Name: Un dispositivo de microfluidos para el estudio de varias cepas distintas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Aprende a fabricar un dispositivo microfluídico de dos capas para estudiar múltiples cepas de levadura simultáneamente bajo condiciones dinámicas idénticas sin riesgo de contaminación cruzada.

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YG es apoyado por una beca del BID. IN es un tipo Alon y miembro de la facultad ‭ Edmond J. ‬ Safra Centro de Bioinformática de la Universidad de Tel Aviv ‭. ‬ Esta investigación fue apoyada por la ISF beca 1499/10.

1. Creación de un Master cinta Scotch-5 <ol><li> Dibujar o imprimir diseño deseado microcanal, a escala, en el papel. En nuestro caso, el diseño se compone de dos canales en forma de Y, cada uno de 3 mm de ancho (Figura 2). </li><li> Cubra un portaobjetos de vidrio con capas de cinta adhesiva. El número de capas determinará la altura del canal (alrededor de 60 micras por capa). Utilizamos tres capas de cinta scotch. </li><li> Coloque el esquema de trazado sobre una superficie plana. Alinear a la diapositiva en el patrón de diseño. Cortar cuidadosamente la cinta adhesiva en el portaobjetos de vidrio con un bisturí de acuerdo con el diseño. </li><li> Retire la cinta Scotch de todas las regiones de la lámina de vidrio, excepto aquellos en el diseño del microcanal. </li><li> Colocar el portaobjetos en un horno de calentamiento a 65 ° C durante 2-3 min. Limpie suavemente con etanol. </li></ol> 2. Fabricar un dispositivo microfluídico de PDMS <ol><li> Mezclar la base y componentes de curado de PDMS como se recomienda por el fabricante. Utilizamos una mezcla 10:1relación de base a agente de curado. Verter aproximadamente 30 ml de mezcla de PDMS en una placa Petri a una altura de ~ 0,5 cm. Desgasificar el PDMS en el vacío si es necesario. Sumerja el portaobjetos en el PDMS con la cinta Scotch estampado mirando hacia arriba. La colocación del patrón después de que el PDMS evita la formación de burbujas de aire entre la corredera y fondo del plato. Curar durante 48 horas a 65 ° C, lo que hace que la antena es horizontal utilizando un nivel de burbuja. </li><li> En una nueva placa de Petri 90 mm vierta 3 ml de mezcla de PDMS, resultando en una capa de aproximadamente 0,5 mm de profundidad. (Si una recubridora de rotación está disponible, se puede utilizar para esta etapa). </li><li> Degas y curar como en 2.1. </li><li> Suavemente cortar el dispositivo de microfluidos al tamaño deseado con un escalpelo. Esta capa se denomina la &quot;capa de flujo&quot;. </li><li> Cortar un trozo de tamaño similar de capa delgada PDMS de la segunda placa de Petri. Esto se denomina &quot;capa de pozos&quot;. </li><li> Utilice un golpeador biopsia de tamaño apropiado (Usamos 1,2 mm ID) para perforar agujeros para las entradas y salidas en la capa de flujo. </li&gt; <li> Coloque la capa de pozos en un portaobjetos de vidrio de espesor sobre la disposición de diseño y rompa los pozos, utilizando 2 mm ID golpeador biopsia, en alineación con los microcanales de la presentación. </li><li> Limpiar ambas capas de PDMS, así como un 24 mm x 60 mm cubreobjetos de vidrio con etanol. Seque y mantener limpio. </li><li> Plasma tratar tanto el cubreobjetos de vidrio y la capa de PDMS pozos utilizando estándar grabador de plasma (por no reversible bonding) o un tratador corona de mano 6 para la unión reversible. Colocar con cuidado la capa de pozos en la parte superior del cubreobjetos para causar la adhesión (Figura 3). Frote suavemente las burbujas de aire (si es necesario). </li></ol> 3. Celular Experimento de imágenes <ol><li> Asegúrese de tener listo el soporte deseado en jeringas apropiadas conectados a tubos de plástico flexible con un diámetro interno de 0,02 &quot;(Tygon) en la bomba de jeringa. </li><li> Crecer S. cerevisiae a la fase deseada en YPD líquido. Vortex a fondo y el lugar 300 μl de cada cepa en un tubo de microcentrífuga. </li><li> Coloque suavemente 1 l de Concanavalina A (Sigma) 2 mg / ml en cada pocillo. Lavar el exceso de Concanavalina A partir de cada pocillo dos veces con cuidado pipeteando agua. </li><li> Mientras que la Concanavalina A se está secando, lavar dos veces con 300 cepas l de medio SC falta de glucosa. Lavadora glucosa residual de las paredes celulares ayuda a la adherencia adecuada a la concanavalina A. </li><li> Células Vortex a fondo. Pipetear 0,75 l o menos de cada suspensión de células en su propio pozo (Figura 3). Lave suavemente a las células residuales con medio rico. Los siguientes dos pasos deben realizarse rápidamente a fin de evitar que las células se seque. </li><li> Plasma tratar el chip y los pozos de fondo con el tratador corona de mano, teniendo cuidado de no golpear a los pozos directamente. Colocar con cuidado el chip en los pocillos, prestando mucha atención a la alineación entre los dos (este paso se puede realizar en un estereoscopio). Presione suavemente para adherir las dos capas de la EPMS. Lentamente llene completamente el dispositivo con aproximadamente 50 l medio rico, asegurándose de que no hay burbujas de aire se dejan dentro de la canal. </li><li> Conecte el dispositivo, la inserción de los tubos en las entradas apropiadas e iniciar el flujo de los medios de comunicación. Tener cuidado de que no hay burbujas de aire se introduce en el dispositivo, ya que pueden ser difíciles de eliminar, esto se puede lograr mediante la desconexión de una entrada o salida y golpeando suavemente sobre el dispositivo en el que las burbujas son, con cuidado de no romper el cubreobjetos de vidrio. </li><li> Colocar bajo microscopio y buscar los puntos apropiados de formación de imágenes en cada pocillo. </li><li> Mantener las células bajo un flujo de medio rico durante 1 hora o más para permitir la recuperación, si es necesario. </li><li> Iniciar el experimento: se utiliza el flujo constante de cada una de las dos bombas de jeringa para evitar el reflujo de los medios de comunicación, el cambio de velocidades relativas de flujo como se desee. Ajuste de la bomba A a 0,8 ml / hr y B de la bomba a 0,2 ml / hr resultados en medio A que fluye sobre 80% de la anchura del canal (Figura 4). Esto puede ser dinámicamente ccolgado mediante el cambio de los dos caudales. Las nuevas condiciones estabilizar dentro de segundos a lo largo de toda la longitud de la canal 2. </li></ol>

<ol><li>Dertinger, S. K., Jiang, X., Li, Z., Murthy, V. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradients+of+substrate-bound+laminin+orient+axonal+specification+of+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Gradients of substrate-bound laminin orient axonal specification of neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99, 12542-12547 (2002).</li>
<li>Hersen, P., McClean, M. N., Mahadevan, L., Ramanathan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signal+processing+by+the+HOG+MAP+kinase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Signal processing by the HOG MAP kinase pathway.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 7165-7170 (2008).</li>
<li>Paliwal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MAPK-mediated+bimodal+gene+expression+and+adaptive+gradient+sensing+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MAPK-mediated bimodal gene expression and adaptive gradient sensing in yeast.</a> Nature. 446, 46-51 (2007).</li>
<li>Bennett, M. R., Hasty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+devices+for+measuring+gene+network+dynamics+in+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">Microfluidic devices for measuring gene network dynamics in single cells.</a> Nat. Rev. Genet. 10, 628-638 (2009).</li>
<li>Shrirao, A. B., Perez-Castillejos, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+Fabrication+of+Microfluidic+Devices+by+Replicating+Scotch-tape+Masters%5BTitle%5D)+AND+%22Chips+%26+Tips%22%5BJournal%5D)">Simple Fabrication of Microfluidic Devices by Replicating Scotch-tape Masters.</a> Chips & Tips. , (2010).</li>
<li>Haubert, K., Drier, T., Beebe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+bonding+by+means+of+a+portable%2C+low-cost+corona+system%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">PDMS bonding by means of a portable, low-cost corona system.</a> Lab Chip. 6, 1548-1549 (2006).</li>
<li>Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+microfluidic+approach+to+generating+protein-interaction+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks.</a> Nat. Methods. 6, 71-74 (2009).</li>
</ol>

No hay conflictos de interés declarado.

En este trabajo se presenta un método de sobremesa sencillo para crear un dispositivo de microfluidos que permite las siguientes cepas de levadura de manera simultánea en condiciones dinámicas. Después de varias cepas en un canal proporciona una herramienta fiable para la comparación de la dinámica de las respuestas de células individuales en múltiples cepas. Una ventaja de nuestro enfoque es la capacidad para fabricar el dispositivo con técnicas sencillas sin la necesidad de una sala limpia. De hecho, también hemos lle...

Las células constantemente reaccionar a un entorno que cambia dinámicamente, cambiando su metabolismo, el perfil de la transcripción y de las funciones celulares. Para estudiar estos fenómenos, los métodos que puedan cuantificar dichos cambios son necesarios. Un tipo de lectura para tales respuestas es el cambio en la localización de los factores de transcripción relacionados con el estrés en respuesta a estrés nutricional. Los dispositivos microfluídicos 1 se han utilizado para manipular dinámicamente condiciones ambientales a las células 2-4. Se presentan varias ventajas para imágenes de células vivas: el medio ambiente de las células puede ser controlada con precisión y cambiar dinámicamente; células pueden ser vivo-imagen formada en todo momento, incluyendo durante la manipulación de las condiciones externas, y volúmenes mínimos de reactivos se requieren. Un diseño muy simple para un dispositivo de microfluidos, permitiendo alternancia entre dos condiciones, es un dispositivo en forma de Y 2. Nos utilizan habitualmente en forma de Y que permiten que los dispositivos de microfluidosaplicación de cambios dinámicos en las células en el canal. Usamos este dispositivo para seguir los cambios de localización de marcado con fluorescencia factores de transcripción relacionados con el estrés en las células de levadura. Seguimos estos cambios en las nuevas condiciones nutricionales. Por ejemplo, se puede proporcionar un impulso (o una serie de pulsos) de la glucosa que contienen medio dentro de un período de no glucosa-medio, con una resolución temporal muy fina. A menudo, en estos experimentos, se está interesado en comparar las respuestas de las cepas celulares diferentes (por ejemplo, mutantes diferentes, o diferentes cepas salvajes). El canal en forma de Y está limitado a una cepa en cada canal - si más de una cepa se utiliza, no hay ninguna manera sencilla de distinguir entre las cepas. Para superar esto, los canales se pueden utilizar diferentes. Si queremos aplicar las mismas condiciones dinámicas a múltiples cepas, nos gustaría combinar el concepto Y-canal con múltiples canales. Hay dos desafíos en la implementación de esta solución: Puede ser difícil de aplicar tél mismas condiciones al mismo tiempo a todos los canales, y no hay una limitación geométrica con el número de Y-canales que se pueden montar en un solo dispositivo. Estábamos por lo tanto buscando una manera para ver varias cepas en un canal en condiciones dinámicas. Aquí se describe un dispositivo de microfluidos de dos capas destinado a cepas de imágenes múltiples en un canal bajo las mismas condiciones dinámicas. La capa inferior consiste en PDMS delgada con una fila de agujeros. Esta capa está unida al cubreobjetos de vidrio en la creación de los pozos que vamos a colocar las diferentes cepas, adhiriéndose con concanavalina A para el vidrio. La segunda capa es un dispositivo microfluídico en forma de Y creado usando el método de la cinta adhesiva 5. Después de colocar las cepas en los pocillos de la segunda capa es rápidamente alineado y conectado a la primera, la creación de un canal con varios pozos que contienen las diferentes cepas. Este último dispositivo permite tras varias cepas en un canal, donde todoscepas se someten a las mismas condiciones que en el mismo tiempo exacto. Todo el diseño y el proceso de producción se puede hacer en el laboratorio, utilizando medios sencillos, sin litografía blanda.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reactivo / Equipo </td><td> Empresa </td><td> Número de catálogo </td></tr><tr><td> PDMS-SYLGARD 184 </td><td> Dow Corning EE.UU. </td><td></td></tr><tr><td> Desecador de vacío </td><td> Nalgene </td><td> 5310-0250 </td></tr><tr><td> Biopsia pegadores </td><td> Ted Pella Inc. </td><td> Harris Uni-Core 15.076 (2 mm), 15.074 (1,2 mm) </td></tr><tr><td> Las bombas de jeringa </td><td> Chemyx </td><td> Fusion 200 </td></tr><tr><td> Corona tratador </td><td> Technic Electro-productos </td><td> BD-20 </td></tr><tr><td> Tygon tubería </td><td> Tygon </td><td> S-54-HL </td></tr><tr><td> Concanavalina-A </td><td> Sigma </td><td> C7275 </td></tr><tr><td> Cinta adhesiva </td><td> 3M Scotch </td><td> Cinta transparente 1/2 &quot; </td></tr></tbody></table>

un dispositivo de microfluidos para el estudio de varias cepas distintas

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

El estudio de las respuestas celulares a los cambios ambientales plantea muchos retos experimentales: las células necesitan para formar imágenes en condiciones cambiantes, a menudo de una manera comparativa. Placas de pocillos múltiples, se utilizan habitualmente para comparar diferentes cepas o líneas celulares, pero permiten un control limitado sobre la dinámica del medio ambiente. Los dispositivos microfluídicos, por otra parte, permite el control exquisito dinámico sobre las condiciones del entorno, pero es difícil de imagen y distinguir más de unas pocas cepas de ellos. Aquí se describe un método para fabricar fácil y rápidamente un dispositivo de microfluidos capaz de aplicar las condiciones de cambio dinámico a múltiples cepas de levadura distintas en un canal. El dispositivo está diseñado y fabricado por medios sencillos sin necesidad de litografía blanda. Se compone de un canal de flujo en forma de Y unido a una segunda capa albergar micropocillos. Las cepas se colocan en pocillos separados, y fotografiado bajo las exactas condiciones dinámicas mismos. Nos demo denstrate el uso del dispositivo para la medición de las respuestas de proteína de localización a los pulsos de cambios de nutrientes en diferentes cepas de levadura.

Para demostrar la separación entre las diferentes cepas que fotografiado dos cepas de levadura distinguibles en pocillos alternos. La formación de imágenes completo pozos muestra ninguna fuga entre los pocillos de células (Figura 5a, b). Ambas cepas tienen la MSN2 factor de transcripción etiquetados con YFP. Para probar el efecto simultáneo de las condiciones cambiantes dinámicamente, cambiamos las velocidades de flujo en los dos canales de entrada, creando un paso de medio sin glucosa, lo que resultó e...

Se presenta un método simple para producir los dispositivos de microfluidos capaces de aplicar similares condiciones dinámicas a múltiples cepas distintas, sin la necesidad de una sala limpia o litografía blanda.

Un dispositivo de microfluidos para el estudio de varias cepas distintas

El estudio de las respuestas celulares a los cambios ambientales plantea numerosos desafíos experimentales: es necesario obtener imágenes de las células bajo condiciones cambiantes, a menudo en un...

El objetivo general del siguiente método es obtener imágenes del comportamiento de células individuales de diferentes cepas de levadura bajo las mismas condiciones dinámicas. Esto se logra fabricando un dispositivo microfluídico de dos capas, en el que la capa inferior contendrá por separado cada una de las diferentes cepas, y la capa superior proporcionará las condiciones de flujo dinámico en un segundo paso. Diferentes cepas de levadura se colocan en los pozos y el dispositivo se cierra, creando un canal único con múltiples cepas separadas. A continuación, observamos las respuestas celulares a cambios dinámicos del medio. Al controlar los caudales en las dos entradas del canal en Y, los resultados muestran diferentes cepas sometidas a las mismas condiciones dinámicas y sin contaminación cruzada entre pozos. Este dispositivo de microfluídica presenta varias ventajas clave frente a otros sistemas existentes. Permite observar múltiples cepas distintas bajo las mismas condiciones dinámicas.Además, es importante destacar que puede fabricarse fácilmente en cualquier laboratorio sin necesidad de equipo especial. La idea de este método surgió de una discusión sobre cómo seguir las respuestas de diferentes aislamientos silvestres del este a períodos de inanición. Comience, dibuje o imprima el diseño deseado de los microcanales a escala.A continuación, cubra un portaobjetos de vidrio con capas de cinta adhesiva. Para alcanzar la altura deseada del canal, coloque el diseño del molde sobre una superficie plana y alinee el portaobjetos sobre el patrón del diseño. Ahora corte cuidadosamente la cinta adhesiva del portaobjetos de vidrio según el diseño. Retire la cinta adhesiva de todas las regiones del portaobjetos de vidrio.Acepte aquellos en la disposición del microcanal. Coloque el portaobjetos en una estufa de calentamiento a 65 grados Celsius durante tres minutos. Luego limpie suavemente con etanol.Mezcle los componentes base y de curado del PDMS según lo recomendado por el fabricante. Vierta aproximadamente 30 mililitros de la mezcla de PDMS en una placa de Petri hasta una altura de aproximadamente 0,5 centímetros. Desgasifique el PDMS al vacío si es necesario.Sumerja la lámina de vidrio en el PDMS con la cinta adhesiva grabada hacia arriba. Colocar el patrón después del PDMS evita la formación de burbujas de aire entre la lámina y el fondo del recipiente. Cure durante 48 horas a 65 grados Celsius, asegurándose de que el recipiente esté horizontal utilizando un nivel de burbuja en un nuevo plato de Petri de 90 milímetros. Vierta tres mililitros de mezcla de PDMS.Este paso puede realizarse en un spin coder si está disponible. DGAs y curado como se mostró anteriormente. Ahora, corte suavemente la capa de flujo del dispositivo microfluídico al tamaño deseado con un punzón de biopsia.Cree orificios para las entradas y salidas en la capa de flujo. También corte una capa de pozos de tamaño similar del segundo plato de Petri y colóquela sobre un vidrio grueso. Deslice sobre el diseño del plano.Luego, realice perforaciones para los pocillos alineadas con los microcanales del diseño utilizando etanol, limpie ambas capas de PDMS y una cubreobjetos de vidrio y séquelas al aire. A continuación, trate la cubreobjetos de vidrio y la capa de PDMS de los pocillos con un grabador de plasma estándar para unión no reversible o con un aparato manual de tratamiento por corona para unión reversible. Coloque cuidadosamente la capa de los pocillos encima de la cubreobjetos para provocar la adhesión.Frotar suavemente para eliminar cualquier burbuja de aire. Preparar el medio deseado en jeringas adecuadas y conectarlas al tubo tigón insertado en una bomba de jeringa. Para la obtención de imágenes celulares.Utilice las fortalezas. Diríjase a la fase deseada, vortexe bien la cultura y transfiera 300 microlitros a tubos de microcentrífuga. Coloque suavemente un microlitro de con canna A en cada pocillo de la capa de pocillos de PDMS.Lave el exceso de conna A de cada pocillo dos veces pipeteando agua suavemente mientras el con en A se seca. Lave las cepas dos veces con 300 microlitros de medio SC sin glucosa. Eliminar la glucosa residual de las paredes celulares ayuda a una adecuada adherencia al conval.Después de agitar en vórtex, pipetee cuidadosamente aproximadamente 0,5 microlitros de la suspensión celular en cada pocillo individual. Lave suavemente las células residuales con medio rico. Los dos siguientes pasos deben realizarse rápidamente para evitar que las células se sequen.Como paso opcional, trate el chip y los pocillos teniendo cuidado de no impactar directamente en los pocillos. Luego, bajo un estereoscopio, coloque cuidadosamente el chip sobre los pocillos prestando especial atención al alineamiento entre ambos. Presione suavemente para adherir las dos capas de PDMS.Llene lentamente el dispositivo completamente con unos 50 microlitros de medio rico, asegurándose de que no queden burbujas de aire dentro del canal. Ahora conecte el dispositivo insertando los tubos en las entradas adecuadas e inicie el flujo del medio. Tenga cuidado de que no se formen burbujas de aire en los tubos, ya que estas pueden quedar atrapadas en el dispositivo y alterar el flujo.Proceda a colocar el dispositivo bajo un microscopio y localice puntos adecuados para la adquisición de imágenes en cada uno. Mantenga las células bajo un flujo abundante de medio durante una hora o más, si es necesario, para permitir la recuperación.Inicie el experimento con un flujo constante. Configure la bomba A a 0,8 mililitros por hora y la bomba B a 0,2 mililitros por hora. Para el medio a, el flujo debe cubrir el 80 % del ancho del canal.Podemos cambiar dinámicamente las condiciones en el dispositivo modificando las tasas de flujo relativas. Las nuevas condiciones se estabilizan en cuestión de segundos a lo largo de todo el canal. Para demostrar la separación entre diferentes cepas, se obtienen imágenes de dos cepas de levadura distinguibles en pozos alternos.Téngase en cuenta que no hay fuga celular entre pozos en este experimento. Ambas cepas tienen el factor de transcripción MSN dos marcado con YFP para probar el efecto simultáneo de condiciones cambiantes dinámicamente. Las tasas de flujo en los dos canales de entrada se modificaron para crear un escalón de medio sin glucosa.Esto resultó en la localización de MSN dos en el núcleo. Importante, se puede analizar la pista temporal de los niveles de MSN dos YFP en el núcleo en células individuales. Por lo tanto, el dispositivo microfluídico de PDMS puede utilizarse para aplicar condiciones dinámicas simultáneas a múltiples pocillos.Al intentar este procedimiento, es importante recordar no dejar que las células se sequen durante el ensamblaje del dispositivo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse fácilmente sin necesidad de litografía suave.

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