Iterativo de optimización de dúplex de ADN para la cristalización de SEQA-ADN complejos

Este experimento detalla cómo obtener cristales de calidad de difracción de una proteína unida al ADN que contiene un dobladillo en tándem metilado. GATC. Repita para favorecer el empaquetamiento cristalino del complejo de ADN proteico. Comience con el diseño racional de la longitud del ADN, el espaciado GATC y los extremos del ADN, proceda con los oligonucleótidos monocatenarios complementarios para purificar el ADN y luego anele para formar el dúplex de ADN hemimetilado, luego mezcle el seq A purificado para formar el complejo.

A continuación, encuentre las condiciones óptimas para cultivar cristales de calidad de difracción del complejo de ADN proteico con ensayos de cristalización utilizando cribas comerciales de matriz dispersa. Resultados demostrados. Comparta el efecto de la variación de la longitud del ADN, el espaciado y los extremos de GATC en la calidad de difracción de los cristales de ADN CQ A.

El objetivo de este trabajo es obtener cristales de calidad de difracción de CK unidos al ADN, pero también puede ayudar a comprender las variables generales que deben tenerse en cuenta al diseñar dúplex de ADN para la cristalización de otros complejos de ADN proteicos. Este estudio utiliza una variante de las proteínas reguladoras de la replicación del ADN. Busque un que forme dímeros estables y tenga una región de enlace acortada entre su ización y los dominios de unión al ADN.

Esta variante restringe la unión del ADN a repeticiones GATC en tándem separadas exclusivamente por un turno en la primera transformada de ADN BBL 20 1D tres células con el plásmido que codifica DEMETRIC seq A bajo el control de la placa promotora T seven. La reacción de transformación en placas de agar LB que contienen 100 microgramos por mililitro, ampicilina y se coloca en la incubadora bacteriana durante la noche. Elija colonias mixtas y comience un cultivo nocturno a pequeña escala.

A la mañana siguiente, inoculador un litro de cultivo con 10 mililitros de inóculo durante la noche. Cuando el cultivo esté en fase logarítmica, agregue dos mililitros de IPTG 0.5 molar para inducir la producción de proteína. Continúe la incubación durante tres horas en un agitador orbital de 37 grados centígrados.

A continuación, recoja las células por centrifugación a 3.300 g durante 10 minutos. Reese, suspender la paleta celular en purificación, tampar una mentira por sonicación y limpiar el lisado por centrifugación a 39.000 veces G durante 40 minutos. Ahora cargue el sobrenadante S en una columna de heparina equilibrada con tampón de purificación.

Para eluir la proteína CK. Utilice un gradiente lineal a un molar, la proteína CK de cloruro de sodio eluye alrededor de 0,7 molar, cloruro de sodio. Tire de las fracciones que contienen CK y diluya para reducir la fuerza iónica de la muestra.

A continuación, cargue la muestra en una columna de cromatografía de intercambio catiónico E equiparada con el tampón de purificación. Aplique un gradiente de sal lineal para hacer un bucle de proteína CK pura a alrededor de 0,4 molares de cloruro de sodio. Combina las fracciones que contienen CK.

Concéntrelo a tres miligramos por mililitro y guárdelo en el almacén. Diseño de tampón: oligonucleótidos no metilados y metilados complementarios. Prepare muestras de un micromol de cada ADN monocatenario liofilizado en 800 microlitros de autoclave, vórtice de agua destilada doble y deje reposar durante 15 minutos ahora y 800 microlitros.

Haber precalentado dos veces cargando tampón a cada muestra para 20 a 30 nucleótidos oligonucleótidos largos preparar un gran gel desnaturalizante al 10%. Una vez polimerizado, retire el peine y enjuague bien el pozo. Ensamble el gel llenando los depósitos superior e inferior con un tampón de funcionamiento TBE de una vez.

Deje correr previamente el gel a 750 voltios para calentar el gel a 55 grados centígrados. Luego detenga la ejecución y enjuague bien los pozos con tampón de ejecución. Ahora caliente los oligonucleótidos a 90 grados centígrados durante dos minutos.

Vórtice y giro. Las muestras proceden inmediatamente a cargar el gel. Haga funcionar el gel a unos 700 voltios hasta que el oligonucleótido haya migrado.

A mitad de camino: En un gel de poliacrilamida al 10%, el azul de fenol co migra con oligonucleótidos de alrededor de 20 bases de largo y xileno syl ff con alrededor de 60 bases de largo. Desmonte el gel del aparato y retire los espaciadores sobre una superficie plana. Retire una placa de vidrio y cubra el gel con una envoltura de plástico.

Luego voltee el gel, retire la otra placa de vidrio y cubra el gel con una envoltura de plástico. A continuación, marque las bandas con luz ultravioleta y una placa fluorescente detrás del gel. Para ver la sombra del ADN con una cuchilla de afeitar, extirpa la banda y córtala en trozos pequeños.

Transfiera cada muestra a un tubo estéril de 15 mililitros. Agregue nueve mililitros de tampón elucian y diluya durante la noche a 37 grados centígrados con agitación. Transfiera con cuidado la solución a un tubo de centrífuga de autoclave utilizando una punta de pipeta de carga de gel.

Para evitar la transferencia de trozos de acrilamida, agregue un mililitro de acetato de sodio de tres mili a pH siete más 25 mililitros de etanol 100% refrigerado e incube a menos 20 grados centígrados durante al menos tres horas. Centrifugar el ADN precipitado. A continuación, seque los pellets en la speed vac a temperatura media, resuspenda cada pellet en 400 microlitros de autoclave, doble agua destilada y transfiéralos a un tubo nuevo.

Agregue 40 microlitros de acetato de sodio de tres molares a pH siete y un mililitro de vórtice de etanol al 100% e incube durante 30 minutos a menos 20 grados Celsius después de la centrifugación durante 15 minutos a 18.000 veces. G, enjuague los gránulos de ADN con 100 microlitros de etanol frío al 70% para eliminar cualquier centrifugado de sal residual durante seis minutos a 18.000 veces. A continuación, deseche el etanol y seque el pellet en una aspiradora rápida.

Ahora vuelva a enviar cada pellet en 100 microlitros de agua doble destilada en autoclave. Determinar la concentración de los oligonucleótidos por espectrometría. Para preparar los dúplex de ADN hemimetílado, primero mezcle concentraciones iguales de molo de las hebras simples complementarias.

Luego caliente las mezclas a 95 grados centígrados en un baño de agua durante cinco minutos para aniquilar las hebras. Deje que las muestras se enfríen lentamente a temperatura ambiente dentro del baño de agua. Combine volúmenes iguales de 81 micromolares purificados CQ una proteína y 81 micromolares de ADN metilado.

Luego incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos. Almacene a cuatro grados centígrados hasta el uso de la pantalla para condiciones de cristalización utilizando pantallas comerciales de matriz dispersa. Una vez que se han identificado los cables de cristalización iniciales, optimice las condiciones para cultivar cristales de calidad de difracción para llorar y proteger los cristales de ADN CK resultantes.

Aumente la cantidad de PEG 400 presente en la solución de cristalización a una concentración final del 25% o agregue un 20% de glicerol a la solución de cristalización. Saque los cristales individuales con un flash de bucle de nailon. Congele las muestras en nitrógeno líquido.

Ahora pruebe el límite de difracción de cada cristal a 100 k. Para obtener la estructura cristalina del mutante acortado de CK unido al ADN metilado Hemi, optimizamos consecutivamente tres parámetros en el ADN, el espaciamiento entre las secuencias de GATC metiladas Hemi, la longitud del dúplex y la ausencia o presencia de cinco voladizos primos. En este estudio se utilizó una variante DME de seek a con una mutación puntual en el dominio terminal final que impide una mayor ligamentización y un enlazador acortado que restringe la unión del ADN en tándem.

Las repeticiones de GATC separadas exclusivamente por una vuelta en los ensayos de cambio de electromovilidad del ADN indican que la proteína CK modificada se une preferentemente a las repeticiones de GATC separadas por nueve a 10 pares de bases. Por lo tanto, las pantallas iniciales utilizan dúplex de 23 a 24 pares de bases de largo que contienen dos dobladillos metilados. GATC repeticiones separadas por nueve o 10 pares de bases.

Tres dúplex produjeron cristales de buena forma. Mientras que ninguno de los cristales se desfracturó a alta resolución. Los datos indicaron que se prefirió la separación A-G-A-T-C de nueve pares de bases para la cristalización, mejorando inesperadamente las interacciones entre la columna vertebral del surco al incluir un dinucleótido CG entre los dos sitios GATC que no alteraron el límite de difracción de los cristales.

Por el contrario, la optimización de la longitud de los voladizos cambió drásticamente los contactos moleculares y la morfología de los cristales. La estructura cristalina de esta proteína CK unida a un dúplex de ADN metilado confirmó que la cara libre del dúplex de ADN no participa en contactos cristalinos a pesar del tamaño relativo de la proteína y el ADN, la mayoría de las interacciones entre parejas de simetría están mediadas por interacciones de proteína, proteína y ADN de proteínas. Curiosamente, en este caso particular, el efecto beneficioso de un saliente de dinucleótidos de cinco primos no se debe a la formación de un ADN pseudo continuo.

En cambio, los cinco extremos principales de la hebra metilada se proyectan lejos de los ejes del ADN e interactúan con la molécula CK proximal del complejo, lo que explica por qué se requerían estrictamente dos nucleótidos para cambiar el empaquetamiento de cristales. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo purificar proteínas y diseñar dúplex de ADN para la cristalización de complejos de ADN y proteínas. Es importante recordar que, aunque este protocolo fue un dispositivo para cristalizar el complejo de ADN CK, la optimización racional de la secuencia de longitud y los extremos del ADN proporciona un marco general para el diseño de dúplex de ADN para la cristalización de otros complejos de ADN de proteínas.