Un rápido de alto rendimiento para el método de asignación de Ribonucleoproteínas (RNP) de Derechos Humanos pre-mRNA

Para mapear los sitios de unión de las proteínas ribonucleares en los pre ARNm, comience por colocar en mosaico la región designada del NNA prem de interés en 30 ventanas de nucleótidos y sintetizar los oligonucleótidos en una matriz. Los oligonucleótidos se hierven de la matriz y se precipitan con un RNP de interés. El grupo inicial total se etiqueta con SCI tres y el grupo enlazado se etiqueta con SCI cinco, y ambos se aplican a la matriz de detección.

A continuación, se escanea la matriz y se utiliza el software de extracción de características para interpretar los resultados. Sales. Hola, soy Kate Watkins del laboratorio del hermano de Will Fair en el Departamento de MCB de la Universidad de Brown. Hoy les mostraré un procedimiento rápido y económico para determinar la ubicación precisa de un complejo de proteínas de ARN en el ARA prem en el laboratorio, rere sintetizar prem A como un grupo de oligonucleótidos superpuestos.

A continuación, este grupo puede separarse en una fracción ligada y no unida mediante coinmunoprecipitación y luego analizarse mediante un microarray. Si bien este procedimiento tiene muchas aplicaciones, lo usamos para estudiar múltiples factores de empalme y su papel y empalme alternativo. Así que comencemos.

Para comenzar este procedimiento, utilice el navegador de genomas uc SC para descargar genes particulares, uniones de empalme u otras áreas de interés a partir de las cuales diseñar el grupo de prem A. Seleccione las ventanas de interés, luego revíselas en mosaico computacionalmente con una longitud de lectura de 30 nucleótidos y una superposición de 20 nucleótidos para que cada oligo se desplace 10 nucleótidos del anterior. Ahora que los oligonucleótidos largos de 30 nucleótidos están definidos, flanquea cada uno con secuencias de cebadores universales.

Envíe los oligonucleótidos a Agilent para imprimirlos en un microarray de oligonucleótidos personalizado. Una vez que llegue el microarray, comience a recuperar los oligonucleótidos de ADN de su superficie colocando el portaobjetos de la cubierta del array en una cámara de hibridación del array y pipeteando suavemente 500 microlitros de agua desionizada en el portaobjetos. Coloque el portaobjetos de microarrays boca abajo encima del portaobjetos de la cubierta de modo que las etiquetas de cada portaobjetos estén enfrentadas entre sí y tenga cuidado de evitar burbujas de aire que puedan interrumpir el proceso de recuperación de oligonucleótidos.

Cierre la cámara de hibridación y gírela durante la noche a 99 grados centígrados en un horno de hibridación Al día siguiente, retire con cuidado la matriz de la cámara y extraiga el agua, que ahora contiene los oligonucleótidos liberados de la superficie de la matriz. Coloque el grupo de oligonucleótidos liberados en un tubo de einor de 1,5 mililitros y sonique para romper los grupos potenciales al 50% de amplitud tres veces durante pulsos de tres a cinco segundos cada vez. A continuación, amplifique el grupo mediante PCR de ciclo bajo utilizando cebadores universales con un promotor T adjunto a su extremo.

El número de ciclos necesarios puede variar en función de la eficiencia de la recuperación de oligonucleótidos. Evite la amplificación excesiva, que es visible como una banda manchada en un gel de acrilamida. Por último, utiliza el kit de script mega corto de Amon para transcribir el ARN.

Termina la reacción de transcripción mediante la extracción del fenilcloroformo del ARN, seguida de la precipitación de etanol utilizando acetato de sodio y también azul de glicoglico. Resus suspende el pellet de ARN en 105 microlitros de tampón TE. Para determinar con precisión la concentración del ARN.

Utilice ribo green para generar una curva estándar. A continuación, mida con un lector de placas de fluorescencia. El grupo de ARN ahora está listo para que la inmunoprecipitación de co comience la bajada.

En primer lugar, prepare las perlas magnéticas combinando perlas de dina de proteína A y proteína G en una proporción de uno a uno hasta un volumen final de 50 microlitros por reacción. Concentre las perlas en un solo lugar utilizando un soporte de separación magnético para eliminar el sobrenadante. A continuación, lavar dos veces con un volumen igual de agua fría un XPBS después del segundo lavado.

Resus, suspender las perlas en un volumen igual de frío uno XPBS y añadir dos nanogramos del anticuerpo perión. Esta cantidad puede variar dependiendo del anticuerpo, por lo que puede ser necesaria la experimentación para encontrar las condiciones óptimas para unir el anticuerpo a las perlas. Incubar la mezcla durante la noche a cuatro grados centígrados en una plataforma giratoria.

Por la mañana, agregue dos microgramos por reacción de ARN total de levadura sonicada para bloquear la unión inespecífica y gire durante 30 minutos adicionales a cuatro grados centígrados. Una vez realizado el paso de bloqueo, de nuevo, utilice la rejilla magnética para eliminar el sobrenadante. A continuación, lavar las perlas dos veces con un XPBS frío, dejando el PBS del segundo lavado en el tubo alícuota 50 microlitros de la mezcla de perlas en tubos nuevos.

Un tubo para cada reacción co IP. Las cuentas ya están listas para el co ip. A continuación, prepare la mezcla maestra combinando el grupo de oligonucleótidos de ARN con el extracto de células nucleares.

Como fuente de RNP, tome una alícuota de 50 microlitros de la mezcla maestra como protección total de la muestra. Se pueden agregar cebadores, que son versiones de ARN de los cebadores universales, para evitar la unión de proteínas a la secuencia del cebador o la introducción de una estructura secundaria al ARN. Para iniciar la coinmunoprecipitación, retire el sobrenadante de las alícuotas de las cuentas y vuelva a suspender las perlas en 120 microlitros de la mezcla maestra restante. Balancee las reacciones a cuatro grados centígrados durante una o dos horas.

Al final de la incubación, se puede retirar un pequeño Eloqua, incluidas las perlas, de cada co. Para pruebas adicionales de eficiencia de unión o especificidad, coloque el resto de las reacciones en el imán y retire el sobrenadante. A continuación, con uno o dos lavados con XPDS en frío.

El ARN unido al anticuerpo en las perlas a través del RNP es la muestra IP. Vuelva a suspender las perlas IP en 50 microlitros de 1%SDS en tampón 0.1 XTE y caliente las muestras a 65 grados centígrados durante 15 minutos. Para eluir el ARN, se retira el sobrenadante, que ahora contiene el ARN que anteriormente se unía a las perlas y se limpia mediante extracción con fenilcloroformo, seguido de una precipitación de etanol, resuspender el pellet en 50 microlitros de tampón 0,1 XT.

A continuación, transcriba las muestras utilizando los cebadores universales inversos. A continuación, la PCR amplifica las muestras con los cebadores universales, uno de los cuales debe contener un promotor T seven. El número de ciclos necesarios para amplificar el pool dependerá de la eficiencia de la coip.

Usando el kit de script mega shorts de ambion, transcriba las muestras de nuevo, pero esta vez agregue dos microlitros de UTP del alelo amino en lugar de la T seven UTP que viene con el kit. El alelo aminoallo UTP se utilizará más adelante para marcar el ARN con los ojos laterales. Cuando se complete la transcripción.

El extracto de fenilcloroformo y el etanol precipitan las muestras. No utilice azul de glico ni acetato de amonio, ya que pueden interferir con la hibridación de las muestras en la matriz. Resus suspende el pellet en 4,5 microlitros de carbonato de sodio 0,1 molar.

Para etiquetar primero las muestras, agregue 2,5 microlitros de agua libre de nucleasas a la muestra total. Agregue tres microlitros de S3 y a la muestra IP a tres microlitros de SCI cinco. Incubar en la oscuridad durante una hora.

A temperatura ambiente, finalice la reacción añadiendo seis microlitros de cuatro laminas molares de hidroxilamina HCL a cada muestra, mezcle bien y centrifuga. Incubar brevemente durante 15 minutos A temperatura ambiente, purifique las muestras marcadas mediante extracción con fenilcloroformo, seguida de precipitación con etanol. La mayor parte del color se arrastra hacia la fase orgánica con los nucleótidos libres, por lo que es posible que los gránulos no tengan un color visible.

Resus suspende cada pellet en 50 microlitros de 0.1 XTE. Siga las instrucciones del kit de hibridación de matrices de Agilent para preparar la muestra de microarrays con la siguiente excepción. No fragmente el ARN: Después de agregar el tampón de fragmentación, agregue inmediatamente el tampón de hibridación para detener la fragmentación.

Coloque las muestras en la matriz e hibrida a 50 grados Celsius durante tres horas mientras la matriz gira. Prepare las siguientes soluciones de 50 mililitros en tubos cónicos de 50 mililitros. Un tubo de dos tampones SC excedentes, dos tubos de un tampón marino excedente y un tubo de agua desionizada.

Después de las tres horas de incubación, desenganche con cuidado el sándwich de portaobjetos de la matriz y colóquelo en los dos tampones XSSC. Con un par de pinzas. Separe suavemente la matriz de la corredera de la cubierta.

Retire suavemente la corredera de la cubierta, teniendo cuidado de no tocar la matriz. A medida que se tira de la corredera, cierre la cónica e invierta suavemente durante 60 segundos. Con las pinzas, transfiera la matriz a una solución XSSC.

Tape el tubo e inviértalo suavemente durante un minuto. A continuación, transfiera la matriz a la segunda solución XSSC y, de nuevo, invierta suavemente durante un minuto más. Por último, transfiera la matriz al tubo de agua desionizada e invierta suavemente durante 30 segundos.

Seque la matriz colocando los bordes del portaobjetos en una toallita kim. Continúe girando la matriz en la toallita, asegurándose de no alterar el lado que contiene los oligonucleótidos. Coloque la matriz en un tubo cónico vacío y proceda a escanear la matriz.

Proceda a escanear la matriz. Aquí hay una matriz representativa. Cada característica u oligo se colorea en verde para el grupo total no enriquecido o en rojo para el grupo enriquecido con IP.

La señal en cada característica se normaliza a la intensidad total en ese canal. La salida final es la relación logarítmica del canal rojo sobre el canal verde. En cada característica de la matriz, la puntuación media en cada coordenada genómica se asigna a la ubicación dada.

Se proporciona una ilustración de este paso de promediación para tres oligonucleótidos de 30 nucleótidos superpuestos con puntuaciones de dos, cuatro y 0,5, donde se muestra la puntuación media de enriquecimiento para cada ventana de 10 nucleótidos. A continuación, se muestra un ejemplo de un esquema de unión para la proteína de unión PTB rastreada por poliperina en el gen CLTA, las características del gen se dan a lo largo de la parte inferior y las puntuaciones de enriquecimiento promedio logarítmica para la S unida a PTP se representan mediante barras verticales de color rojo oscuro. Las barras de color rojo claro muestran las áreas que no están enriquecidas para el enlace PTP.

Acabo de mostrarle cómo crear de manera rápida y eficiente un grupo de oligonucleótidos que agrupa en mosaico las regiones de interés, como los axones cortados alternativamente. Analizamos nuestros grupos por microarrays, pero también es posible secuenciarlos ya sea por secuenciación luminosa, Lexi o secuenciación Sanger más tradicional. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la creación del grupo está abierta a la modificación a nivel de ARN o proteína.

A nivel de ARN, podemos introducir regiones autólogas, mutaciones de enfermedades, polimorfismos o mutaciones aleatorias en la secuencia de oligonucleótidos. A nivel de proteína, el factor de unión al ARN puede modificarse mediante fosforilación u otras modificaciones postraduccionales. Además, el entorno de unión se puede manipular para aumentar o disminuir los niveles de factores adicionales que compiten o interactúan con la proteína de unión al ARN de interés.

Así que eso es todo. Gracias por mirar y buena suerte con tus experimentos.