Detección ultrasensible de biomarcadores utilizando una impresión Molecular basado Biosensor capacitiva

El objetivo general de esta técnica es detectar y cuantificar biomoléculas de baja abundancia en muestras altamente complejas con alta sensibilidad, simplicidad, bajo costo, velocidad y sin el uso de ningún etiquetado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biotecnología, la bioquímica y la biomedicina, como el monitoreo ambiental, la seguridad alimentaria, la calidad del agua potable y el diagnóstico médico. Las principales ventajas de esta técnica son su rapidez inherente, simplicidad, alta sensibilidad, bajo costo, fácil manipulación y detección en tiempo real sin usar ningún reactivo de etiquetado.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de enfermedades debido a su capacidad para cuantificar biomoléculas poco abundantes. Por ejemplo, diferentes biomarcadores en tiempo real. Para limpiar los cubreobjetos de vidrio, sumérjalos en 10 mililitros de HCl 1.0 molar durante 10 minutos en un limpiador ultrasónico a temperatura ambiente.

Luego, sumérjalos en agua desionizada e hidróxido de sodio 1.0 molar en las mismas condiciones. Seque los cubreobjetos de vidrio con gas nitrógeno. A continuación, sumerja los cubreobjetos limpios y secos en 10 mililitros de una solución APTES durante una hora para introducir grupos amino en la superficie del cubreobjetos a temperatura ambiente.

Enjuague los cubreobjetos con agua desionizada antes de volver a secarlos con gas nitrógeno. Sumerja los cubreobjetos modificados APTES en una solución de 10 mililitros de glutaraldehído durante dos horas para activar los grupos amino de la superficie a temperatura ambiente. Después de la incubación, enjuague los cubreobjetos con tampón de fosfato de 10 milimolares para eliminar el exceso de glutaraldehído de la superficie.

Seque los cubreobjetos con gas nitrógeno. A continuación, prepare 1,0 mililitro de solución molde en tampón de fosfato de 10 milimolares en una concentración de 0,1 miligramos por mililitro. Deje caer 200 microlitros de esta solución de plantilla en los cubreobjetos modificados e incube a cuatro grados centígrados durante la noche.

Para limpiar los electrodos, primero sumerja los electrodos en un pequeño vaso de precipitados que contenga cinco mililitros de etanol al 70% durante 10 minutos en un limpiador ultrasónico a temperatura ambiente. Luego, sumerja secuencialmente los electrodos en agua desionizada, acetona, agua desionizada, solución ácida de piraña y agua desionizada en las mismas condiciones. Seque los electrodos con gas nitrógeno.

Para realizar la electropolimerización de la tiramina, prepare ocho mililitros de solución de tiramina 10 milimolares en tampón de fosfato 10 milimolar que contenga dos mililitros de etanol. Realice 15 ciclos de escaneos voltamperométricos cíclicos en esta solución utilizando un potenciostato que cubre un rango de potencial de cero a 1,5 voltios y una velocidad de escaneo de 50 milivoltios por segundo. Luego, enjuague los electrodos con agua desionizada antes de secar los electrodos con gas nitrógeno.

Sumerja los electrodos en una solución que contenga 30 milimolares de cloruro de acriloilo y 30 milimolares de trimetilamina en tolueno a temperatura ambiente durante la noche antes de enjuagar y secar los electrodos nuevamente. Antes de la polimerización, prepare una solución de monómero que contenga monómeros y reticulante en 820 microlitros de agua ultrapura. A continuación, prepare el 5%volumen a volumen TEMED en agua ultrapura.

Agregue 20 microlitros de la solución TEMED en la solución de monómero y purgue con gas nitrógeno durante cinco minutos. Luego, agregue 20 microlitros de APS recién preparado en la solución de monómero. Pipetear 1,5 microlitros de la solución de monómero sobre la superficie del electrodo de oro modificado.

Ahora, comience la polimerización poniendo el sello de plantilla en contacto con la superficie tratada con monómero y déjelo durante cinco horas a temperatura ambiente. Después de la polimerización, retire el sello de plantilla de la superficie con cuidado, utilizando pinzas. A continuación, enjuague el electrodo con agua desionizada y séquelo con gas nitrógeno.

Sumerja los electrodos en un mililitro de diez milímetros de un dodecanateol preparado en etanol durante veinte minutos para cubrir los agujeros de la superficie del electrodo. Finalmente, enjuague los electrodos con agua desionizada y seque los electrodos con gas nitrógeno antes de caracterizar sus superficies con microscopía electrónica de barrido. Inserte los electrodos de oro capacitivos impresos en la celda de flujo electroquímico integrada a un biosensor capacitivo.

Prepare 100 mililitros de tampón de regeneración y un litro de tampón de funcionamiento. Inicie el análisis con la inyección de tampón de regeneración para regenerar el sistema y tampón en ejecución para reequilibrar el sistema durante 25 minutos. Prepare soluciones de plantilla estándar en el rango de concentración deseado en el tampón de ejecución.

A continuación, inyecte 250 microlitros de estas soluciones estándar de forma secuencial en el sistema en condiciones óptimas. La caracterización de la superficie de los electrodos de oro se realiza mediante microscopía electrónica de barrido. Se muestra la superficie de oro desnudo.

También se muestran bacteriófagos adheridos a la superficie del electrodo en diferentes aumentos. Aquí se muestra la unión de bacteriófagos en tiempo real al electrodo de oro impreso a través de un senograma. Se establece una línea de base estable después de la regeneración y el reequilibrio del sistema antes de la inyección de la muestra.

Hay cavidades específicas de fagos en el electrodo. La inyección de los bacteriófagos inductores de muestras da como resultado una capacitancia reducida, debido a la unión de los bacteriófagos objetivo a las cavidades impresas en la superficie de los electrodos de oro. Las curvas de calibración muestran el cambio de capacitancia frente a la inyección de proteínas en la inyección de bacteriófagos.

A partir de las ecuaciones de estos gráficos, es posible calcular la concentración de bacteriófago o proteína en una muestra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar un sistema de detección ultrasensible, rápido y en tiempo real. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas y treinta minutos, excluyendo los tiempos de espera intermedios.

Al intentar este procedimiento, es importante preparar todos los agentes frescos, en el mismo día. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras métricas como la microscopía de fuerza atómica, la microscopía electrónica de barrido, el elipsómetro y las mediciones de ángulos cuánticos para determinar si la polimerización o la impresión fueron exitosas y para detectar cualquier diferencia significativa entre las superficies de los electrodos de oro desnudos e impresos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bioquímica, la biotecnología y la biomedicina exploraran una detección ultrasensible de una biomolécula en la seguridad alimentaria y el diagnóstico médico.

No olvide que trabajar con monómeros funcionales, reticulantes, iniciadores y otros agentes puede ser extremadamente peligroso. Y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes, batas de laboratorio y la realización de los experimentos de polimerización dentro de la campana extractora mientras se realizan estos experimentos.