Bacterial Detección e Identificación Usando sensores electroquímicos

Se describe un método de ensayo sensor electroquímico para la detección e identificación bacteriana rápida. El ensayo implica una serie de sensores funcionalizado con sondas de captura de oligonucleótidos de ADN para ARN ribosomal (ARNr) secuencias específicas de la especie. Sandwich hibridación de ARNr objetivo con la sonda de captura y una sonda de oligonucleótido detector de ADN unido a peroxidasa de rábano picante produce una corriente amperométrica medible.

El objetivo general del siguiente experimento es detectar e identificar bacterias utilizando sensores electroquímicos. Esto se logra liberando primero el ARN ribosómico de las bacterias para permitir la hibridación con la sonda detectora fluorada, como segundo paso, el ARN ribosómico unido a la sonda detectora se agrega al electrodo de trabajo, lo que permite la hibridación con la sonda de captura en la superficie del sensor. A continuación, se permite que el conjugado de peroxidasa de rábano picante antifluoresceína se una a la sonda detectora fluorada.

Finalmente, en la corriente interferométrica, cuya intensidad se correlaciona con el número de complejos de sonda detectora de ARN ribosómico y de captura en la superficie del sensor. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos basados en cultivos es que las bacterias pueden ser detectadas e identificadas en unos 45 minutos, evitando el peso de la noche a la mañana. Para que una bacteria forme una colonia visible en una placa EDGAR, la aplicación de esta técnica mejoraría el manejo de las enfermedades infecciosas.

La detección temprana de patógenos bacterianos es esencial para la terapia antibiótica dirigida y la mejora de los resultados clínicos. Aunque este método es útil para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, también se puede aplicar a otros problemas diagnósticos como el inmunodiagnóstico. Comience incubando la sonda de captura dilatada con hexano di tiol durante 10 minutos a temperatura ambiente para asegurarse de que el grupo tiol en la sonda de captura se reduzca, lo que da como resultado resultados más consistentes.

Después de la incubación, aplique un chorro de nitrógeno para que produzca oro. 16 chips de matriz de sensores durante cinco segundos para eliminar la humedad o las partículas, Pequeños volúmenes de líquido deben aplicarse cuidadosamente al electrodo de trabajo en la matriz de sensores. La demostración visual de esta técnica es fundamental.

Al realizar correctamente las técnicas de pipeteo y lavado y secado, se reduce en gran medida la variabilidad de viruta a viruta. A continuación, aplique seis microlitros de la mezcla de sonda de captura dilatada HDT al electrodo de trabajo de los 16 sensores de la matriz de sensores y almacene los chips de sensores en una placa de Petri cubierta a cuatro grados centígrados durante la noche del día siguiente, lave los chips de sensores con agua desionizada durante dos o tres segundos y luego seque los chips bajo un chorro de nitrógeno durante cinco segundos. Ahora aplique seis microlitros de cloruro de sodio y cloruro de ATTRI, solución de EDTA MERCAPTOETANOL al electrodo de trabajo de los 16 sensores, e incube los sensores durante 50 minutos en una placa de Petri a temperatura ambiente.

Para preparar las muestras para el ensayo del sensor electroquímico. Transfiera un mililitro de cultivo bacteriano en la fase logarítmica de crecimiento a un tubo de microcentrífuga y luego centrifugue las células durante cinco minutos a 16, 000 g. Tenga en cuenta que las bacterias patógenas deben manipularse en una campana de bioseguridad.

Después de retirar el snat, aplique una punta de pipeta que contenga 10 microlitros de hidróxido de sodio molar en el fondo del tubo de microcentrífuga y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para resuspender completamente el pellet. Después de incubar la suspensión a temperatura ambiente durante cinco minutos, agregue 50 microlitros de PBS que contenga albúmina sérica bovina o BSA y una sonda detectora modificada con fluoresceína para neutralizar el lisado bacteriano. A continuación, incubar el lisado neutralizado durante 10 minutos a temperatura ambiente.

Comience este paso lavando la solución de mercaptoetanol de uno de los chips sensores preparados con agua desionizada durante dos o tres segundos. Después de secar el chip como se acaba de demostrar, aplique cuatro microlitros del lisado de bacterias neutralizadas a los electrodos de trabajo. 14 de los sensores.

A continuación, aplique cuatro microlitros del oligonucleótido puente en la sonda detectora modificada con fluoresceína PBS más BSA más fluoresceína a los dos sensores de control positivo. Luego, después de incubar el lisado y los sensores de control positivo durante 15 minutos, lave y luego seque todo el chip del sensor como antes. Ahora aplique cuatro microlitros de peroxidasa de rábano picante antifluoresceína o HRP en PBS que contiene caseína a los electrodos de trabajo de los 16 sensores.

Después de una incubación de 15 minutos, lave y seque el chip sensor. A continuación, aplique una pegatina de pozo de película en la superficie del chip del sensor y cargue el chip en la pipeta de montaje del chip del sensor 50 microlitros de sustrato TMB en los 16 sensores y cierre el soporte del chip del sensor. Por último, utilice un lector de chips Helios para obtener mediciones de pirometría y telemetría cíclica para los 16 sensores.

El ensayo electroquímico que se acaba de describir está estructurado de manera similar a un sándwich, Eliza, como se muestra en esta figura ribosómica diana, la hibridación de ARN con sondas de captura y detector se desarrolla mediante una reacción redox catalizada por HRP conjugada con fragmentos de anticuerpos antifluoresceína que se unen a los tres enlaces de fluoresceína de pino en la sonda detectora. Un componente importante de la sensibilidad del ensayo es la química de la superficie del electrodo de oro. El electrodo de oro está recubierto con mercaptoetanol y hine ol y se funcionaliza mediante la adición de sondas de captura dilatadas.

La hibridación en sándwich del ARN ribosómico objetivo con la sonda de captura y la sonda detectora marcada con fluoresceína da como resultado un complejo que se detecta mediante la adición del conjugado peroxidasa de rábano picante antifluoresceína y el sustrato TMB. La corriente paramétrica M es generada por el ciclo redox que resulta de la oxidación del TMB por la peroxidasa de rábano picante y la reducción del TMB por los electrones del electrodo. Los ensayos demostrados aquí emplean un chip de matriz de sensores 16 génicos fluidos.

Cada uno de los sensores de la matriz contiene tres electrodos, de referencia de trabajo y auxiliar, que tienen puntos de contacto en el borde del chip. El lector de chips tiene pines pogo que se conectan con cada uno de los puntos de contacto. El lector de chips sirve como interfaz para el conjunto de sensores con un potenciómetro controlado por un algoritmo informático.

Aquí se muestran ejemplos de un flujo de corriente de sensor electroquímico. El flujo de corriente en los sensores es artificialmente alto durante los primeros segundos después de que comienzan las mediciones paramétricas. Debido a la acumulación de sustrato oxidado durante el tiempo que transcurre desde la aplicación de TMB a la superficie del sensor hasta el inicio del algoritmo del lector, el flujo de corriente alcanza rápidamente un estado estable y se pueden obtener lecturas precisas del sensor de manera confiable en 60 segundos.

La variabilidad de sensor a sensor es relativamente constante, por lo que es posible realizar 16 ensayos de sensores diferentes en paralelo en el gen fluidic 16 controles positivos y negativos de chip de matriz de sensores son esenciales como control positivo. De esta manera, se utiliza un oligonucleótido de ADN puente sintético que se hibrida tanto con las sondas de captura como con las del detector y sirve como objetivo sintético de concentración conocida. Los resultados obtenidos utilizando el oligonucleótido puente funcionan como un control de calibración interno para minimizar la variación de chip a chip.

Cuanto mayor sea la corriente negativa del electrodo, mayor será la señal. Al probar sondas de captura y detectores. El límite de detección debe determinarse mediante la dilución en serie de una muestra de concentración conocida, como se muestra en esta figura, existe una correlación logarítmica lineal entre la concentración de la muestra y la salida de la señal en el rango dinámico del ensayo.

En estos gráficos de barras, los resultados representativos de las muestras que contienen esia coli y sello kleb y amoníaco, que se encuentran con frecuencia en la orina de pacientes con infección del tracto urinario, se muestran que las señales para la mayoría de los sensores serán bajas y similares, y estos resultados negativos se pueden agrupar ya que la reactividad de la señal de fondo con el par de sondas KE distingue el canon de la e. coli. El oligonucleótido puente sirve como control positivo y patrón de calibración interna. Esta técnica se puede aplicar a la detección de bacterias resistentes a los antibióticos en muestras clínicas mediante la medición de la respuesta fenotípica de las bacterias a los antibióticos.

Esta técnica se puede utilizar para determinar la terapia óptima para un paciente individual. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo detectar e identificar bacterias comparando las corrientes átricas en los sensores específicos de diferentes especies en el chip.