Name: Detección ultrasensible de biomarcadores utilizando una impresión Molecular basado Biosensor capacitiva (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-02-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprende a detectar biomarcadores de baja abundancia con alta sensibilidad utilizando un biosensor capacitivo basado en impresión molecular. Este método sin etiquetado permite el monitoreo en tiempo real para aplicaciones en biotecnología y diagnóstico médico.

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María Baumgarten (IQ plataforma de biotecnología, infección de medicina, Universidad de Lund) es reconocido por realizar y brindar análisis de micrografías. Este trabajo fue apoyado por subvenciones de investigación sueco el Consejo Formas (2017-00100) como parte de la tercera articulación programación iniciativa europea llamada resistencia antimicrobiana (JPIAMR) "Dinámica de transmisión". Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, interpretación, escritura, preparación del manuscrito, la decisión de presentar o toma de decisiones para publicar el trabajo.

1. modificación de la cubierta de cristal desliza (plantilla de estampillas)
<ol><li>Para limpiar el vidrio cubreobjetos, sumerja secuencialmente en 10 mL de HCl 1.0 M, agua desionizada y 1,0 M de NaOH, respectivamente, durante 10 minutos en cada paso en un limpiador ultrasónico a temperatura ambiente.<ol>
<li>Seque el cubreobjetos de vidrio con gas nitrógeno. Nota: El cubreobjetos se secan por evaporación bajo corriente de nitrógeno gaseoso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sumerja el cubreobjetos limpios y secos en el 10% (v/v), 10 mL de solución de 3-amino-propil-trietoxisilano (APTES) en etanol durante 1 h para introducir a grupos amino en la superficie del vidrio de cubierta, a temperatura ambiente.<ol>
<li>Enjuague el cubreobjetos con agua desionizada.</li>
		<li>Seque el cubreobjetos con gas nitrógeno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sumerja el cubreobjetos APTES modificado en 5% (v/v), 10 mL de solución de glutaraldehído en 10 mM de tampón fosfato (pH 7,4) por 2 h para activar los grupos aminos en la superficie, a temperatura ambiente6,15.<ol>
<li>Enjuague el cubreobjetos con 10 mM de tampón fosfato (pH 7,4) para quitar glutaraldehído al exceso de la superficie.</li>
		<li>Seque el cubreobjetos con gas nitrógeno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar 1,0 mL de solución de plantilla (proteína/bacteriófago) de 10 mM de tampón fosfato (pH 7,4) en concentración de 0,1 mg/mL. Nota: Disolver 0.1 mg de proteína en 1,0 mL de tampón fosfato (10 mM, pH 7,4). Si es necesario, un espectrofotómetro (280 nm) puede utilizarse para determinar la concentración de proteína.<ol>
<li>200 μL de esta solución de plantilla sobre el cubreobjetos modificadas de la gota e incubar a 4 ° C durante la noche. Nota: La solución sobrante de plantilla se puede utilizar para preparar 1-2 más sellos de la plantilla para ser utilizado en los estudios de caracterización.</li>
		<li>Enjuague el cubreobjetos con 10 mM de tampón fosfato (pH 7,4) con el fin de quitar la plantilla de independiente de la superficie. Nota: Para enjuagar los electrodos, lavarlos con tampón fosfato (10 mM, pH 7.4) durante 30 s.</li>
		<li>Seque el cubreobjetos con gas nitrógeno. Nota: El cubreobjetos deben almacenarse a 4 ° C hasta su uso en el paso de la polimerización.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. modificación de electrodos de oro capacitivos
<ol><li>Para limpiar los electrodos, sumerja los electrodos en un vaso de precipitados pequeño, que contiene 5 mL de etanol (70%), agua desionizada, acetona, agua desionizada, solución ácida Piraña (3:1, H2SO4: H2O2, v/v) y desionizada agua, respectivamente por 10 min en cada paso, en un limpiador ultrasónico a temperatura ambiente.<ol>
<li>Secar los electrodos con gas nitrógeno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para llevar a cabo la electropolymerization de tiramina, preparar 8 mL de solución de tiramina de 10 mM en 10 mM fosfato tampón (pH 7.4) que contiene etanol (2 mL)15. Nota: El volumen total de la solución de tiramina debe ser 8 mL en total incluyendo 2 mL de etanol.<ol>
<li>Realizar análisis voltamétricos cíclicas (15 ciclos) en esta solución utilizando un potenciostato que cubre un potencial rango de 0 - 1,5 V (Ag/AgCl) y una frecuencia de barrido de 50 mV/s30.</li>
		<li>Enjuague los electrodos con agua desionizada.</li>
		<li>Secar los electrodos con gas nitrógeno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sumerja los electrodos en una solución que contiene cloruro de acryloyl de 30 mM y 30 mM trimetilamina en tolueno (Vtotal = 5 mL) a temperatura ambiente durante la noche6,15,30.<ol>
<li>Enjuague los electrodos con agua desionizada. Nota: Para asegurar una mejor remoción de acryloyl residuos de cloruro y trimetilamina, también es posible lavar la superficie con NaOH después de agua desionizada.</li>
		<li>Secar los electrodos con gas nitrógeno.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. elaboración de plantilla impresa capacitivos electrodos de oro
<ol><li>
Preparación de bacteriófago impresos electrodos capacitivos de oro
	<ol>
<li>Antes de la polimerización, preparar una solución de monómero que contiene monómeros (acrilamida de N-hidroximetil) y vinculante (Dimetacrilato de polietilenglicol 400) en una proporción de 1:5 (mol/mol) en 1 mL de tampón fosfato 10 mM (pH 7,4). Nota: La solución de monómero que contiene monómero y vinculante puede utilizarse en diferentes proporciones, o los tipos de monómero y vinculante pueden ser cambiados según la plantilla para la optimización de la interacción específica.</li>
		<li>Añadir 1 mg de foto-iniciador en esta solución. Nota: Si la polimerización se realiza bajo luz UV, entonces el foto iniciador debe usarse para iniciar la polimerización. Si la polimerización se realiza por polimerización de radicales libres, se debe cambiar el tipo de iniciador.</li>
		<li>Pipetear 1,5 μl de esta solución sobre la superficie de oro del electrodo de oro modificado. Nota: La superficie del electrodo de oro se muestra esquemáticamente en la figura 1.</li>
		<li>Llevar el sello de la plantilla en contacto con la solución del monómero en la parte superior de la superficie del electrodo de oro.</li>
		<li>Iniciar la polimerización UV (365 nm, 400 W) y continuar durante 15 minutos31. Nota: Polimerización UV se realiza dentro de un gabinete de enfriamiento que se encuentra a-25 ° C antes de iniciar la polimerización. A continuación, se enciende la luz de UV sistema de curado y la polimerización se continúa durante 15 minutos antes de apagar la luz UV sistema de curado.</li>
		<li>Quitar el sello de la plantilla de la superficie mediante el uso de fórceps. Nota: Al quitar el sello de la plantilla de la superficie, puede dañarse la película polimérica en la superficie. Por lo tanto, el sello debe retirarse de la superficie muy cuidadosamente y lentamente sin usar la fuerza.</li>
		<li>Enjuagar la superficie del electrodo con agua desionizada y secarla con gas nitrógeno.</li>
		<li>Sumerja los electrodos en 1 mL de 10 mM 1-dodecanethiol preparado en etanol por 20 min para cubrir agujeros en la superficie del electrodo.</li>
		<li>Enjuague los electrodos con agua desionizada y secar los electrodos con gas nitrógeno.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparación de la proteína impresos electrodos capacitivos de oro
	<ol>
<li>Antes de la polimerización, preparar una solución de monómero que contiene monómeros (acrilamida: 54 mg; N-hydroxymethylacrylamide: 140 μl; N-isopropylacrylamide: 85,6 mg) y vinculante (Metilenbisacrilamida: 9,5 mg) en 820 μl de agua ultra pura30,32.</li>
		<li>Preparar 5% (v/v) N, N, N', N'-tetramethylethyldiamine (TEMED) en agua ultra pura.</li>
		<li>Añadir 20 μl de la solución TEMED en la solución de monómero y purgar con gas de nitrógeno durante 5 minutos.</li>
		<li>Preparar el persulfato de amonio 10% (p/v) (APS) en agua ultra pura.</li>
		<li>Añadir 20 μl de la solución de la APS en la solución de monómero.</li>
		<li>Pipetear 1,5 μl de la solución del monómero en el electrodo de oro modificado.</li>
		<li>Llevar el sello de la plantilla en contacto con la superficie tratada con monómero.</li>
		<li>Iniciar la polimerización a temperatura ambiente y continuar durante 5 h. Nota: Para la preparación de electrodos de oro impresa de proteína, en lugar de UV-polimerización, polimerización de radicales libres a temperatura ambiente (25 ° C) se realiza utilizando APS-TEMED como el catalizador iniciador.</li>
		<li>Retire el sello de la plantilla de la superficie cuidadosamente con unas pinzas.</li>
		<li>Enjuague el electrodo con agua desionizada y seque con gas nitrógeno.</li>
		<li>Sumerja los electrodos en 1 mL de 10 mM 1-dodecanethiol preparado en etanol por 20 min para cubrir agujeros en la superficie del electrodo.</li>
		<li>Enjuague los electrodos con agua desionizada y secar los electrodos con gas nitrógeno.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Caracterización de la superficie del electrodo con microscopía electrónica de barrido (SEM)
<ol><li>Montar a las muestras en los soportes de aluminio con cinta adhesiva carbono.</li>
	<li>Recubrir los electrodos con 10 nm paladio y oro.</li>
	<li>Examinar los electrodos con SEM.</li>
</ol>5. en tiempo real medidas capacitivas con plantilla imprimen capacitivos electrodos de oro
<ol><li>Inserte los electrodos de oro capacitivos impresos en la celda electroquímica de flujo integrada a un biosensor capacitivo.</li>
	<li>Preparar 100 mL de tampón de regeneración (glicina-HCl 25 mM, pH 2.5, incluyendo 50 mM Tween-20) y 1 L de tampón de corriente (para bacteriófago impresos sistema: fosfato 10 mM, pH 7,4; para el sistema impreso de proteína: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4).</li>
	<li>Iniciar el análisis con la inyección de búfer de regeneración para regenerar el sistema y el buffer corriente para volver a equilibrar el sistema durante 25 minutos.</li>
	<li>Preparar soluciones de plantilla estándar en la gama de la concentración deseada en el almacenador intermediario de funcionamiento. Nota: Primero preparar un balance de la solución de plantilla disolviendo 0,1 mg de proteína, o aproximadamente 108 pfu bacteriófagos, en 1,0 mL de tampón de fosfato (fosfato 10 mM, pH 7,4). Luego, preparar las soluciones estándar para la curva de calibración poniendo diez diluciones secuenciales de 10 veces de la solución. Estas soluciones se analizarán con el biosensor capacitivo en paso 5.5. Concentración de la proteína puede medirse utilizando un espectrofotómetro (280 nm). Para medir la concentración de bacteriófago, puede utilizarse un método de doble capa de agar, que se describe en detalles anteriormente19.</li>
	<li>Inyecte 250 μl de estas soluciones estándar secuencialmente en el sistema en óptimas condiciones (caudal: 100 μl/min, temperatura: 25 ° C). Nota: En esta aplicación, las proteína estándar se prepararon las soluciones en el intervalo de concentraciones de 1.0 x 10-4 - 1.0 x 10-14, mientras que las concentraciones de bacteriófago en la gama 1.0 x 101 - 1.0 x 105 pfu/mL. Las soluciones fueron colocadas en la válvula de inyección y secuencialmente se inyecta en el sistema, inyectando las muestras en triplicado a través de la bomba de jeringa sola y la válvula selectora. La disminución de la capacitancia después de la inyección de las soluciones patrón derivadas de la Unión de la plantilla a las cavidades impresas se controla automáticamente por el software del instrumento.</li>
</ol>

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<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Salmonella+Typhimurium+on+Spinach+Using+Phage-Based+Magnetoelastic+Biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+%28Basel%2C+Switzerland%29%22%5BJournal%5D)">Detection of Salmonella Typhimurium on Spinach Using Phage-Based Magnetoelastic Biosensors.</a> Sensors (Basel, Switzerland). 17 (2), (2017).</li>
<li>Chin, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://ieeexplore.ieee.org/document/7796241/">Rapid detection of small quantities of specific bacteria using phage-based wireless biosensors.</a> 2016 10th International Conference on Sensing Technology (ICST). , 1-5 (2016).</li>
<li>Park, M. -K., Chin, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Approach+of+a+Phage-Based+Magnetoelastic+Biosensor+for+the+Detection+of+Salmonella+enterica+serovar+Typhimurium+in+Soil%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Novel Approach of a Phage-Based Magnetoelastic Biosensor for the Detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium in Soil.</a> Journal of Microbiology and Biotechnology. 26 (12), 2051-2059 (2016).</li>
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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Cuando este método se lleva a cabo, hay algunos pasos críticos que deben ser considerados siguiendo el protocolo. Un paso crítico es el paso de limpieza con solución ácida de piraña. Paso 2.1 debe no ser más de 10 minutos. La solución de la plantilla de paso 1.4 no debe exceder 0,1 mg/mL, ya que estos valores se han optimizado previamente. Análisis cíclico voltametric no deben exceder 15 ciclos para obtener el grueso óptimo. Paso 3.1.3, 1,5 μl es un valor optimizado. Este valor no debe ser mayor para este tipo de electrodo. Si el sistema de curado de UV tiene una potencia de 400 W, la polimerización debe realizarse por un máximo de 10-15 minutos. Tan pronto como el APS (iniciador) se agrega a la solución después de TEMED, el paso posterior se debe realizar muy rápidamente para evitar la polimerización inmediata (paso 3.2.5).
Uno de los pasos más importantes es la eliminación de la estampilla de la plantilla de la superficie después de la polimerización UV. Si este paso no se realiza correctamente, existe el riesgo de que la película polimérica en la superficie del electrodo puede ser eliminado con el sello. Por lo tanto, se recomienda sumergir el electrodo y el sello de la proteína en la parte superior en una solución de agua después de la polimerización, a continuación, retire el sello muy lentamente y con cuidado la superficie (paso 3.1.6).
Basado en la plantilla utilizada, modificaciones en el tipo y la proporción de monómeros utilizados (monómero funcional y vinculante) pueden evaluarse en términos de generar mayor sensibilidad. Esto debe determinarse empíricamente. Además, la afinidad de unión de la molécula de la plantilla generalmente implica varias interacciones diferentes simultáneamente. Por lo tanto, esto puede llevar a problemas durante los pasos de regeneración. Si la plantilla dependiente no se suelta de la superficie correctamente, esto puede influir en la reutilización del electrodo para su posterior análisis. Estas afinidades multipuntos también pueden resultar del enlace a través de las interacciones más débiles. En tales sistemas, fijación no específica puede tener lugar, que puede influir negativamente en la selectividad del sistema16. Estas son comunes y generales, limitaciones del método.
Aparte de estas limitaciones específicas, hay muchas ventajas importantes del método discutido sobre los métodos existentes. Mientras que la medición fluorométrica, RIAs y ELISA es muy sensibles, requieren el uso de material marcado (plantilla o detector), mientras que el biosensor es totalmente etiqueta libre. Estos métodos también son más costosos y lentos. Un biosensor permite síntesis rápida y paralela de MIPs en diversas composiciones en el mismo tiempo16. Ya que sólo unos pocos microlitros de solución de monómero se requiere para la preparación, el método es conveniente cuando se utiliza monómeros limitadas caros o no. Electrodos de MIP más, solos pueden utilizarse para aproximadamente 80 análisis sin una disminución significativa en el rendimiento, que es significativamente mayor que otros de los métodos existentes30. Los métodos existentes también sufren, en diversos grados, de baja sensibilidad y selectividad, mientras que el método descrito permite la detección y cuantificación de moléculas en el rango de pM con alta selectividad.
Debido a la rentabilidad, la facilidad de operación del instrumento y la detección sensible en tiempo real en un corto tiempo en comparación con los métodos existentes, los biosensores son muy prometedor punto de sistemas de detección de cuidado bajo condiciones de campo; por ejemplo, para monitoreo del medio ambiente y para aplicaciones en los países en desarrollo. En muchas aplicaciones en el diagnóstico de la enfermedad, la detección en tiempo real, sensible, selectiva y rápida de un biomarcador en una mezcla compleja como suero es necesario15,25. Aquí, biosensores son superiores a los métodos existentes, en particular, debido a su robustez y sensibilidad. Específicamente para la detección de agentes infecciosos, bacteriófagos son considerados recientemente como elemento de biorreconocimiento alternativos para biosensores debido a su anfitrión bacterias especificidad33,34,35. Reemplazo de anticuerpos con bacteriófagos es muy prometedor para reducir el costo y aumentar la estabilidad aún más36. Este sistema permitirá también la detección y cuantificación de fagos específicos en el medio ambiente y de muestras clínicas. Debido a la prevalencia de bacteriófagos y su capacidad de transducir las bacterias con genes de resistencia a los antibióticos37,38, este método puede ser valioso estudiar la propagación de bacterias resistentes.

La cuantificación de biomoléculas se utiliza en muchos campos de investigación dentro de la ciencia, empleando métodos como el radioinmunoanálisis (RIA) o ELISA1. Algunos de estos métodos requieren un etiquetado reactivo como un radioisótopo o enzima marcado antígeno anticuerpo, que hace que requieren mucho trabajo y tiempo con procedimientos complejos2. Además, la robustez, la selectividad y la sensibilidad de estos métodos no son suficientes para todos los análisis; en particular no son suficientes cuando nanogramo cantidades necesitan ser analizados, en lugar de pictograma cantidades3. Para ello, biosensores han ganado considerable interés4,5, en particular en combinación con impresión molecular para una mayor robustez.
Impresión molecular se basa en la creación de cavidades polimerizando monómeros funcionales alrededor de la plantilla6, creación de sitios de reconocimiento artificial que recuerdan perfectamente a la plantilla7. Esta técnica se ha utilizado para varias aplicaciones, incluyendo sistemas de entrega de fármacos y la separación analítica, sino también como elementos de bioreconocimiento en biosensores8,9,10. Sin embargo, todavía hay algunas dificultades en el diseño de polímeros molecularmente impresos (MIPs) para las plantillas de macromoléculas como proteínas y células de11,12. Debido a esto, muchos investigadores se han centrado en impresión la proteína de la plantilla directamente sobre un substrato, creando así una superficie que será reconocida por la proteína blanco del12. Esta técnica de recubrimiento utilizada para emplear las cavidades reconocimiento asambleas incluyendo proteínas y grandes moléculas se llama capas impresión13,14. El procedimiento general del método depende de la polimerización entre dos superficies - un sello de plantilla y un soporte de polímero - que la plantilla es adsorbida sobre una superficie de15,16y en contacto con el superficie tratada con monómero. De esta forma, se forma una película delgada de polímero sobre el soporte mediante polimerización UV. Finalmente, se retira la plantilla, dejando cavidades específicas de plantilla en la superficie del electrodo impreso. Este método tiene algunas ventajas como una pérdida de la actividad reducida de la molécula del impresa, así como que requiere cantidades muy pequeñas de moléculas de plantilla para la impresión de procesan16,17. Así, se pueden crear estas superficies rentables, estables, sensibles y selectivas en la superficie del sensor, dirigidos a cualquier plantilla de elección del usuario.
El biosensor se puede utilizar para la detección de proteínas solo y biomacromoléculas mucho más grandes, incluyendo virus. Un grupo específico de virus ganando interés reciente es el bacteriófago, que es un virus que infecta bacterias. Detección rápida y sensible de los bacteriófagos es importante durante biotecnológica y biofarmacéutica procesos para determinar las infecciones de los cultivos bacterianos con bacteriófagos18. El ensayo biológico más utilizado para la detección de bacteriófagos es el método de agar de doble capa de19, que es laborioso y consume tiempo. Se hicieron varios intentos para desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico para virus (incluidos los bacteriófagos) como fuerza atómica (AFM) la microscopia20, interferometría21, electroquímica22sensor sistema23, 24. mucho trabajo se ha centrado en biosensores debido a sus ventajas como ser fáciles de operar, muy sensible y capaz de medición en tiempo real15,25. Un tipo específico de biosensor se basa en cambios en la capacitancia. Estos biosensores capacitivos son los sensores electroquímicos que medir los cambios en las propiedades del dieléctricas cuando un analito se interactúa con un elemento de biorreconocimiento sobre la superficie del sensor, causando una disminución en la capacitancia2,4 . Capacitivas biosensores se han utilizado para la detección de varios analitos como antígenos, anticuerpos, proteínas, metales pesados iones6,26,27,28. Estos tipos de biosensores tienen muchas ventajas como la rapidez inherente, alta sensibilidad, simplicidad, bajo costo, fácil manipulación y medición en tiempo real sin etiquetado29.
El método descrito en este documento está dirigido a permitir la detección y cuantificación de biomoléculas baja abundante en muestras muy complejas, sin la necesidad de utilizar ningún etiquetado. En particular, la técnica es más útil en el rango del picogramo atto de biomoléculas, donde otros instrumentos comercialmente existentes fallan cuantificar con precisión su objetivo.

<table><tbody><tr><td>Cubrecristales</td><td>ThermoFisher</td><td>102222</td><td>sello de proteína</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-500ML</td><td>limpieza</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068-100ML</td><td>limpieza</td></tr><tr><td>Limpiador ultrasónico</td><td>Branson Ultrasonic</td><td>BRANSONIC M1800- E</td><td>limpieza</td></tr><tr><td>3-amino-propil-trietoxisilano (APTES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648-100ML</td><td>modificación</td></tr><tr><td>EtOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1009836010</td><td>enjuague/limpieza</td></tr><tr><td>glutaraldehído Sigma-Aldrich</td><td></td><td>G5882-100ML</td> acetona <td>reticulante</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34850-1L-M</td><td>limpieza</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339741-100ML</td> solución de <td>piraña</td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-500ML</td><td>piraña solución</td></tr><tr><td>tiramina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T90344-5G</td><td></td></tr><tr><td>modificación CompactStat</td><td>Ivium Technologies</td><td>CompactStat.h: Kit</td> de contraelectrodo de platino <td>de potenciostato</td>de 30mA@10V/3MHz</tr><tr><td></td><td>Equilabrium</td><td>AFCTR5</td><td></td></tr><tr><td>Referencia Electrodo</td><td>Equilabrium</td><td>RREF0021</td><td>potenciostato</td></tr><tr><td>cloruro de acriloilo</td><td>EMD Millipore</td><td>8.00826.0100</td><td></td></tr><tr><td>trietilamina</td> de modificación <td>EMD Millipore</td><td>8.08352.0100</td><td></td></tr><tr><td>tolueno</td> de modificación <td>Sigma-Aldrich</td><td>244511-100ML</td><td>modificación</td></tr><tr><td>N-hidroximetilacrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>245801-100G</td><td>monómero funcional</td></tr><tr><td>polietilenglicol-400-dimetacrilato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>409510-250ML</td><td>reticulante</td></tr><tr><td>2-Hidroxi-4&prime;-(2-hidroxietoxi)-2-metilpropiofenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>410896-50G</td><td>monómero funcional</td></tr><tr><td>polimerizador UV</td><td>Dymax</td><td>Dymax 5000ECE</td> pinza <td>de polimerización UV</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z168777-1EA</td><td>consumible</td></tr><tr><td>1-dodecanetiol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>471364-100ML</td><td>agente bloqueante</td></tr><tr><td>acrilamida</td><td>Monómero funcional</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553-100G</td></tr><tr><td>N-hidroximetilacrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>245801-100G</td><td>monómero funcional</td></tr><tr><td>N-isopropilacrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415324-50G</td><td>monómero funcional</td></tr><tr><td>metilenebisacrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>146072-500G</td><td>monómero de reticulación</td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametiletilamina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281-25ML</td><td></td></tr><tr><td>catalizador persulfato de amonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678-25G</td><td>iniciador</td></tr><tr><td>Biosensor capacitivo</td><td>Equipo CapSenze</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Merck</td><td>1042011000</td><td>tampón de regeneración</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td>tampón de regeneración</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93352-1KG</td><td>tampón de funcionamiento</td></tr><tr><td>Na2HPO4&nbsp; y toro; 2H2O</td><td>Calbiochem</td><td>567547-1KG</td><td>tampón de funcionamiento</td></tr><tr><td>NaH2PO4&nbsp; y toro; 2H2O</td><td>Calbiochem</td><td>567549-1KG</td><td>tampón</td></tr> de <tr><td>funcionamiento Microscopio correlativo de luz y electrones DELPHI</td><td>Equipo Phenom-World</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Electrodos de oro capacitivos</td><td>CapSenze Biosystems</td><td></td><td>consumibles</td></tr><tr><td>2,2'-azobis(2-metilipropionitrilo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441090-25G</td><td>fotoiniciador</td></tr><tr><td>CapSenze Smart Software</td><td>CapSenze </td><td>Programa de software</td> de Biosystems <td></td></tr></tbody></table>

detección ultrasensible de biomarcadores utilizando una impresión molecular basado biosensor capacitiva

Ultrasensitive Detection of Biomarkers by Using a Molecular Imprinting Based Capacitive Biosensor

La capacidad para detectar y cuantificar biomoléculas en soluciones complejas siempre ha sido codiciada dentro de la ciencia natural; se utiliza para la detección de biomarcadores, contaminantes y otras moléculas de interés. Una técnica comúnmente utilizada para este propósito es la enzima-ligado del inmunosorbente ensayo (ELISA), donde a menudo un anticuerpo está dirigido hacia una molécula objetivo específico, y un segundo anticuerpo marcado se utiliza para la detección del anticuerpo primario, permitiendo la cuantificación absoluta de la biomolécula bajo estudio. Sin embargo, el uso de anticuerpos como elementos de reconocimiento limita la robustez del método; como la necesidad de la utilización de moléculas marcadas. Para superar estas limitaciones, se ha implementado impresión molecular, creación de sitios de reconocimiento artificial complementaria a la molécula de la plantilla y obsoleting la necesidad del uso de anticuerpos para el enlace inicial. Además, para mayor sensibilidad, el anticuerpo secundario marcado puede reemplazarse por biosensores confiando en la capacidad para la cuantificación de la molécula objetivo. En este protocolo, se describe un método para rápidamente y sin etiqueta de detectar y cuantificar biomoléculas baja abundante (virus y proteínas) en muestras complejas, con una sensibilidad que es significativamente mejor que los sistemas de detección utilizados como el ELISA. Todo esto es mediado por impresión molecular en combinación con un biosensor de capacitancia.

Siguiendo el protocolo, según el esquema en la figura 1, un electrodo de oro desnudo a ser impreso con una plantilla, que representa la estructura de un biomacromolecule. Este electrodo se puede aplicar en un biosensor capacitivo (figura 2), permitiendo la aplicación estable de una plantilla sobre el electrodo y la medición de los cambios en capacitancia sobre la Unión de la plantilla.
Una representación esquemática del biosensor capacitiva se muestra en la figura 2. La bomba de centris, que se encarga de inyección continua del corriente tampón (fosfato 10 mM, pH 7,4) y el búfer de regeneración (glicina-HCl 25 mM, pH 2.5) durante la regeneración en la célula de flujo, puede verse claramente en la figura. La célula de flujo consiste en trabajo, referencia y electrodos de contador. La válvula de inyección se compone de soluciones estándar de la proteína/del bacteriófago, que pasan por el desgaseador primero y luego se inyectan secuencialmente en el sistema. En cuanto a las soluciones de alcanzan el electrodo de trabajo insertado en la celda de flujo, el resultado es monitoreado en tiempo real. Los valores de capacitancia pueden ser registrados siguiendo el sensorgrams en la pantalla del ordenador.
Figura 3 y figura 4 representan las diferencias entre la superficie de electrodos de oro desnudos e impresos. Este paso de caracterización es importante garantizar que existen cavidades poliméricas, vistas como rugosidad en la superficie del electrodo después de impresión. Aparte de SEM, también hay otros métodos de caracterización como AFM, mediciones del ángulo de contacto, Elipsometría, etc., que pueden utilizarse para caracterizar la superficie después de la impresión. De esta forma, se puede asegurar que el proceso de impresión es acertado y que las cavidades de la plantilla se forman en la superficie. Dentro de estas cavidades, puede enlazar la plantilla con afinidad y especificidad alta.
Después de la inyección de las soluciones estándar en el sistema capacitivo, un promedio de las cinco últimas lecturas fue calculado automáticamente por el software, y se obtuvieron las gráficas de calibración trazando el cambio en capacitancia vs la concentración de la analito. La disminución de la capacitancia registrada surgió de la Unión de la plantilla. El más moléculas que se unen al electrodo de oro superficial, cuanto mayor sea la reducción de la capacidad total, según el principio general de medición capacitiva. Figura 5 y figura 6 muestran que con el aumento de concentración del analito, la ΔC aumenta como se esperaba. El rango dinámico (entre los cuales es el intervalo de concentraciones donde el sistema es útil para la detección de un objetivo específico) y el límite de detección (LOD) pueden ser evaluados mediante el análisis de estos gráficos. Según la figura 6, el biosensor capacitiva bacteriófago impreso puede detectar bacteriófagos en el rango de concentración de 101 - 105 pfu/mL, con un valor LOD de 10 pfu/mL en este estudio. Figura 5 y figura 6 también destaca la necesidad de medir la curva de calibración en el mismo intervalo requerido para la concentración de la plantilla se supone, puesto que la linealidad de la regresión puede variar con las concentraciones ( Figura 5), o tienen diferentes pendientes (figura 6). También hay que señalar que debido a las bajas concentraciones utilizado, el sistema es muy sensible a las fluctuaciones (turbidez en la muestra, guinda, etc.), y por lo tanto, se recomienda realizar por lo menos triplicado para reducir la posibilidad de incluir valores atípicos . Por la misma razón, la desviación estándar puede ser bastante significativa para las muestras muy diluidas, como se ve en la figura 6.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig1.jpg"> Figura 1 . Representación esquemática de las capas de impresión método. (A) preparación de los cubreobjetos de vidrio (estampillas de plantilla), (B) preparación de los electrodos capacitivos de oro, impresión de capas (C) de la plantilla sobre la superficie del electrodo de oro mediante polimerización UV y (D) retiro de plantilla de la superficie del electrodo (reproducido de Ertürk et al., biotecnología informes 2014 (3): 65-72 con permiso). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig2.jpg"> Figura 2. Representación esquemática del biosensor capacitivo. La disposición general del biosensor capacitivo utilizado en este estudio (reproducido de Ertürk et al., biotecnología informes 2014 (3): 65-72 con permiso). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig3.jpg"> Figura 3. Microscopía electrónica de la proteína impresos electrodos. Imágenes de SEM de (A) un electrodo desnudo de oro (barra de escala = 20 μm), y (B) una proteína impreso Electrodo capacitivo de oro (barra de escala = 10 μm). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig4.jpg"> Figura 4. Microscopía electrónica del bacteriófago impresos electrodos. Imágenes de SEM de un electrodo desnudo de oro (barra de escala = 20 μm) (A), y grabada de un bacteriófago Electrodo capacitivo de oro en diferentes aumentos (6600 x, barra de escala = 10 μm) (B) y 11, 500 X, escala de la barra = 5 μm) (C); las flechas denotan bacteriófagos adheridos). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig5.jpg"> Figura 5. Efecto de la composición del tampón para gráficos de calibración. Curva de calibración que muestra el cambio en capacitancia vs concentración de proteína en condiciones óptimas (almacenador intermediario de funcionamiento: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; Búfer de regeneración: 25 mM glicina-HCl, pH 2.5 incluyendo 50 mM Tween-20; Caudal: 100 μl/min, volumen de muestra: 250 μl; T: 25 ° C). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57208/57208fig6.jpg"> Figura 6. Curva de calibración representativos para grandes biomacromoléculas. Curva de calibración que muestra el cambio en capacitancia vs concentración de bacteriófago en óptimas condiciones (almacenador intermediario de funcionamiento: 10 mM fosfato, pH 7,4; Búfer de regeneración: 25 mM glicina-HCl, pH 2.5 incluyendo 50 mM Tween-20; Caudal: 100 μl/min, volumen de muestra: 250 μl; T: 25 ° C) <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57208/57208fig6large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí, presentamos un protocolo para la detección y cuantificación de moléculas abundantes bajas en soluciones complejas usando molecular imprinting en combinación con un biosensor de capacitancia.

Detección ultrasensible de biomarcadores utilizando una impresión Molecular basado Biosensor capacitiva

The ability to detect and quantitate biomolecules in complex solutions has always been highly sought-after within natural science; being used for the ...

El objetivo general de esta técnica es detectar y cuantificar biomoléculas de baja abundancia en muestras altamente complejas con alta sensibilidad, simplicidad, bajo costo, velocidad y sin el uso de ningún etiquetado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la biotecnología, la bioquímica y la biomedicina, como el monitoreo ambiental, la seguridad alimentaria, la calidad del agua potable y el diagnóstico médico. Las principales ventajas de esta técnica son su rapidez inherente, simplicidad, alta sensibilidad, bajo costo, fácil manipulación y detección en tiempo real sin usar ningún reactivo de etiquetado.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico de enfermedades debido a su capacidad para cuantificar biomoléculas poco abundantes. Por ejemplo, diferentes biomarcadores en tiempo real. Para limpiar los cubreobjetos de vidrio, sumérjalos en 10 mililitros de HCl 1.0 molar durante 10 minutos en un limpiador ultrasónico a temperatura ambiente.Luego, sumérjalos en agua desionizada e hidróxido de sodio 1.0 molar en las mismas condiciones. Seque los cubreobjetos de vidrio con gas nitrógeno. A continuación, sumerja los cubreobjetos limpios y secos en 10 mililitros de una solución APTES durante una hora para introducir grupos amino en la superficie del cubreobjetos a temperatura ambiente.Enjuague los cubreobjetos con agua desionizada antes de volver a secarlos con gas nitrógeno. Sumerja los cubreobjetos modificados APTES en una solución de 10 mililitros de glutaraldehído durante dos horas para activar los grupos amino de la superficie a temperatura ambiente. Después de la incubación, enjuague los cubreobjetos con tampón de fosfato de 10 milimolares para eliminar el exceso de glutaraldehído de la superficie.Seque los cubreobjetos con gas nitrógeno. A continuación, prepare 1,0 mililitro de solución molde en tampón de fosfato de 10 milimolares en una concentración de 0,1 miligramos por mililitro. Deje caer 200 microlitros de esta solución de plantilla en los cubreobjetos modificados e incube a cuatro grados centígrados durante la noche.Para limpiar los electrodos, primero sumerja los electrodos en un pequeño vaso de precipitados que contenga cinco mililitros de etanol al 70% durante 10 minutos en un limpiador ultrasónico a temperatura ambiente. Luego, sumerja secuencialmente los electrodos en agua desionizada, acetona, agua desionizada, solución ácida de piraña y agua desionizada en las mismas condiciones. Seque los electrodos con gas nitrógeno.Para realizar la electropolimerización de la tiramina, prepare ocho mililitros de solución de tiramina 10 milimolares en tampón de fosfato 10 milimolar que contenga dos mililitros de etanol. Realice 15 ciclos de escaneos voltamperométricos cíclicos en esta solución utilizando un potenciostato que cubre un rango de potencial de cero a 1,5 voltios y una velocidad de escaneo de 50 milivoltios por segundo. Luego, enjuague los electrodos con agua desionizada antes de secar los electrodos con gas nitrógeno.Sumerja los electrodos en una solución que contenga 30 milimolares de cloruro de acriloilo y 30 milimolares de trimetilamina en tolueno a temperatura ambiente durante la noche antes de enjuagar y secar los electrodos nuevamente. Antes de la polimerización, prepare una solución de monómero que contenga monómeros y reticulante en 820 microlitros de agua ultrapura. A continuación, prepare el 5%volumen a volumen TEMED en agua ultrapura.Agregue 20 microlitros de la solución TEMED en la solución de monómero y purgue con gas nitrógeno durante cinco minutos. Luego, agregue 20 microlitros de APS recién preparado en la solución de monómero. Pipetear 1,5 microlitros de la solución de monómero sobre la superficie del electrodo de oro modificado.Ahora, comience la polimerización poniendo el sello de plantilla en contacto con la superficie tratada con monómero y déjelo durante cinco horas a temperatura ambiente. Después de la polimerización, retire el sello de plantilla de la superficie con cuidado, utilizando pinzas. A continuación, enjuague el electrodo con agua desionizada y séquelo con gas nitrógeno.Sumerja los electrodos en un mililitro de diez milímetros de un dodecanateol preparado en etanol durante veinte minutos para cubrir los agujeros de la superficie del electrodo. Finalmente, enjuague los electrodos con agua desionizada y seque los electrodos con gas nitrógeno antes de caracterizar sus superficies con microscopía electrónica de barrido. Inserte los electrodos de oro capacitivos impresos en la celda de flujo electroquímico integrada a un biosensor capacitivo.Prepare 100 mililitros de tampón de regeneración y un litro de tampón de funcionamiento. Inicie el análisis con la inyección de tampón de regeneración para regenerar el sistema y tampón en ejecución para reequilibrar el sistema durante 25 minutos. Prepare soluciones de plantilla estándar en el rango de concentración deseado en el tampón de ejecución.A continuación, inyecte 250 microlitros de estas soluciones estándar de forma secuencial en el sistema en condiciones óptimas. La caracterización de la superficie de los electrodos de oro se realiza mediante microscopía electrónica de barrido. Se muestra la superficie de oro desnudo.También se muestran bacteriófagos adheridos a la superficie del electrodo en diferentes aumentos. Aquí se muestra la unión de bacteriófagos en tiempo real al electrodo de oro impreso a través de un senograma. Se establece una línea de base estable después de la regeneración y el reequilibrio del sistema antes de la inyección de la muestra.Hay cavidades específicas de fagos en el electrodo. La inyección de los bacteriófagos inductores de muestras da como resultado una capacitancia reducida, debido a la unión de los bacteriófagos objetivo a las cavidades impresas en la superficie de los electrodos de oro. Las curvas de calibración muestran el cambio de capacitancia frente a la inyección de proteínas en la inyección de bacteriófagos.A partir de las ecuaciones de estos gráficos, es posible calcular la concentración de bacteriófago o proteína en una muestra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar un sistema de detección ultrasensible, rápido y en tiempo real. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas y treinta minutos, excluyendo los tiempos de espera intermedios.Al intentar este procedimiento, es importante preparar todos los agentes frescos, en el mismo día. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras métricas como la microscopía de fuerza atómica, la microscopía electrónica de barrido, el elipsómetro y las mediciones de ángulos cuánticos para determinar si la polimerización o la impresión fueron exitosas y para detectar cualquier diferencia significativa entre las superficies de los electrodos de oro desnudos e impresos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la bioquímica, la biotecnología y la biomedicina exploraran una detección ultrasensible de una biomolécula en la seguridad alimentaria y el diagnóstico médico.No olvide que trabajar con monómeros funcionales, reticulantes, iniciadores y otros agentes puede ser extremadamente peligroso. Y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes, batas de laboratorio y la realización de los experimentos de polimerización dentro de la campana extractora mientras se realizan estos experimentos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Un protocolo para detectar tricotecenos (micotoxinas de interés para la salud humana), utilizando un método de selección de nuevo desarrollo basado en un método competitivo inmunoquímica y un final de la detección electroquímica se demuestra.

ELIME (Enzyme Linked Inmuno magnética químicos) Método para la detección de micotoxinas

Magnética modulación del sistema de biosensores se utiliza a la rápida, sensible y simplemente detectar ensayos biológicos, como las moléculas de ADN y las proteínas.

Detección rápida homogénea de Ensayos Biológicos Usando el Sistema de modulación magnética biosensores

Este video muestra un método para detectar y cuantificar transmisores de péptidos utilizando un biosensor de inmunosonda capacitivo. El electrodo funcionalizado, recubierto con anticuerpos, interactúa con los péptidos de interés, lo que provoca un cambio de señal que permite una medición y detección precisas de los péptidos.

Detección y medición de péptidos diana mediante un biosensor de inmunosonda capacitiva

Se presenta un biochip electroquímico basado en microfluídico para la detección de la hibridación de ADN. Tras ssDNA sonda funcionalización, la especificidad, sensibilidad y límite de detección se estudian con objetivos ssDNA complementarias y no complementarias. Resultados ilustran la influencia de los eventos de hibridación de ADN en el sistema electroquímico, con un límite de detección de 3,8 nM.

Un biochip electroquímico basado en microfluidos para el análisis de hibridación ADN-Label libre

En este trabajo se presenta un nuevo método para estudiar las interacciones de la proteína-proteína usando un biosensores conductimétricos basados en la tecnología híbrida de β-lactamasa. Este método se basa en la liberación de protones al producirse la hidrólisis de β-lactámicos.

El uso de un análisis de biosensores conductimétricos β-lactamase-base para detectar las interacciones biomoleculares

Este trabajo describe un método de litografía de nanoimprinting para fabricar matrices de detección alta calidad que trabajan en el principio de transmisión óptica extraordinaria. El biosensor es bajo costo, robusto, fácil de usar y puede detectar troponina I en suero en concentraciones clínicamente relevantes (99th percentil corte ∼10-400 pg/mL, según el ensayo).

Uso de transmisión óptica extraordinaria para cuantificar marcadores cardíacos en suero humano

Una plataforma de biosensores de microfluídica fue diseñada y fabricado utilizando la tecnología de fotoresistencia de película seca de bajo costo para la cuantificación rápida y sensible de diversos analitos. Este sistema de uso único permite la lectura electroquímica de sobre-chip-inmovilizado análisis enzima-ligado mediante la técnica de stop-flow.

Seca de la película basada en la fotoresistencia el Biosensor electroquímico de microfluidos plataforma: Fabricación de dispositivo, preparación del análisis de la en-viruta y el funcionamiento del sistema

Isoeléctrica capilar es una técnica basada en anticuerpos, ultrasensible, alto rendimiento, permitiendo la caracterización detallada de las proteínas y sus isoformas de muestras biológicas muy pequeñas. A continuación describe un protocolo para la detección y cuantificación de proteínas específicas y sus isoformas de manera automatizada y robotizada.

Detección altamente sensible y cuantitativa de las proteínas y sus isoformas por método capilar isoeléctrica

La biodetección de efectos de campo (FEB) es una técnica sin etiquetas para detectar interacciones biomoleculares. Mide la corriente eléctrica a través del biosensor de grafeno al que se inmovilizan los objetivos de unión. Se utilizó la tecnología FEB para evaluar las interacciones biomoleculares entre Hsp90 y Cdc37 y se detectó una fuerte interacción entre las dos proteínas.

Explorando la interacción biomolecular entre la chaperona molecular Hsp90 y su proteína quinasa cliente Cdc37 utilizando tecnología de biodetección de efecto de campo

Los métodos inmunoquímicos establecidos para medir los transmisores de péptidos in vivo se basan en la microdiálisis o la extracción de líquido a granel para obtener la muestra para su análisis fuera de línea. Sin embargo, estos sufren de limitaciones espaciotemporales. El presente protocolo describe la fabricación y aplicación de un biosensor de inmunosonda capacitiva que supera las limitaciones de las técnicas existentes.

Medición in vivo resuelta en el tiempo de la dinámica de neuropéptidos mediante inmunosonda capacitiva en corazón porcino

Aquí se presenta un protocolo para un nuevo ensayo funcional plaquetario multiparamétrico dinámico utilizando un biosensor capacitivo. Este enfoque, diseñado dentro de un microambiente semirrígido para mejorar la relevancia fisiológica, proporciona tres parámetros de salida sensibles al recuento de plaquetas, las fuerzas de estimulación y las vías de activación.

Evaluación dinámica multiparamétrica de la función plaquetaria mediante un biosensor capacitivo

Aprende a detectar biomarcadores de baja abundancia con alta sensibilidad utilizando un biosensor capacitivo basado en impresión molecular. Este método sin etiquetado permite el monitoreo en tiempo real para aplicaciones en biotecnología y diagnóstico médico.

Detección ultrasensible de biomarcadores utilizando una impresión Molecular basado Biosensor capacitiva

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