Un dispositivo de microfluidos para el estudio de varias cepas distintas

El objetivo general del siguiente método es obtener imágenes del comportamiento de células individuales de diferentes cepas de levadura en las mismas condiciones dinámicas. Esto se logra fabricando un dispositivo microfluídico de dos capas, o la capa inferior contendrá cada una de las diferentes cepas por separado, y la capa superior proporcionará las condiciones de flujo dinámico como un segundo paso. Se colocan diferentes cepas de levadura en los pocillos y el dispositivo se cierra, creando un solo canal con múltiples cepas separadas.

A continuación, visualizamos las respuestas de la célula a los cambios dinámicos del medio. Al controlar los caudales en las dos entradas del canal Y, los resultados muestran diferentes deformaciones sometidas a las mismas condiciones dinámicas y sin contaminación cruzada entre pozos. Este dispositivo microfluídico tiene varias ventajas clave sobre otros sistemas existentes. Permite obtener imágenes de múltiples deformaciones distintas en las mismas condiciones dinámicas.

Además, lo que es más importante, se puede fabricar fácilmente en cualquier laboratorio sin necesidad de equipos especiales. El método surgió de la discusión sobre cómo seguir las respuestas de diferentes aislados del este salvaje a los pases de inanición. Inicie, dibuje o imprima el diseño de microcanal deseado a escala.

A continuación, cubra una diapositiva de vidrio con capas de cinta adhesiva Para lograr la altura deseada del canal, coloque el diseño de diseño en una superficie plana y alinee la diapositiva sobre el patrón de diseño. Ahora corte con cuidado la cinta en el portaobjetos de vidrio de acuerdo con el diseño. Retire la cinta adhesiva de todas las regiones del portaobjetos de vidrio.

Acéptalos en el diseño del micro canal. Coloque la diapositiva en un horno de calentamiento a 65 grados centígrados durante tres minutos. A continuación, limpie suavemente con etanol.

Mezcle la base y los componentes de curado de PDMS según lo recomendado por el fabricante. Vierta unos 30 mililitros de mezcla de PDMS en una placa de Petri a una altura de aproximadamente 0,5 centímetros. Desgasifique el PDMS en vacío si es necesario.

Sumerge el portaobjetos de vidrio en el PDMS con la cinta adhesiva estampada hacia arriba. Colocar el patrón después del PDMS evita la formación de burbujas de aire entre el portaobjetos y la placa Cura en el fondo durante 48 horas a 65 grados centígrados, asegurándose de que la placa esté horizontal usando un nivel de burbuja en una nueva placa de Petri de 90 milímetros. Vierta tres mililitros de mezcla de PDMS.

Este paso se puede realizar en un codificador de giros si está disponible. DGA y cura como se muestra anteriormente. Ahora corte suavemente la capa de flujo del dispositivo microfluídico hasta el tamaño deseado con un perforador de biopsia.

Cree agujeros para las entradas y salidas de la capa de flujo. También corte una capa de pocillos de tamaño similar de la segunda placa de Petri y colóquela en un vaso grueso. Deslízate sobre el diseño de la disposición.

A continuación, perfore los pocillos en alineación con los microcanales del diseño con etanol, limpie ambas capas de PDMS y un engobe de cubierta de vidrio y seque al aire. A continuación, trate el cubreobjetos de vidrio y el PDMS de la capa de pocillos con un grabador de plasma estándar para una unión no reversible o un tratador de corona portátil para una unión reversible. Coloque con cuidado la capa de los pocillos encima del cubreobjetos para causar adherencia.

Frote suavemente las burbujas de aire. Prepare los medios deseados en jeringas apropiadas y conéctelos al tubo de tigón roscado a través de una bomba de jeringa. Para la obtención de imágenes celulares.

Usa las fortalezas. Vaya a la fase deseada, Vortex el cultivo a fondo y transfiera 300 microlitros a tubos de microcentrífuga. Coloque suavemente un microlitro de con canna A en cada pocillo de la capa de pocillos del PDMS.

Lave el exceso de conna A de cada pocillo dos veces pipeteando suavemente el agua mientras se seca la contina en A. Lavar las cepas dos veces con 300 microlitros de medio SC sin glucosa. El lavado de la glucosa residual de las paredes celulares ayuda a la correcta adherencia al conval.

En un vórtice posterior, las células pipetean minuciosamente aproximadamente 0,5 microlitros de la suspensión celular en pocillos individuales. Lave suavemente las células residuales con medio rico. Los siguientes dos pasos deben realizarse rápidamente para evitar que las células se sequen.

Como paso opcional de plasma, trate el chip y los pocillos teniendo cuidado de no golpear directamente los pocillos. Luego, bajo un estereoscopio, coloque con cuidado el chip en los pocillos prestando mucha atención a la alineación entre los dos. Presione suavemente para adherir las dos capas de PDMS.

Llene lentamente el dispositivo por completo con unos 50 microlitros de medio rico, asegurándose de que no queden burbujas de aire dentro del canal. Ahora conecte el dispositivo insertando los tubos en las entradas apropiadas e inicie el flujo de medios. Tenga cuidado de que no se formen burbujas de aire en el tubo, ya que pueden atascarse en el dispositivo y destruir el flujo.

Proceda a colocar el dispositivo bajo un microscopio y encuentre los puntos de imagen apropiados en cada uno. Bueno, mantenga las células bajo un flujo medio rico durante una hora o más si es necesario. Para permitir la recuperación.

Inicie el experimento con el ajuste de flujo constante. Bomba A a 0,8 mililitros por hora y bomba B a 0,2 mililitros por hora. Para el medio un flujo de más del 80% de la anchura del canal.

Podemos cambiar dinámicamente las condiciones en el dispositivo cambiando los caudales relativos. Las nuevas condiciones se estabilizan en segundos a lo largo de todo el canal para demostrar la separación entre diferentes cepas. Se visualizan dos cepas de levadura distinguibles en pozos alternos.

Tenga en cuenta que no hay fugas de celdas entre pozos en este experimento. Ambas cepas tienen el factor de transcripción MSN dos marcado con YFP para probar el efecto simultáneo de condiciones dinámicamente cambiantes. Los caudales en los dos canales de entrada se cambiaron para crear un paso sin medio de glucosa.

Esto dio lugar a la localización de MSN dos en el núcleo. Es importante destacar que se puede analizar la trayectoria temporal de los niveles nucleares de MSN dos YFP en células individuales. Por lo tanto, el dispositivo microfluídico PDMS se puede utilizar para la aplicación de condiciones dinámicas concurrentes a múltiples pozos.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe dejar que las células se sequen durante el ensamblaje del dispositivo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar fácilmente sin necesidad de litografía blanda.