida se transfiere del tampón B al tampón A para su posterior procesamiento mediante tubos de diálisis, dializada la proteína contra dos litros de tampón, A durante cuatro horas a cuatro grados Celsius con agitación. Utilice un punto de corte de peso molecular de 10 kilodalton para PB dos después de la diálisis. Ejecute otro gel de página SDS de la proteína objetivo con y sin ULP uno presente.

Esto determinará si la escisión de ULP one fue exitosa y permitirá la selección de las mejores fracciones para llevarlas a cabo para su posterior procesamiento. Aquí se muestran los resultados de nuestra página representativa de SDS para tres construcciones de la polimerasa pb. Dos marcadores de peso molecular de subunidades están en el carril uno.

Los carriles dos, seis y 10 son proteínas agrupadas de columnas de níquel uno. Los carriles tres, siete y 11 contienen el flujo de proteína escindida en el tampón A desde el níquel dos y los carriles cuatro, ocho y 12. Muestra la eliminación de la etiqueta de histamina en el tampón B del níquel dos.

Después de la eliminación de la histamina, se concentran las fracciones agrupadas del níquel dos. Para comenzar la SEC, se debe elegir nuevamente la resina adecuada en función del peso molecular del objetivo. En este caso, se utiliza la columna acere S 110 sobre 30 GL y se equilibra con un tampón SEC de 200 mililitros a un caudal de 0,5 mililitros por minuto utilizando una jeringa de cinco mililitros, cargue la muestra en un circuito de muestra de 10 mililitros y comience la ejecución de la columna SEC. Controle el cromatograma absorbente UV a 280 nanómetros mientras recolecta fracciones de pequeño volumen.

Ejecute todas las fracciones SEC relevantes a través de la página SDS. El enfoque estándar para los ensayos de cristalización de proteínas se lleva a cabo mediante el método de gota sentada que involucra la difusión de vapor. No es raro establecer dos o más cribas de matriz dispersas al principio para cada proteína diana.

Para iniciar este proceso, llene previamente cada depósito de una placa de cristalización junior compacta de 96 pocillos con 80 microlitros en cada condición en la pantalla de cristalización seleccionada, dispense 0,4 microlitros de proteína en tampón SEC en cada uno de los 96 pocillos. A continuación, añada 0,4 microlitros de la criba de cristalización, asegurando la mezcla completa de la gota en cada uno. Cubra todo el terreno con cinta adhesiva para techos transparente, asegurando un sellado completo en cada pozo, almacene la placa a 16 grados centígrados en un lugar tranquilo y libre de vibraciones ambientales.

Verifique la cristalización de proteínas periódicamente durante las próximas semanas bajo un microscopio de disección. Si no aparecen cristales de proteína, coloque nuevas placas con diferentes condiciones y varíe la concentración de proteína en la gota final para aumentar la probabilidad de éxito antes de la cosecha. Enfríe un disco estilo A LS en un hacedor lleno de nitrógeno líquido y cúbralo con una tapa para comenzar a cosechar.

Corta la cinta transparente que cubre el pocillo con el cristal de proteína objetivo a un vacío cercano. Pues añade 1,6 microlitros de la condición de cristalización correspondiente y combínalo con 0,4 microlitros de etilenglicol. Una solución de etilenglicol al 20% en estado de cristalización protege el cristal de proteína.

Durante la criocongelación, analice el cristal bajo el microscopio y seleccione un bucle criogénico adecuado para la recolección, haciendo coincidir el diámetro interior del bucle con el ancho máximo del cristal. Conecte el bucle criogénico a una varilla de cristal magnética y enrolle el cristal directamente desde la solución del pozo. Sumerja inmediatamente el bucle criogénico con el cristal recolectado en un crioprotector y luego sumérjalo en el disco estilo LS.

Para parpadear, congele el cristal y repita hasta obtener el número deseado de cristales. Una vez que se complete la cosecha, use una varita de disco para colocar una tapa magnética en el disco que contenga cristales congelados rápidamente con lenguas dobladas. Dale la vuelta al disco para el siguiente paso.

Atornille un empujador de discos en el disco, luego transfiera el disco al hacedor de actores KU y úselo para perforar la tapa. Los cristales del disco permanecen congelados en un baño de nitrógeno líquido hasta que están listos para los estudios de difracción de rayos X utilizando el software de adquisición de imágenes J Director. Configure los siguientes parámetros para: pantalla de cristal, hendidura del haz a 0,5 grados, distancia del detector de 50 milímetros, paso de imagen a 70 grados y duración de exposición de 30 segundos.

Aquí hay un ejemplo de captura de pantalla del software de adquisición de imágenes mientras se proyecta un cristal, el panel central muestra la difracción de rayos X observada de un cristal representativo que recopila suficientes imágenes a alta resolución para un conjunto de datos completo necesario para la determinación de la estructura tridimensional. Las estrategias de clonación y purificación de proteínas demostradas en este video dieron como resultado 14 PB purificados, dos muestras, de las cuales nueve produjeron cristales adecuados para estudios de difracción. El conjunto de datos internos de difracción de rayos X se recopiló en cinco de las nueve construcciones con radiación alfa QK utilizando un generador de rayos X de ánodo giratorio FRE plus súper brillante de Rigaku, equipado con óptica ossec variax hf, HF y un detector CCD Saturn 944 plus.

Aquí se muestra una imagen de difracción de rayos X de la subunidad PB dos de la polimerasa. Se procesó cada conjunto de datos y se determinaron un total de cuatro estructuras de la subunidad PB dos. Cada estructura fue revisada por pares y cargada en el banco de datos de proteínas para acceso público.

Esta figura muestra diagramas de cinta de las moléculas en la unidad asimétrica cristalográfica. De las cuatro estructuras PB dos, las estructuras secundarias están coloreadas en un patrón de arco iris con los códigos PDB correspondientes. En esta tabla se muestra el análisis de los resultados de los dos objetivos de la influenza PB mediante los métodos descritos en este artículo de video.

El proceso de procesamiento paralelo de múltiples objetivos para la determinación de genes a estructuras se ilustra en cinco pasos: clonación, solubilidad, purificación, cristalización y determinación de estructuras. El resultado de nuestra cartera de productos de biología estructural no solo proporciona la base para la investigación basada en la estructura, sino que también alimenta estudios adicionales, como ensayos funcionales para confirmar la función de las proteínas o el cribado biofísico de nuevos compuestos mediante un MAR o SPR para identificar nuevos puntos de partida para el desarrollo de fármacos. Esta técnica y las herramientas inventadas junto con ella han ayudado a allanar el camino para que los biólogos estructurales detecten muchos tipos de investigaciones basadas en descubrimientos, incluido el diseño de fármacos basados en estructuras, que ha tenido un gran impacto en la salud y las enfermedades humanas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo el procesamiento paralelo de múltiples objetivos puede aumentar en gran medida el éxito de la determinación estructurada. No olvide que trabajar en un laboratorio de biología estructural puede ser extremadamente peligroso y que siempre se deben tomar las precauciones adecuadas, como el uso de EPP, mientras se realizan actividades de laboratorio.