Name: Reconocimiento de secuencia de ADN por ADN primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-10-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 4 s
Description: Aprende a analizar el reconocimiento de secuencias de ADN por primasa mediante perfiles de alto rendimiento. Este método combina microarrays de unión proteína-ADN con ensayos bioquímicos para correlacionar la eficiencia de unión con la actividad enzimática.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por la ISRAEL SCIENCE FOUNDATION (concesión No 1023/18).

1. Diseño de microarray
NOTA: Las sondas de ADN representan secuencias personalizadas de 36 nucleótidos, que consisten en el sitio de reconocimiento de la primasa de ADN T7 (GTC) situada entre dos regiones de flanqueo variables, seguidas de una secuencia constante de 24 nucleótidos aunada a una diapositiva de vidrio3. Usamos un formato de microarray de 4 x 180.000, que permitía la detección de cada secuencia de ADN en seis réplicas, distribuidas aleatoriamente en la diapositiva.
<ol><li>
Diseño de la biblioteca de ADN para primas con secuencias de reconocimiento conocidas
	<ol>
<li>Asegúrese de que cada secuencia esté compuesta por 60 nucleótidos. Mantenga constantes los primeros 24 nucleótidos (que se fijarán al portaobjetos de vidrio). Las regiones variables deben tener la siguiente forma general: (N)16GTC(N)17; donde N representa cualquier nucleótido deseado.</li>
		<li>Diseñar la región de flanqueo para abordar una cuestión científica específica (un ejemplo del diseño se presenta en el siguiente texto). Las regiones de flanqueo pueden diseñarse para contener entidades específicas, como los elementos repetidos o la simetría específica. NOTA: Hemos creado ocho categorías de diferentes secuencias de flanqueo compuestas por dos o tres nucleótidos específicos: T y G (grupo 1); T y C (grupo 2); C y A (grupo 3); A y G (grupo 4); G, C y T (grupo 5); C, T y A (grupo 6); G, A y T (grupo 7); G, A y C (grupo 8). Se diseñaron 2.000 secuencias diferentes para cada grupo. Cada grupo tenía subgrupos de secuencias con diferentes tipos y diferentes números de repeticiones de secuencia.</li>
		<li>Incluir un conjunto de secuencias de control negativas (que carecen del sitio de enlace específico)4. La presencia de estas secuencias permite validar la aparición de un enlace específico en el experimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diseño de la biblioteca de ADN para primas con secuencias de reconocimiento desconocidas
	<ol>
<li>Si se desconoce la secuencia de reconocimiento, cree la biblioteca de ADN seleccionando las secuencias (con o sin características específicas mencionadas anteriormente) del genoma del organismo deseado (bacterias, hongos, etc.).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diseño de la diapositiva de microarray
	<ol>
<li>Comprar diapositivas personalizadas (por ejemplo, 4x180K, AMADID #78366) de un proveedor comercial (para obtener más detalles, consulte Tabla de materiales). Ordene cada secuencia en seis réplicas, donde cada réplica debe adjuntarse a un punto seleccionado aleatoriamente en la diapositiva.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Experimento de unión al ADN de primas
NOTA: El día anterior (o al menos 2 h antes) del PBM, prepare la solución de bloqueo [2% p/v de leche desnatada en solución salina tampón de fosfato (PBS)] y revuelva en un agitador magnético. Antes de su uso, filtre la solución con un filtro de 0,45 M. Para detectar la unión de primas a las hebras de ADN, se deben realizar varios pasos en el siguiente orden.
<ol><li>Procedimiento de bloqueo
	<ol>
<li>Humedezca previamente la corredera de microarray en un frasco de Coplin con 0.01% v/v Triton X-100 en PBS (5 min a 125 rpm en un rotador de laboratorio).</li>
		<li>Lave brevemente el portaobjetos de la junta (también conocido como cubreobjetos) con agua y etanol y seque con aire comprimido.</li>
		<li>Montar la parte inferior de la cámara de hibridación de acero (cámara PBM) con la junta hacia arriba (etiqueta comercial hacia arriba). Para obtener más información sobre el ensamblaje, consulte la Tabla de materiales.</li>
		<li>Solución de bloqueo de pipetas (2% p/v de leche desnatada en PBS) en cada cámara.</li>
		<li>Retire la diapositiva de microarray del frasco de Coplin, luego seque el lado no ADN (el ADN debe estar en el mismo lado que la etiqueta de la empresa) y los bordes usando una toallita fina. Coloque lentamente el microarray en la corredera de la junta, evitando burbujas (etiqueta de la empresa hacia abajo). Montar y apretar inmediatamente el aparato de cámara de hibridación de acero. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente (RT).</li>
		<li>Llene un plato de tinción (el plato "PBS") con 800 ml de PBS fresco. Llene un segundo plato de tinción (el plato "WASH") con 800 ml de 0,5% v/v Tween-20 recién preparadoen en PBS.</li>
		<li>Desenrosque la cámara PBM y retire el "sándwich" de la micromatriz, teniendo cuidado de no romper el sello. Desmontarlo bajo el agua en el plato WASH colocando fórceps entre el portaobjetos y el cubreobjetos.</li>
		<li>Agitar el tobogán de microarray bajo el agua y transferir rápidamente a un frasco de Coplin.</li>
		<li>Lavar una vez con 0,1% v/v Tween-20 en PBS (5 min a 125 rpm en un rotador de laboratorio).</li>
		<li>Lavar una vez con 0.01% v/v Triton X-100 en PBS (2 min a 125 rpm en un rotador de laboratorio).</li>
		<li>Transfiera rápidamente la diapositiva a un frasco de Coplin que contenga PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>Unión a proteínas
	<ol>
<li>Montar la cámara PBM como se describió anteriormente (pasos 2.1.2–2.1.3).</li>
		<li>Mezcla de unión a proteínas de pipeta que contiene 5 -M T7 primas de ADN, 30 mM Tris-HCl pH 7,5, 6,5 mM MgCl2, 30 mM K-glutamato, 6 mM dithiothreitol (TDT), trifosfato de ribonucleósido de 65 m (rNTP), 2% con leche desnatada, albúmina sérica bovina de 100 ng/L (BSA), 50 ng/LL el salmón prueba el ADN, y 0.02% v/v Triton X-100 (TX-100) en cada cámara de la junta deslizante (sin tocar los lados de goma y sin introducir burbujas).</li>
		<li>Enjuague brevemente la diapositiva del microarray sumergiéndola en la placa PBS, que elimina el exceso de detergente de la superficie de los portaobjetos. Limpie las superficies que no son de ADN de la diapositiva con una toallita fina.</li>
		<li>Baje lentamente la corredera de microarray (hacia abajo) sobre la corredera de la junta, teniendo cuidado de evitar fugas de una cámara a otra. Montar y apretar inmediatamente el aparato de la cámara PBM sin introducir burbujas. Si las burbujas se forman, se pueden quitar tocando suavemente la cámara de acero contra una superficie dura.</li>
		<li>Incubar durante 30 min a temperatura ambiente (RT).</li>
	</ol></li>
	<li>Fijación de anticuerpos fluorescentes
	<ol>
<li>Desenrosque la cámara PBM y retire el "sándwich" de la micromatriz, teniendo cuidado de no romper el sello. Desmontar bajo el agua en el plato WASH usando fórceps. Agitar el portaobjetos bajo el agua y transferir rápidamente a un frasco de Coplin que contiene PBS.</li>
		<li>Montar la cámara PBM con la corredera de la junta como se describió anteriormente (pasos 2.1.2–2.1.3).</li>
		<li>Agregue el anticuerpo anti-his conjugado Alexa 488 (10 ng / L en el búfer de unión) a la diapositiva de la junta.</li>
		<li>Enjuague brevemente la diapositiva sumergiéndola en la placa PBS como antes, luego retire la diapositiva de PBS lentamente, limpie la superficie que no sea de ADN y colóquela hacia abajo sobre la diapositiva de la junta.</li>
		<li>Incubar 30 minutos a RT en la oscuridad (la sonda de fluorescencia es sensible a la luz) para reducir el fotoblanqueo.</li>
		<li>Desmontar la cámara PBM y cubrir se encuentra como antes, retirando la cubierta bajo el agua en el plato WASH.</li>
		<li>Enjuague brevemente las diapositivas sumergiéndolas en la placa PBS. Seque los portaobjetos con aire comprimido. Almacenar en la oscuridad en una caja de diapositivas hasta que esté listo para escanear.</li>
	</ol></li>
	<li>Escaneado de la diapositiva del microarray
	<ol>
<li>Escanee el chip utilizando un escáner de microarray (consulte la Tabla de Materiales)con excitación de 495 nm y una emisión de 519 nm y recoja la intensidad media de fluorescencia.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Análisis de datos de microarray
NOTA: Todo el procesamiento de datos se realizó utilizando scripts escritos personalizados en MATLAB.
<ol><li>Realice el procesamiento de datos PBM inicial utilizando Wilcoxon rank sum test p-value como se describió anteriormente4.</li>
	<li>Utilice el valor medio de la intensidad de unión para cada secuencia de ADN para su posterior análisis.</li>
	<li>A continuación, utilizando los valores p de ANOVA unidireccionales, compare la significación estadística de las diferencias observadas en las intensidades de unión primas-ADN obtenidas para diferentes grupos de sondas de ADN, como se explica anteriormente en la sección3del diseño de la biblioteca de ADN.</li>
</ol>4. Síntesis de ARN dirigida por plantillas catalizada por t7 ADN primase
<ol><li>Preparación del gel de poliacrilamida desnaturalizante<ol>
<li>Para preparar 100 ml de mezcla de gel, Combinar 62,5 ml de 40% acrilamida-bisacrilamida (19:1), 42 g de urea, 1,1 g de base Tris (2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanediol), 0,55 g de ácido bórico y 0,4 ml de 0,5 M de ácido etilendiaminetetraacetic (EDTA).</li>
		<li>Divida la mezcla en alícuotas de 14 ml (la cantidad necesaria para un gel de 16,5 cm x 26 cm x 0,03 cm) y manténgala protegida de la luz a 4 oC durante un máximo de 1 mes.</li>
		<li>Para preparar un gel de poliacrilamida desnaturalizante, añadir 4 ml de TEMED y 40 ml de persulfato de amonio de 10% p/v a 14 ml de la mezcla previamente preparada, fundirlo y dejarlo polimerizar durante al menos 2 horas a RT. El gel se puede conservar durante un día a 4oC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparación de muestras NOTA: Mantenga los reactivos, la mezcla de reacción y las muestras sobre hielo.<ol>
<li>Para preparar la mezcla de reacción necesaria para diez reacciones, combine 11 ml de tampón de actividad de 5x (200 mM Tris-HCl, pH a 7,5; ditiothreitol de 50 mM, glutamato de potasio de 250 mM, 50 mM De MgCl2), 5,5 ml de mezcla de 2,5 mM de trifosfato de nucleótido (NTP) y 5,5 ol de ribonucleótido radiomarcado [p. ej., ATP, (-32P) 3000 Ci/mmol]. NOTA: Todas las cantidades se han aumentado en un 10% debido a posibles errores de pipeteo. Los ribonucleótidos radiomarcados deben diluirse de acuerdo con la fuerza de la señal radiactiva (la dilución inicial suele ser 1:10 o más).</li>
		<li>Transfiera 2 l de la mezcla de reacción a diez tubos PCR.</li>
		<li>Añadir 1 l de plantilla de ADN de 100 m al tubo de PCR correspondiente y girar hacia abajo.</li>
		<li>Añadir 2 s de 16 m de primas de ADN T7, girar hacia abajo, mezclar suavemente y girar hacia abajo de nuevo.</li>
		<li>Incubar la reacción a RT durante 20 min.</li>
		<li>Detenga la reacción añadiendo 5 l de solución de temple (95% formamida, 20 mM EDTA, 0.05% p/v xileno ciano y bromofenol azul), mezclar y girar hacia abajo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Separación de productos de ARN por electroforesis mediante gel de poliacrilamida desnaturalizante y posterior detección de señal<ol>
<li>Pre-ejecutar el gel durante 1 h (10 mA, 600 V) en 1 tampón TBE (90 mM Tris-borate, 2 mM EDTA).</li>
		<li>Cargue hasta 2 ml de cada muestra y realice electroforesis (20 mA, 1100 V) en 1 tampón TBE (90 mM de trisborato, 2 mM EDTA).</li>
		<li>Secar el gel durante 2 h a 80oC bajo el vacío.</li>
		<li>Exponga la placa de imágenes de fósforo a gel radiactivo durante unas horas hasta la noche, dependiendo de la fuerza de la señal radiactiva.</li>
		<li>Registre la señal (luminiscencia fotoestimulada) utilizando fosforimager (ver Tabla de Materiales).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+binding+microarrays+%28PBMs%29+for+rapid%2C+high-throughput+characterization+of+the+sequence+specificities+of+DNA+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein binding microarrays (PBMs) for rapid, high-throughput characterization of the sequence specificities of DNA binding proteins.</a> Methods in Molecular Biology. 338, 245-260 (2006).</li>
<li>Berger, M. F., Bulyk, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+protein-binding+microarrays+for+the+comprehensive+characterization+of+the+DNA-binding+specificities+of+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Universal protein-binding microarrays for the comprehensive characterization of the DNA-binding specificities of transcription factors.</a> Nature Protocols. 4 (3), 393-411 (2009).</li>
<li>Afek, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+Sequence+Context+Controls+the+Binding+and+Processivity+of+the+T7+DNA+Primase%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">DNA Sequence Context Controls the Binding and Processivity of the T7 DNA Primase.</a> iScience. 2, 141-147 (2018).</li>
<li>Afek, A., Schipper, J. L., Horton, J., Gordan, R., Lukatsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-DNA+binding+in+the+absence+of+specific+base-pair+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationaly+Academy+of+Sciences+of+the+Unitet+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Protein-DNA binding in the absence of specific base-pair recognition.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 111 (48), 17140-17145 (2014).</li>
<li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+bacteriophage+T7+gene+4+primase+with+its+template+recognition+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interaction of bacteriophage T7 gene 4 primase with its template recognition site.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (50), 35889-35898 (1999).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Template+recognition+sequence+for+RNA+primer+synthesis+by+gene+4+protein+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Nationaly+Academy+of+Sciences+of+the+Unitet+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Template recognition sequence for RNA primer synthesis by gene 4 protein of bacteriophage T7.</a> Proceedings of the Nationaly Academy of Sciences of the Unitet States of America. 78 (1), 205-209 (1981).</li>
<li>Fried, M., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equilibria+and+kinetics+of+lac+repressor-operator+interactions+by+polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Nucleic Acids Research. 9 (23), 6505-6525 (1981).</li>
<li>Galas, D. J., Schmitz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNAse+footprinting%3A+a+simple+method+for+the+detection+of+protein-DNA+binding+specificity%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">DNAse footprinting: a simple method for the detection of protein-DNA binding specificity.</a> Nucleic Acids Research. 5 (9), 3157-3170 (1978).</li>
<li>Jost, J. P., Munch, O., Andersson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+protein-DNA+interactions+by+surface+plasmon+resonance+%28real+time+kinetics%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Study of protein-DNA interactions by surface plasmon resonance (real time kinetics).</a> Nucleic Acids Research. 19 (10), 2788(1991).</li>
<li>Bowen, B., Steinberg, J., Laemmli, U. K., Weintraub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+detection+of+DNA-binding+proteins+by+protein+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">The detection of DNA-binding proteins by protein blotting.</a> Nucleic Acids Research. 8 (1), 1-20 (1980).</li>
<li>Oliphant, A. R., Brandl, C. J., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+sequence+specificity+of+DNA-binding+proteins+by+selecting+binding+sites+from+random-sequence+oligonucleotides%3A+analysis+of+yeast+GCN4+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Defining the sequence specificity of DNA-binding proteins by selecting binding sites from random-sequence oligonucleotides: analysis of yeast GCN4 protein.</a> Molecular Cell Biology. 9 (7), 2944-2949 (1989).</li>
<li>Marmorstein, R., Fitzgerald, M. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+DNA-binding+domains+for+sequence-specific+DNA+recognition%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Modulation of DNA-binding domains for sequence-specific DNA recognition.</a> Gene. 304, 1-12 (2003).</li>
</ol>

Los autores no declaran conflicto de intereses.

El método PBM se ha utilizado ampliamente para investigar las propiedades de unión de los factores de transcripción y también se puede aplicar a enzimas de procesamiento de ADN, como la primasa del ADN, que se unen al ADN con baja afinidad. Sin embargo, se requieren ciertas modificaciones de los procedimientos experimentales. El experimento de microarray implica varios pasos: diseño de la biblioteca de ADN, preparación del chip, unión de la diana proteica, etiquetado fluorescente y escaneo. Los pasos de lavado leves son ...

HTPP hace uso de la tecnología de microarray de unión al ADN combinada con el análisis bioquímico(Figura 1) para identificar estadísticamente características específicas de las plantillas de ADN que afectan a la actividad enzimática de la primasa del ADN. Por lo tanto, HTPP proporciona una plataforma tecnológica que facilita un salto de conocimiento en el campo. Las herramientas clásicas utilizadas para determinar sitios de reconocimiento de primas no tienen la capacidad de producir una gran cantidad de datos, mientras que HTPP sí.
PBM es una técnica utilizada rutinariamente para determinar las preferencias de unión de los factores de transcripción al ADN1,2; sin embargo, no es adecuado para la detección de la unión débil / transitoria de proteínas al ADN. A diferencia del PBM universal que proporciona información sobre la especificidad media de unión a proteínas a todas las secuencias posibles que consisten en ocho pares de base, HTPP se basa en la biblioteca de plantillas de ADN de una sola cadena que comprende elementos de secuencia únicos. Estos elementos de secuencia de ADN implican decenas de miles de secuencias genómicas cortas (pocas decenas de bp), así como secuencias de ADN diseñadas computacionalmente enriquecidas en ciertos elementos de secuencia repetitiva de ADN presentes en el genoma, que poseen diferentes contenidos promedio de GC . Este enfoque de alto rendimiento permite determinar, de forma sistemática, cuantitativa y basada en hipótesis, las propiedades relacionadas con la secuencia que son importantes para la unión de primas y su actividad enzimática3. En particular, se ha identificado el importante vínculo entre las preferencias de unión a primas-ADN (moduladas por secuencias de ADN que flanquean sitios específicos de unión a trinucleótidos) y la procesatividad de la primas para este sistema enzimático4.
La nueva tecnología se aplicó para revisar nuestra comprensión de los sitios de reconocimiento de primas, incluso para la primasa de ADN T7 que ha sido ampliamente estudiada5. Específicamente, el reexamen de conceptos clásicos, como los sitios de reconocimiento de ADN de la primasa tensa T7 (que se determinaron hace casi cuatro décadas 6) utilizando microarray de unión a proteínas y ADN (PBM) ha dado lugar a una visión sin precedentes de las características relacionadas con la secuencia de flanqueo de estos sitios de reconocimiento3. Se esperaba que las secuencias que flanquean el sitio de reconocimiento de trinucleótidos de t7 ADN primas (5'-GTC-3') sean aleatorios. En su lugar, encontramos que las secuencias de flanqueo ricas en TG aumentan las posibilidades de que la primasa de ADN T7 sintete imprimaciones de ARN más largas que indiquen un aumento en la procesabilidad.
Otros métodos que se pueden utilizar para estudiar las propiedades de unión al ADN de las proteínas in vitro incluyen el ensayo de cambio de movilidad electroforética (EMSA)7, DNase I huella8, resonancia de plán (SPR)9, y hincha del sudoeste 10. Sin embargo, estos son métodos de bajo rendimiento sólo aplicables a la investigación de un pequeño número de secuencias de ADN. Además, la precisión y sensibilidad de algunas de estas técnicas (por ejemplo, EMSA) es baja. Por otro lado, la selección in vitro11 es una técnica que, de forma similar a PBM, puede utilizarse para la identificación de numerosas secuencias de unión. Sin embargo, las secuencias de baja afinidad generalmente se excluyen en la mayoría de las aplicaciones de selección in vitro; por lo tanto, este enfoque no es adecuado para obtener datos vinculantes comparativos para todas las secuencias disponibles. El PBM1universal,2 se utiliza principalmente para caracterizar las especificidades vinculantes de los factores de transcripción de prokaryotes y eucariotas, así como factores específicos (por ejemplo, presencia de ciertos ligandos, cofactores, etc.) que pueden afectan a esta interacción12.
HTPP expande la aplicación PBM a las enzimas de procesamiento de ADN mediante la combinación de potencia estadística de alto rendimiento sin precedentes con alta precisión para proporcionar información sobre el contexto de secuencia de enlace. Estos datos aún no se han obtenido para los primas y enzimas relacionadas (que tienen una unión débil/transitoria al ADN) debido a las limitaciones técnicas antes mencionadas de otras técnicas disponibles.

<table><tbody><tr><td>Solución de acrilamida-bisacrilamida al 40% (19:1)</td><td>Merck</td><td>1006401000</td><td></td></tr><tr><td>formamida al 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9037-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-anticuerpo anti-his conjugado</td><td>Qiagen</td><td>35310</td><td></td></tr><tr><td>Persulfato de amonio (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-100G</td><td></td></tr><tr><td>ATP, [&alpha;-32P] &ndash; 3000 Ci/mmol</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td>NEG003H250UC</tr><tr><td>Ácido bórico, granulado</td><td>Glentham Life Sciences</td><td>GE4425</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Roche</td><td>10735094001</td><td></td></tr><tr><td>Azul de bromofenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0126-25G</td><td></td></tr><tr><td>Tarro</td><td></td><td></td><td></td>Coplin</tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-25G</td><td></td></tr><tr><td>ADN microarray</td><td>Agilent</td><td></td><td>4x180K (AMADID #78366) https://www.agilent.com</td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Acros Organics</td><td>AC118430010</td><td></td></tr><tr><td>Fujifilm FLA-5100 Fosforidigitador</td><td>FUJIFILM Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glass gradilla de tinción de portaobjetos</td><td>Thermo Scientific</td><td>12869995</td><td>Si se utilizan varios portaobjetos</td></tr><tr><td>Rotador</td> <td>de laboratorioThermo Scientific</td><td>88880025 Cloruro</td><td></td></tr><tr><td>de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63064-500G</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de hibridación de microarrays</td><td>Agilent</td><td>G2534A</td><td>https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2534-90004_HybridizationChamber_User.pdf</td></tr><tr><td>Escáner de microarrays (GenePix 4400A)</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Glutamato de potasio</td><td>Alfa Aesar</td><td>A172232</td><td></td></tr><tr><td>Mezcla de solución de ribonucleótidos (rNTPs)</td><td>New England BioLabs</td><td>N0466S</td><td></td></tr><tr><td>ADN de testículos de salmón</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1626-1G</td><td></td></tr><tr><td>Leche desnatada en polvo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>70166-500G</td><td></td></tr><tr><td>Plato de tinción</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td>12657696</tr><tr><td>Tetrametiletilendiamina (TEMED)</td><td>Bio-Rad</td><td>1610800</td><td></td></tr><tr><td>Tris base (2-Amino-2-(hidroximetil)-1,3-propanodiol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362-500G</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U6504-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Xileno cianol</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21530</td><td></td></tr></tbody></table>

reconocimiento de secuencia de adn por adn primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento

DNA Sequence Recognition by DNA Primase Using High-Throughput Primase Profiling

DNA primase sintetiza imprimaciones cortas de ARN que inician la síntesis de ADN de fragmentos de Okazaki en la hebra rezagada por ADN polimerasa durante la replicación del ADN. La unión de primas procariotas similares a DnaG al ADN se produce en una secuencia de reconocimiento de trinucleótidos específica. Es un paso fundamental en la formación de fragmentos de Okazaki. Las herramientas bioquímicas convencionales que se utilizan para determinar la secuencia de reconocimiento de ADN de la primasa del ADN proporcionan sólo información limitada. Utilizando un ensayo de unión basado en microarrays de alto rendimiento y análisis bioquímicos consecutivos, se ha demostrado que 1) el contexto de unión específico (secuencias de flanqueo del sitio de reconocimiento) influye en la fuerza de unión de la primasa de ADN a su plantilla EL ADN, y 2) la unión más fuerte de la primasa al ADN produce imprimaciones de ARN más largas, lo que indica una mayor procesatividad de la enzima. Este método combina el ensayo de actividad de PBM y primase y se designa como perfilado de primas de alto rendimiento (HTPP), y permite la caracterización del reconocimiento de secuencia específica por primas aganlos en un tiempo y escalabilidad sin precedentes.

Este avance tecnológico para el mapeo de los sitios de unión de primas permite la obtención de propiedades de unión al ADN que son difíciles, si no imposibles, de observar utilizando herramientas clásicas. Más importante aún, HTPP permite la revisión de la comprensión tradicional de los sitios de encuadernación de primas. Específicamente, HTPP revela especificidades de unión además de conocidas 5 '-GTC-3' secuencias de reconocimiento, que conduce a cambios en las actividades funcionales d...

Los experimentos de microarray de unión a proteínas (PBM) combinados con ensayos bioquímicos vinculan las propiedades lácteas y catalíticas de la primasa de ADN, una enzima que sintetiza los imprimadores de ARN en el ADN de la plantilla. Este método, designado como perfilado de primas de alto rendimiento (HTPP), se puede utilizar para revelar patrones de unión al ADN de una variedad de enzimas.

Reconocimiento de secuencia de ADN por ADN primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento

DNA primase synthesizes short RNA primers that initiate DNA synthesis of Okazaki fragments on the lagging strand by DNA polymerase during DNA replication. ...

Este protocolo describe la recopilación de datos masivos de microarray de unión proteína-ADN para primasa, una enzima que se une transitoriamente a secuencias de ADN específicas y a su vez cataliza la formación de imprimaciones de ARN. Este video cubrirá cómo la tecnología de microarray puede ayudar a redefinir los sitios de reconocimiento de secuencias de primasa y cómo un enfoque de alto rendimiento puede complementar la bioquímica clásica. Esta técnica combina dos enfoques: microarray de unión al ADN de primasa y ensayo de actividad de primasa.El microarray proporciona datos masivos de unión de primasa a secuencias de ADN, donde como el ensayo bioquímico proporciona información sobre la formación de imprimación de ARN por primasa de ADN. La actividad enzimática probada depende de la información del experimento de microarray y de su menor rendimiento en su naturaleza. Se sondea el vínculo entre la eficiencia de la unión, la selección de la secuencia de ADN y la actividad de la enzima.La identificación de la determinación de la secuencia mediante microarray, nos permite sacar conclusiones precisas basadas en datos masivos del microarray. Este enfoque se ha utilizado hasta ahora para describir secuencias de unión de ADN de factores de transcripción. Los factores de transcripción son proteínas estáticas que se unen estrechamente al ADN.Demostrar el procedimiento será Stefan Ilic. Para comenzar este procedimiento, humedezca previamente la diapositiva del microarray colocándola en un frasco de coplina que contenga 0,01%Triton-X 100. Y girando sobre un rotador de laboratorio, agregue 125 rpm durante cinco minutos.Pipetear la solución de bloqueo en una caja de plástico. A continuación, retire la diapositiva de microarray del frasco de coplina. Utilice una toallita fina para conducir el lado no ADN y los bordes de la diapositiva.Coloque lentamente el microbarra en la caja de plástico. Incubar a temperatura ambiente durante una hora con agitación lenta. Después de esto, lave el portaobjetos una vez con 0.01%Tween-20 en PBS.En un rotador de laboratorio a 125 rpm durante cinco minutos. Retire el Tween-20 y enjuague el portaobjetos una vez con 0.01%Triton-X 100 en PBS en un rotador de laboratorio a 125 rpm durante dos minutos. A continuación, transfiera rápidamente la diapositiva a un frasco de coplina que contenga PBS.En primer lugar, monte la cámara PMB como se describe en el protocolo de texto. Coloque la diapositiva en el espacio designado. Usa pinzas para empujarla hacia abajo y hacia la izquierda.Coloque la junta de silicio en la parte superior, asegurándose de que esté bien alineada con la parte inferior de la cámara PBM. A continuación, cierre la cámara y apriete los tornillos diagonalmente. Pipetear la mezcla de unión a proteínas en cada pozo de la junta.Luego, incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para comenzar, pipetear 0.05%Tween-20 en PBS en la cámara PBM para lavar brevemente el portaobjetos. Con un aspirador de vacío, retire la solución de los pozos de la cámara teniendo cuidado de no tocar las manchas de ADN.Repita esto, lave brevemente el portaobjetos con PBS. Y utilice el vacío para extraer la solución de los pozos de la cámara mientras tenga cuidado de no tocar las manchas de ADN. A continuación, agregue Alexa 488 conjugado anti-Su Anticuerpo a cada pozo de la cámara PBM.Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de esto, lave brevemente el portaobjetos dentro de la cámara PBM añadiendo unas gotas de 0.05%Tween-20 en PBS en cada pozo. Y utilice el aspirador de vacío para eliminar la solución de los pozos de la cámara, teniendo cuidado de no tocar las manchas de ADN.Desmonte la cámara PBM y retire la corredera. Enjuague los portaobjetos dos veces en 0.05%Tween-20 en PBS, con cada enjuagar durante tres minutos. Luego, enjuague los portaobjetos dos veces en PBS, con cada enjuagar durante tres minutos cada uno.Y una vez en agua destilada doble durante tres minutos. Seque los portaobjetos con aire comprimido. Y guárdelos en una caja deslizante oscura hasta que estén listos para escanear.Cuando esté listo, utilice un escáner de microarray para escanear el chip con una excitación de 495 nanómetros y una emisión de 19 nanómetros. Y recoger la intensidad de fluorescencia media. En este estudio pi rendimiento de perfiles de primasa se utiliza para asignar los sitios de enlace de primasa, incluidos aquellos que son difíciles si no imposibles de observar utilizando herramientas clásicas.Es importante destacar que la generación de perfiles de primasa de rendimiento pi permite revisar la comprensión tradicional de los sitios de enlace de primasa. Especialmente pi throughput primasse profiling revela especificidades vinculantes además de las secuencias de reconocimiento 5'GTC3', que conduce a cambios en las actividades funcionales de la primasa de ADN T7. A saber, se identifican dos grupos de secuencias.Secuencias de ADN de unión fuertes que contenían TG en los flancos y secuencias de ADN de unión débiles que contenían AG en los flancos. No se detectó ningún enlace de primasa a las plantillas de ADN que faltaban 5'GTC3'dentro de sus secuencias. Los sitios de reconocimiento de ADN de primasa que contiene características específicas como flancos ricos en TG, aumentan la unión de ADN de primasa hasta 10 veces.Sorprendentemente, también aumentan la longitud del ARN recién formado. Es importante destacar que el perfilado de primasa de alto rendimiento nos permite observar y cuantificar la variabilidad en la longitud de imprimación en relación con la secuencia de la plantilla de ADN. Al realizar este procedimiento, los pasos de lavado deben ser sutiles.Y los buffers deben contener componentes que registraron la primasa en el ADN. También se determina bioquímicamente un umbral de eventos de unión inútiles. Por lo tanto, el análisis de la microarray es insuficiente.Métodos como una resonancia plasmática superficial y ensayos de desplazamiento de gel pueden determinar la afinidad de unión de la primasa para seleccionar las secuencias de ADN. Mi laboratorio implementa modelos de predicción de aprendizaje automático para detectar determinantes de secuencia de primasa que producen imprimaciones productivas que pueden ser extendidas por la polimerasa del ADN. En la era del big data, una implementación de métodos estadísticos para analizar big data, la técnica definitivamente ayudará a caracterizar mejor las secuencias de ADN específicas y vincular el reconocimiento de secuencias a la actividad de la primasa.Cualquier persona que trabaje con radiación debe tener una comprensión exhaustiva de las regulaciones y los peligros asociados con el uso de radiación ionizante. Debe someterse a capacitación y debe trabajar con equipos de seguridad.

dna-sequence-recognition-dna-primase-using-high-throughput-primase

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Se presenta un método de recuperación de antiguos dirigidos secuencia de ADN, que se utiliza para reconstruir el genoma mitocondrial completo de cinco individuos neandertales. La comparación de estas secuencias con los seres humanos actuales sugieren que los neandertales tenían una baja capacidad a largo plazo efectivo de la población.

Primer captura Extensión: Secuencia de recuperación selectiva de las fuentes de ADN muy degradado

Este video muestra la reacción en cadena de la polimerasa en gradiente para la optimización de la temperatura de recocido de los cebadores, que establece la temperatura de recocido en gradiente a lo largo de los pocillos. El efecto de las diferentes temperaturas de recocido está determinado por el rendimiento de los productos amplificados que ayuda a optimizar la condición de reacción.

Reacción en cadena de la polimerasa en gradiente para determinar la temperatura óptima de recocido

De alto rendimiento selectiva 2 'acilación hidroxilo analizados por extensión del cebador (FORMA) utiliza un software de predicción de estructura secundaria de producto químico nuevo sondeo de la tecnología, la transcripción inversa, electroforesis capilar y para determinar las estructuras de ARN de varios cientos a varios miles de nucleótidos en una sola resolución de nucleótidos.

ARN de predicción de estructura secundaria Utilizando SHAPE de alto rendimiento

Pirosecuenciación es una técnica versátil que facilita la secuenciación del genoma microbiano que se puede utilizar para identificar las especies bacterianas, discriminar las cepas bacterianas, y detectar las mutaciones genéticas que confieren resistencia a los agentes anti-microbianos. En este vídeo, se demostrará el procedimiento para la generación de amplicón microbiana, amplicón pirosecuenciación, y el análisis de secuencia de ADN.

Pyrosequencing para la identificación microbiana y caracterización

Describimos aquí un método de extensión de cebadores basado en fluorescencia para determinar los puntos de partida transcripcionales a partir de transcripciones bacterianas y el procesamiento de ARN in vivo utilizando un secuenciador de gel automatizado.

Fluorescencia Basado Técnica de extensión del cebador para determinar la transcripción puntos de partida y los sitios de escisión de RNasas En Vivo

Se describe en este documento un ensayo mediante el acoplamiento de identificación de ADN metiltransferasa adenina (DamID) a alto rendimiento de secuenciación (DamID-ss). Este método mejorado proporciona una mayor resolución y un rango dinámico más amplio, y permite el análisis de datos DamID-Seq en conjunción con otros datos de secuenciación de alto rendimiento tales como chip-ss, RNA-Seq, etc.

-DamID siguientes: Genoma de toda la cartografía de la proteína-ADN Interacciones de alto rendimiento de secuenciación de fragmentos de ADN adenina-metilado

El propósito de este protocolo es utilizar una combinación de computacional y de investigación del Banco para buscar nuevas secuencias que no se puede separar fácilmente de una secuencia Co purificador, que puede ser conocida sólo parcialmente.

Nueva secuencia descubrimiento por la genómica sustractivo

El protocolo proporciona instrucciones para modificar el ARN con sulfato de dimetilo para experimentos de perfiles mutacionales. Incluye sondeo in vitro e in vivo con dos métodos alternativos de preparación de bibliotecas.

Sondeo de la estructura del ARN con perfil mutacional de sulfato de dimetilo con secuenciación in vitro y en células

Las nanomáquinas basadas en DNAzyme se pueden utilizar para la detección altamente selectiva y sensible de ácidos nucleicos. Este artículo describe un protocolo detallado para el diseño de nanomáquinas basadas en DNAzyme con un núcleo 10-23 utilizando software libre y su aplicación en la detección de un fragmento de virus de Epstein-Barr como ejemplo.

DNAzyme 10-23 - Nanomáquinas basadas en el reconocimiento de ácidos nucleicos

El enriquecimiento y secuenciación del ADN naciente asociado a proteínas (eSPAN) se desarrolló para detectar la abundancia relativa de una proteína asociada a la cromatina en dos cadenas de ADN replicantes, revelando así una visión molecular sobre la replicación de la cromatina y sus procesos acoplados. Este protocolo describe los procedimientos eSPAN en células madre embrionarias (ES) de levaduras y ratones.

Análisis específico de hebras de proteínas en cadenas replicantes de ADN mediante el enriquecimiento y secuenciación del método de ADN naciente asociado a proteínas

Aprende a analizar el reconocimiento de secuencias de ADN por primasa mediante perfiles de alto rendimiento. Este método combina microarrays de unión proteína-ADN con ensayos bioquímicos para correlacionar la eficiencia de unión con la actividad enzimática.

Reconocimiento de secuencia de ADN por ADN primas mediante perfiles de primas de alto rendimiento

Explorar más videos