Multi-objetivo enfoque de procesamiento paralelo para Gene a la estructura de determinación de la polimerasa subunidad PB2 Influenza

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar un enfoque de múltiples objetivos para la determinación estructural de una proteína diana mediante cristalografía de rayos X, partiendo únicamente de un solo gen o secuencia genética, como en el caso presentado aquí. La proteína diana es la subunidad PB2 de la ARN polimerasa del virus de la influenza A, un componente clave de la replicación viral. El enfoque de múltiples objetivos se logra primero mediante el diseño y clonación en paralelo de una serie de constructos genéticos basados en la única secuencia diana y en otra información conocida acerca de la proteína.

El segundo paso consiste en probar los niveles de expresión de cada construcción y seleccionar las mejores para la expresión a gran escala de proteínas en cultivo celular. El siguiente paso requiere romper las células para separar las proteínas diana del material de expresión y purificar cada una de ellas hasta una elevada pureza. A continuación, se realizan una serie de ensayos de cristalización con cada proteína para obtener una forma cristalina adecuada para estudios con rayos X.

Posteriormente, se recopilan datos de difracción de rayos X de alta resolución en uno o más cristales y se utilizan para resolver y perfeccionar un mapa de densidad electrónica que describe la estructura de cada proteína diana. Estos resultados permiten la obtención de una estructura tridimensional de la proteína diana basada en el mapa de densidad electrónica. El procesamiento de múltiples objetivos aumenta considerablemente la probabilidad de éxito en la determinación estructural al proporcionar alternativas viables en cada posible obstáculo del camino.

Trabajar en múltiples objetivos en paralelo también es altamente eficiente, ya que reduce el tiempo y el costo por proteína en cada paso. La posibilidad de aumentar la tasa a la que se completan las determinaciones estructurales para objetivos farmacológicos permitirá más oportunidades de desarrollo de terapias por año. Aunque este método puede proporcionar información valiosa en biología estructural, la proteína de alta calidad obtenida mediante estos métodos puede apoyar cualquier investigación basada en proteínas.

Cada fase del proceso tiene su propia ciencia y requiere su propia especialización, pero la inversión en personal, instrumentación y conocimientos puede dar excelentes resultados una vez que todas las piezas se han ensamblado. Una vez que se selecciona un gen objetivo y su producto génico para su estudio, el primer paso requiere el diseño de múltiples variantes genéticas o constructos. Se utiliza un software de composición génica para diseñar estos constructos a nivel de proteína junto con el código asociado en secuencias génicas sintéticas diseñadas.

Mediante el módulo de visualización de alineamientos y el módulo de diseño de constructos, compare alineamientos de secuencias de proteínas y defina el diseño de constructos proteicos, inserte cebadores PCR y cebadores PCR vectoriales terminales o ampers. A continuación, utilice el algoritmo de proteína a ADN de Gene Composer para retrotraducir cada secuencia de aminoácidos a un código en la secuencia de ácido nucleico ingenierizado. Utilice la tabla de uso de códigos adecuada para optimizar la secuencia para su expresión en una línea celular específica.

En este caso, bacterias E. coli. Una vez que la secuencia del gen diana esté lista, clonar e insertar virtualmente el gen en un plásmido vector adecuado para la expresión bacteriana. En este caso, un vector PET 28 modificado.

Este vector contiene ciertos componentes necesarios para la expresión y la purificación de proteínas. El gen diana se modifica para incorporar una secuencia de etiqueta de histamina en el extremo N o C de la proteína y una secuencia de escisión que permite la eliminación de la etiqueta durante la purificación. El vector también posee un gen de resistencia a antibióticos para la prueba de expresión y la fermentación.

Cada secuencia genética de la proteína diana se crea entonces mediante métodos estándar de síntesis génica en preparación para la clonación por extensión primaria incompleta de polimerasa, o clonación PIPE, que es una estrategia de clonación basada en PCR en la cual el gen diana se amplifica con cebadores complementarios al vector previsto. Este método aprovecha la naturaleza incompleta de la PCR en etapas tardías, que deja a los productos de PCR con extremos monocatenarios variables. Preparo la PCR del inserto o IPCR añadiendo cinco microlitros de cada cebador, directo e inverso, a cada reacción.

En una placa de 96 pocillos según un mapa de placa, agregue dos microlitros de cada gen sintético de longitud completa al pocillo correspondiente según el mapa de placa. Después de agregar 25 microlitros de la mezcla maestra de PFU a cada uno, realice 25 ciclos de las reacciones utilizando las siguientes condiciones de PCR. Desnaturalice a 95 grados Celsius durante 30 segundos.

Anil a 50 grados Celsius durante 45 segundos y extiende a 68 grados Celsius durante tres minutos. La amplificación del fragmento se confirma mediante análisis en gel ARGOS de los productos de IPCR. Los productos de IPCR exitosos se representan mediante bandas intensas.

Los resultados menos deseados suelen observarse como bandas débiles o borrosas en una reacción separada. El plásmido de expresión se amplifica mediante PCR del vector o se confirma la amplificación del fragmento mediante análisis en gel AROS de los productos de VPCR. Una vez amplificados los productos de IPCR y VPCR, se añaden a una placa de fusión y se colocan en un termociclador para la reacción de fusión.

Los constructos clonados con éxito se transforman luego en células de E. coli competentes químicamente y se almacenan en hisopos de glicerol para comenzar la siembra de pruebas de expresión. Se toma una pequeña cantidad de cada muestra de un stock de glicerol del constructo clonado y se siembra en una placa de agar separada. La placa se prepara con caldo nutriente bacteriano y el marcador antibiótico kanamicina codificado en el vector, e incuba durante la noche a 37 grados Celsius al día siguiente.

Inicie un cultivo previo para cada muestra seleccionando una colonia individual de la placa de agar recién cultivada. Utilice esta colonia para inocular 1,2 mililitros de caldo TB suplementado con canamicina y glucosa para procesamiento paralelo. Cada cultivo previo se cultiva en un bloque de 96 pocillos con fondo redondo.

Crecer durante la noche a 37 grados Celsius con agitación a 220 rotaciones por minuto. Después del crecimiento nocturno, iniciar cultivos de inducción a pequeña escala para cada muestra utilizando 40 microlitros del precultivo para la inoculación.

1,2 mililitros de caldo TB suplementado con 50 miligramos por mililitro de canamicina y sistema Novagen Overnight Express. Incubar, a 20 grados Celsius durante 48 horas, los cultivos de inducción con agitación a 220 RPM. Recoger las células por centrifugación a 4.000 unidades de fuerza G durante 15 minutos.

Vierta el sobrenadante y almacene los pellet a menos 20 grados Celsius durante al menos una hora antes del procesamiento posterior tras la purificación. Analice la proteína con y sin reacción de escisión mediante electroforesis capilar utilizando un sistema Caliper Lab CHIP 90 según el protocolo del fabricante. En el caso de la subunidad de la proteína PB2 de influenza A, 14 de los 34 constructos produjeron proteína diana soluble e ingresaron al siguiente paso de fermentación a gran escala.

Para iniciar una fermentación a gran escala, inocule 100 mililitros de caldo de cultivo bacteriano que contenga 50 miligramos por mililitro de canamicina a partir de un stock de glicerol y cultive durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, agitando a 220 RPM, amplíe el precultivo utilizando 10 mililitros para la inoculación.

Un litro de caldo que contiene medio de inducción automática y 50 miligramos por mililitro de canamicina en un matraz agitador de dos litros. Agite las cultivos ampliados a 37 grados Celsius aproximadamente cada 30 minutos. Verifique la densidad óptica del cultivo midiendo la absorbancia UV a una longitud de onda de 600 nanómetros.

Cuando se alcance una densidad óptica de 0,6, cambie la temperatura del incubador con agitación a 20 grados Celsius tras el tiempo de crecimiento deseado. Retire un alícuota representativo de 10 mililitros de cada constructo para la prueba de expresión. Recopile las células mediante centrifugación a 5.000 unidades de fuerza G durante 15 minutos.

Vierta el sobrenadante y congele el sedimento celular a menos 80 grados Celsius. Para comenzar este procedimiento, descongele y resuspenda la pasta celular en tampón de lisis a una relación de volumen de uno a cinco. Agite vigorosamente durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.

Utilice una espátula limpia para desprender trozos de la pared del vaso de precipitados. Lise mecánicamente las células en hielo mediante un sonicador de Mason. Clarifique el lisado crudo por centrifugación a 18.000 unidades de fuerza centrífuga durante 30 minutos a cuatro grados Celsius.

Recolecte el sobrenadante y guarde una pequeña alícuota para análisis antes de proceder con la purificación a gran escala. Confirme la expresión proteica a gran escala de cada cultivo mediante análisis en gel SDS-PAGE. Este resultado representativo de SDS-PAGE muestra una expresión proteica robusta, aproximadamente 50% de solubilidad y alrededor del 50% de escisión.

En este caso, la etiqueta de histidina se eliminó junto con una etiqueta de solubilidad proteica añadida, que fue diseñada en el constructo original. Se utiliza una resina de níquel para separar la proteína diana con la etiqueta única de histidina de todo el resto del material celular, incluyendo las proteínas bacterianas nativas. Se prepara una columna de níquel lavando con cuatro volúmenes de columna de agua UE para eliminar el tampón de almacenamiento, seguido de un volumen de columna de tampón B y cinco volúmenes de columna de tampón.

Se realiza una paralelización de la equilibración A para E con el sistema de cromatografía por afinidad, que es capaz de operar múltiples columnas simultáneamente. Cargue cada lisado clarificado que contenga la proteína solubilizada con etiqueta de histamina en una columna separada a una velocidad de dos mililitros por minuto, seguido de varios lavados con volúmenes de columna de tampón A; recoja el tampón del flujo inicial y guárdelo para su análisis. Eluya la proteína retenida mediante una serie de gradientes escalonados con los tampones A y B al 95 a 5, 60 a 40 y finalmente al 100 % del tampón B. Los componentes del tampón B compiten con la histamina por la resina de níquel y, por lo tanto, desplazan la proteína de la columna en una proporción determinada.

Recoger cada fracción de elución por separado. Aquí se muestra un resultado representativo de un cromatograma obtenido en una corrida en una columna de níquel. Analice las fracciones eluidas de níquel, el lisado crudo, el lisado clarificado y el flujo a través de la columna de níquel mediante electroforesis SDS-PAGE y compárelo con la absorbancia UV a 280 nanómetros recopilada durante la purificación en columna.

Este paso determina si la purificación fue exitosa. Seleccione y reúna las fracciones que contienen la proteína diana para continuar con el procesamiento posterior. Calcule la cantidad total de proteína en esta etapa utilizando el coeficiente de extinción teórico de la proteína, midiendo la absorbancia UV a 280 nanómetros y teniendo en cuenta el volumen total de las fracciones reunidas.

Guarde una pequeña muestra para su análisis. El gen de la proteína diana se codificó con una secuencia específica, que es reconocida por la ULP uno como sitio de escisión; por lo tanto, la adición de la ULP uno provoca la escisión entre la etiqueta de histidina y la proteína de interés. Para comenzar este procedimiento, agregue un microlitro de proteasa similar a la ubiquitina, uno por cada cinco miligramos de proteína presente en las fracciones agrupadas.

En este punto, la proteína escindida se transfiere del tampón B al tampón A para su posterior procesamiento mediante tubo de diálisis, dializando la proteína frente a dos litros del tampón A durante cuatro horas a cuatro grados Celsius con agitación. Utilice un corte de peso molecular de 10 kilodalton para PB2 después de la diálisis. Corra otra gel de SDS-PAGE de la proteína diana con y sin ULP1 presente.

Esto determinará si la escisión por ULP una fue exitosa y permitirá la selección de las mejores fracciones para continuar con el procesamiento posterior. Aquí se muestran nuestros resultados representativos de una electroforesis SDS-PAGE para tres construcciones de la polimerasa pb. En la primera pista se encuentran dos marcadores de peso molecular de subunidades.

Las calles dos, seis y diez contienen proteínas agrupadas de columnas de níquel uno. Las calles tres, siete y once contienen el flujo de salida de la proteína escindida en tampón A procedente del níquel dos, y las calles cuatro, ocho y doce muestran la eliminación de la etiqueta de histidina en tampón B procedente del níquel dos.

Tras la eliminación de la histamina, se concentran las fracciones agrupadas del níquel dos. Para iniciar la CEC, debe elegirse nuevamente la resina adecuada en función del peso molecular del objetivo. En este caso, se utiliza una columna Acere S 110 over 30 GL, que se equilibra con 200 mililitros de tampón CEC a un flujo de 0,5 mililitros por minuto. Con una jeringa de cinco mililitros, cargue la muestra en un bucle de muestra de 10 mililitros e inicie la corrida en la columna de CEC. Monitoree el cromatograma de absorbancia UV a 280 nanómetros mientras recoge fracciones de pequeño volumen.

Realice todas las fracciones de SEC pertinentes mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). El enfoque estándar para los ensayos de cristalización de proteínas se lleva a cabo mediante el método de la gota sedimentada que implica difusión de vapor. No es raro establecer dos o más cribados matriciales dispersos desde el principio para cada proteína diana.

Para iniciar este proceso, rellene previamente cada depósito de una placa de cristalización compacta de 96 pocillos con 80 microlitros de cada condición del cribado de cristalización seleccionado; dispense 0,4 microlitros de proteína en tampón SEC en cada uno de los 96 pocillos. A continuación, añada 0,4 microlitros del cribado de cristalización, asegurando una mezcla completa de la gota en cada pocillo. Cubra toda la placa con cinta transparente para cristalización, asegurando un sellado completo en cada pocillo, y almacene la placa a 16 grados Celsius en un lugar sin perturbaciones y libre de vibraciones ambientales.

Revise periódicamente durante las próximas semanas la cristalización de la proteína bajo un microscopio estereoscópico. Si no aparecen cristales de proteína, prepare nuevas placas con diferentes condiciones y varíe la concentración de proteína en la gota final para aumentar la probabilidad de éxito antes de la cosecha. Enfríe una barquilla tipo ALS en un recipiente lleno de nitrógeno líquido y cúbrala con una tapa para comenzar la cosecha.

Corte la cinta transparente que cubre el pocillo con el cristal de proteína diana hacia un pocillo vacío cercano. Añada 1,6 microlitros de la condición de cristalización correspondiente y combínelos con 0,4 microlitros de etilenglicol. Una solución de etilenglicol al 20% en la condición de cristalización protege el cristal de proteína.

Durante la congelación criogénica, analice el cristal bajo el microscopio y seleccione un bucle criogénico adecuado para la cosecha, haciendo coincidir el diámetro interno del bucle con el ancho máximo del cristal. Fije el bucle criogénico a una varilla magnética para cristales y extraiga el cristal directamente de la solución del pocillo. Sumerja inmediatamente el bucle criogénico con el cristal cosechado en un crioprotector y luego sumérjalo en una placa tipo LS.

Para congelar rápidamente, repita el proceso de congelación rápida para un número deseado de cristales. Una vez finalizada la cosecha, utilice una varilla porta-puck para colocar una tapa magnética sobre el puck que contiene los cristales congelados rápidamente con lengüetas dobladas. Invierta el puck boca abajo para el siguiente paso.

Enrosque un empujador de disco en el disco, luego transfiera el disco al actor KU y úselo para perforar y retirar la tapa. Los cristales en el disco permanecen congelados en un baño de nitrógeno líquido hasta que estén listos para estudios de difracción de rayos X utilizando el software de adquisición de imágenes J Director. Configure los siguientes parámetros para el cribado de cristales: abertura del haz de 0,5 grados, distancia del detector de 50 milímetros, paso de imagen de 70 grados y duración de la exposición de 30 segundos.

Aquí se muestra una captura de pantalla de ejemplo del software de adquisición de imágenes mientras se examina un cristal; el panel central muestra la difracción de rayos X observada a partir de un cristal representativo, recolectando suficientes imágenes a alta resolución para obtener un conjunto completo de datos necesario para la determinación de la estructura tridimensional. Las estrategias de clonación y purificación de proteínas mostradas en este video dieron como resultado 14 muestras purificadas de PB dos, de las cuales nueve produjeron cristales adecuados para estudios de difracción. El conjunto de datos de difracción de rayos X obtenido en el laboratorio se recolectó en cinco de los nueve constructos con radiación QK alpha, utilizando un generador de rayos X con ánodo rotatorio Rigaku Super Bright FRE Plus, equipado con óptica Ossec VariMax HF y un detector CCD Saturn 944 Plus.

Se muestra aquí una imagen de difracción de rayos X de la subunidad PB2 de la polimerasa. Cada conjunto de datos fue procesado y se determinó un total de cuatro estructuras de la subunidad PB2. Cada estructura fue revisada por pares y cargada en la base de datos de proteínas para acceso público.

Esta figura muestra diagramas de cinta de las moléculas en la unidad asimétrica cristalográfica. De las cuatro estructuras de PB dos, las estructuras secundarias están coloreadas en un patrón de arcoíris con los códigos PDB correspondientes. En esta tabla se muestra el análisis de resultados para los objetivos de PB dos de la influenza mediante los métodos descritos en este artículo de video.

La tubería de procesamiento paralelo con múltiples objetivos para la determinación de la estructura a partir del gen se ilustra en cinco pasos: clonación, solubilidad, purificación, cristalización y determinación de la estructura. La salida de nuestra tubería de biología estructural no solo proporciona la base para investigaciones basadas en la estructura, sino que también alimenta estudios adicionales, como ensayos funcionales para confirmar la función de la proteína o cribado biofísico de compuestos novedosos mediante MAR o SPR para identificar nuevos puntos de partida para el desarrollo de fármacos. Esta técnica y las herramientas inventadas junto con ella han ayudado a allanar el camino para que los biólogos estructurales detecten muchos tipos de investigaciones basadas en descubrimientos, incluido el diseño de fármacos basado en estructuras, lo cual ha tenido un gran impacto en la salud humana y las enfermedades.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo el procesamiento paralelo de múltiples objetivos puede aumentar considerablemente el éxito de la determinación estructural. No olvide que trabajar en un laboratorio de biología estructural puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar las precauciones adecuadas, como el uso de EPP, al realizar actividades de laboratorio.