RNA-seq Análisis de transcriptomes en trombina tratamiento y de control pulmonar humana células endoteliales microvasculares

El objetivo general de este procedimiento es presentar un proceso completo y detallado para aplicar RNA-Seq, una poderosa tecnología de secuenciación de ADN de próxima generación para perfilar transcriptomas. Esto se logra primero aislando el ARN total de las células endoteliales microvasculares pulmonares humanas con o sin tratamiento con trombina y comprobando la calidad del ARN. El segundo paso es construir bibliotecas de ADN a partir de esas muestras de ARN.

Agilice la generación de clústeres utilizando el instrumento cbot y lleve a cabo la tarea de secuenciación de ADN en el HighSeq 1000. A continuación, se realiza un análisis de datos para identificar y mostrar las transcripciones génicas expresadas diferencialmente. El paso final es validar los resultados de RN aeq por RT, TP, CR. La principal ventaja de la CI sobre los métodos existentes, como una micromatriz de ADN para el análisis del transcriptoma, es que la CI puede perfilar un transcriptoma completo, proporcionar datos de tipo digital y no depender de ninguna genómica conocida de la expresión génica en las células.

Mientras que la medición del nivel de MRA es una herramienta útil para determinar cómo la transcripción de la maquinaria de la célula se ve afectada por señales externas o cómo las células difieren entre un estado de salud y un estado de enfermedad. En este protocolo, demostraremos el análisis de CI de transcriptomas en células Indo syn microvasculares pulmonares humanas tratadas con trobina y de control. Este protocolo se basa en nuestro estudio recientemente publicado en el que realizamos con éxito el primer análisis completo del transcriptoma de células endoteliales microvasculares pulmonares humanas tratadas con trombina utilizando RNA-Seq en el High SEQ 1000, una popular plataforma de secuenciación de ADN de próxima generación.

Utilizando el sistema VS seven R-T-P-C-R, el Dr. Denova demostrará el tratamiento con trombina de células pulmonares humanas, endoteliales microvasculares y el aislamiento de ARN de células totales. La Sra. Margaret Gibson demostrará el sistema Experian para verificar la calidad del ARN y la biblioteca de ADN, así como la generación de grupos en el cbot.

Y el Dr. Dimitri Gregor demostrará el análisis de datos para comenzar esta cultura de protocolo. Células endoteliales microvasculares de pulmón humano entre el 90 y el 100% de confluencia en seis placas de pocillos en EGM, dos medios con 5% de factores de crecimiento FBS y antibióticos. Cambie el medio a la inanición 30 minutos antes del tratamiento con trombina.

Después de 30 minutos, tratar las células con 0,05 unidades por mililitro, trombina, o dejar sin tratar como control. Incubar las células durante seis horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Después de un tratamiento de seis horas.

Aísle el ARN total de las células tratadas y de control utilizando el kit Nirvana de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Evalúe la calidad del ARN con un chip de ARN eucariota de detección estándar de Experian de acuerdo con el protocolo estándar de la estación de electroforesis automatizada de Experian. Por último, cuantificar el ARN utilizando un método espectrofotométrico estándar para la construcción de bibliotecas.

Utilice un microgramo de ARN total de alta calidad por muestra como material de partida para construir la biblioteca. Siga el protocolo estándar del fabricante. En este protocolo, se realizan dos rondas de selecciones de poli que contienen Mr.mRNA.

Para eliminar nuestro ARN y minimizar nuestra secuenciación de ARN, evalúe la calidad de las bibliotecas utilizando un chip Experian DNA one K. De acuerdo con el protocolo estándar de la estación de electroforesis automatizada de Experian. Cuantifique la biblioteca mediante la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real.

Abreviado Q-R-T-P-C-R como se describe en el protocolo escrito. Acompañando este video, ejecute el Q-R-T-P-C-R de acuerdo con el protocolo MM verde cibernético y calcule la concentración de existencias originales de cada biblioteca. Diluya las existencias de la biblioteca a 10 nanomolares y almacene a 20 grados centígrados.

Cuando esté listo para agrupar una celda de flujo, descongele la placa de reactivo cbot en un baño de agua. CBOT es un instrumento utilizado para agilizar el proceso de generación de clústeres. Después de lavar el instrumento cbot, desnaturalice las bibliotecas combinando primero 13 microlitros de un XTE y seis microlitros de 10 nanomolares.

Luego, al lado de cada tubo, agregue un microlitro de un hidróxido de sodio normal, haga girar los tubos y cocine a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, coloque las bibliotecas desnaturalizadas en hielo. A continuación, diluya las bibliotecas desnaturalizadas con tampón de hibridación preenfriado combinando 996 microlitros de tampón y 4,0 microlitros de biblioteca desnaturalizada para una concentración final de 12 picos molares.

Coloque las bibliotecas diluidas desnaturalizadas. A continuación, invierta cada fila de tubos de la placa cbot, asegurándose de que todos los reactivos estén descongelados. Después de girar la placa, retire el sello de aluminio de la fila de tubos de hidróxido de sodio y cárguelo en la alícuota del cbot.

120 microlitros de las bibliotecas desnaturalizadas diluidas en un tubo de tira etiquetado del uno al ocho. Agregue 1.2 microlitros de la biblioteca de control PHI X diluida y desnaturalizada en cada tubo como un pico en el control. Después de vórtice y girar por los tubos, cárguelos en el cbot en la orientación correcta con el tubo número uno a la derecha.

Cargue una celda de flujo y un colector en el cbot. Complete la comprobación de flujo y comience la ejecución de la agrupación en clústeres. Una vez completada la ejecución, compruebe la entrega de reactivos en todos los carriles.

Toma nota de cualquier anomalía. Inicie la ejecución de secuenciación inmediatamente o almacene la celda de flujo en el tubo provisto a cuatro grados centígrados. Para comenzar la secuenciación.

Descongelación de la secuenciación mediante reactivos de síntesis. Cargue los reactivos en los puntos apropiados de las bandejas de reactivos, asegurándose de no tocar los demás reactivos. Después de tocar la mezcla de escisión, utilizando una celda de flujo sin secuenciación, prepare las líneas de reactivos dos veces para limpiar a fondo la celda de flujo de secuenciación con un 70 % de etanol y toallitas Kim, seguidas de un 70 % de etanol y papel para lentes.

Inspeccione la celda de flujo en busca de rayas y vuelva a limpiarla si es necesario. Cargue la celda de flujo en el secuenciador y realice una verificación de flujo para asegurarse de que el sello entre los colectores y la celda de flujo esté hermético. Inicie la ejecución de secuenciación.

Evalúe las métricas de calidad a medida que estén disponibles durante la carrera Monitoree la intensidad a lo largo de la carrera. Después de completar 101 ciclos. Realice la química de respuesta para completar la segunda lectura.

El primer padre emparejado y los reactivos, y el segundo el búfer de incorporación de lectura. A continuación, cargue los reactivos, continúe con la secuenciación y ejecute la evaluación. En segundo lugar, lea la intensidad Q3 y otras métricas de calidad a medida que avanza la carrera.

Para comenzar el análisis de datos, utilice la última versión de cassava para convertir los archivos de llamada base en archivos FAST Q. Establecer el recuento rápido de clústeres Q en cero para garantizar la creación de un único archivo Q rápido. Para cada muestra, descomprima los archivos Q rápidos para el análisis posterior.

Realice el emparejamiento y la alineación utilizando la última versión de sombrero de copa, que alinea las lecturas de RNA-Seq con los genomas de tamaño de mamíferos utilizando las herramientas de lectura corta de ultra alto rendimiento y SAM, que implementa varias utilidades para las alineaciones posteriores al procesamiento en el formato SAM. El transcriptoma humano de referencia se puede descargar de I genomas en ejecución se utilizaron todas las configuraciones de parámetros predeterminadas, incluida la opción de tipo de biblioteca como fragmento no trenzado usando el programa cuff diff parte del paquete de software de gemelos. Compare las células tratadas con trombina con las células de control.

Descartar las transcripciones génicas expresadas diferencialmente en las células tratadas con trombina en función del transcriptoma de referencia humano. A continuación, utiliza una hoja de cálculo para visualizar el resultado en forma de tabla. En este caso, se utilizaron todos los ajustes de parámetros predeterminados y se filtraron las transcripciones de genes con FPKM inferior a 0,05 y p superior a 0,05 para detectar nuevas isoformas que corrieran gemelos sin una referencia.

Transcriptoma: compare los archivos de transcripción de la muestra con el genoma de referencia mediante la comparación de manguitos. Pruebe la expresión diferencial con diferencia de manguito utilizando los archivos de transcripción de trombina combinados como genoma de referencia para un análisis y los archivos de transcripción de control combinados como genoma de referencia para un segundo análisis, nuevamente, use una hoja de cálculo para visualizar el resultado en formato tabular. Al igual que antes, se filtraron las transcripciones de genes con FPKM menor que 0,05 y p mayor que 0,05.

Después de este paso, los investigadores pueden optar por cargar una lista de transcripciones recién reportadas en el sitio web del navegador del genoma de UC SC para verificar su validez mediante una inspección manual. Las listas de genes expresados diferencialmente también pueden someterse al análisis de la vía del ingenio para la caracterización de los genes y las vías afectadas por el tratamiento con trombina. En este paso, los investigadores pueden optar por utilizar cummerbund, un paquete R que está diseñado para ayudar y simplificar la tarea de analizar la salida de gemelos RN aeq para ayudar a administrar, visualizar e integrar todos los datos producidos por un análisis de diferencias de manguito.

A continuación, Q-R-T-P-C-R realiza primero la validación de los resultados de la calidad del ARN RN, realizando el aislamiento total del ARN de las células endoteliales microvasculares pulmonares humanas tratadas con trombina, la evaluación de la calidad del ARN y la cuantificación del ARN, como se demostró anteriormente en el vídeo. A continuación, genere ADN complementario a partir de un microgramo de ARN total de cada muestra con el sistema de síntesis de primera cadena rt siguiendo las instrucciones del fabricante. Por último, realice el análisis Q-R-T-P-C-R en un sistema de PCR en tiempo real VI a seven utilizando los nucleótidos diseñados bajo demanda del ensayo TAC MAN enumerados en el protocolo escrito que acompaña a este vídeo y mida la cuantificación como se describe allí.

La relación de 28 s a 18 s se utiliza tradicionalmente como indicador de la degradación del ARN Para cuantificar con mayor precisión la degradación, el sistema de experiencia calcula un indicador de calidad del ARN o un número RQI. El algoritmo RQI compara el electroferograma de las muestras de ARN con los datos de una serie de muestras de ARN degradado estandarizadas y devuelve automáticamente un número entre 10 y uno. La muestra de ARN debe tener un RQI de al menos siete e, idealmente, superior a ocho.

Estos resultados de Experian indican una muestra de ARN de alta calidad con un RQI de 8,4. Las bibliotecas deben tener una banda ancha de aproximadamente 250 a 300 pares de bases, como se muestra en esta figura de resultados de Experian para una biblioteca de alta calidad. Aquí se muestran los resultados Q-R-T-P-C-R de muestras de curva estándar y una muestra desconocida.

El progreso y la calidad de la secuencia deben observarse constantemente a lo largo de la ejecución. Esta figura muestra la densidad de conglomerados adecuada durante el primer paso de adquisición de imágenes del ciclo. Este es el primer indicio de la carrera.

Los clústeres de calidad deben ser brillantes y centrados. Se muestra un ejemplo del primer informe base generado después de completar el primer ciclo. Es importante evaluar los niveles estimados de intensidad de densidad de conglomerados y la calidad del enfoque en este punto.

Aquí se muestra el siguiente punto de control de calidad después del ciclo cuatro. Esto muestra la densidad absoluta del clúster para cada carril. La densidad del racimo no debe ser superior a 850 K por milímetro cuadrado después del ciclo 13.

Se calculan las estadísticas de fase y prefase. Los números típicos están entre 0,1 y 0,25. La mayor evaluación de la calidad es posible después del ciclo 24, cuando se calculan varias métricas de calidad.

El porcentaje de lecturas por encima del tercer trimestre es una medida de la confianza en la base. Llamar a una lectura con una puntuación Q de tres significa que hay una probabilidad entre 1000 de que la llamada base sea incorrecta. Las puntuaciones Q disminuirán a medida que avance la ejecución, pero deben comenzar con más del 95% de las lecturas que cumplan o superen la Q3. Los clústeres que pasan filter o pf son los clústeres de los que se tomarán los datos de secuencia reales.

Idealmente, esto debería estar por encima del 85%El clúster pf se basa en muchos factores, incluida la fase, la intensidad previa a la fase y Q3.It no cambiará a medida que avanza la ejecución. El porcentaje alineado es una medida de las lecturas que se alinean en tiempo real con el genoma FI x. Dado que se introdujo aproximadamente el 1%FI x en las bibliotecas de muestra, el porcentaje alineado debe estar entre 0,5 y uno.

Esta estadística muestra que el contenido de la biblioteca está bien representado por los conglomerados y no hubo sesgo en la generación de conglomerados, aquí se enumeran los genes expresados y las isoformas en las células endoteliales microvasculares pulmonares humanas tratadas con trombina. En particular, se han detectado alrededor de 26.000 nuevas isoformas, lo que ilustra la fuerza de RN aeq. Puede identificar ARN desconocidos.

Alternativamente, transcripciones empalmadas y uso de promotores alternativos, que no son detectables por técnicas de microarrays. RNA-Seq también puede medir las transcripciones menos abundantes que son inexactas, cuantificadas o no detectadas por microarrays para validar los resultados de RNA-Seq utilizando un enfoque alternativo. Se realizó el experimento A-Q-R-T-P-C-R para ensayar tres genes diferentes en los datos de RNA-Seq, uno de los cuales fue regulado al alza por 7,96 veces el auto.

Uno se reguló a la baja en 1,16 veces y se agradeció a dos se reguló a la baja en 1,70 veces en los datos Q-R-T-P-C-R, estos números correspondientes son más 7,25 veces menos 1,15 veces y menos 2,07 veces respectivamente. Los resultados de estos tres genes ensayados por RNA-Seq y Q-R-T-P-C-R concuerdan bien, lo que corrobora los resultados de RNA-Seq. Este protocolo es específico para la CI en un punto de tiempo de la microvascularización pulmonar humana tratada con trobina en las células mayores, pero podría adaptarse fácilmente a un estudio de punto de tiempo múltiple o estudios en otros tejidos celulares tratados con diferentes estímulos o inhibidores o a la comparación de transcriptomas en células o tejidos entre un estado sano y el estado de la enfermedad.

Si bien es específico del SQ 1000 alto, este protocolo es aplicable a cualquiera de la familia HighSeq o al analizador del genoma. Dos instrumentos con modificaciones menores de los pasos de generación de clústeres y reactivos de secuenciación. Otras plataformas de secuenciación de ADN de última generación, como la serie sólida.

Los sistemas GS, así como algunos sistemas más nuevos emergentes, también se emplean para el propósito de RNA-Seq. Aunque sus procedimientos de construcción y secuenciación de bibliotecas pueden ser ligeramente diferentes, las puntas de manejo de ARN, las porciones de análisis de datos y la validación por R-T-P-C-R presentadas en este protocolo pueden ser de valor de referencia para sus aplicaciones de RNA-Seq.